药用大黄茎叶中有效成分的分析与测定毕业论文.doc

陕西理工学院毕业论文毕业论文 论文题目 药用大黄茎叶中有效成分的分析与测定 毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。作 者 签 名： 日 期： 指导教师签名： 日期： 使用授权说明本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。作者签名： 日 期： 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名： 日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。涉密论文按学校规定处理。作者签名：日期： 年 月 日导师签名： 日期： 年 月 日注 意 事 项1.设计（论文）的内容包括：1）封面（按教务处制定的标准封面格式制作）2）原创性声明3）中文摘要（300字左右）、关键词4）外文摘要、关键词 5）目次页（附件不统一编入）6）论文主体部分：引言（或绪论）、正文、结论7）参考文献8）致谢9）附录（对论文支持必要时）2.论文字数要求：理工类设计（论文）正文字数不少于1万字（不包括图纸、程序清单等），文科类论文正文字数不少于1.2万字。3.附件包括：任务书、开题报告、外文译文、译文原文（复印件）。4.文字、图表要求：1）文字通顺，语言流畅，书写字迹工整，打印字体及大小符合要求，无错别字，不准请他人代写2）工程设计类题目的图纸，要求部分用尺规绘制，部分用计算机绘制，所有图纸应符合国家技术标准规范。图表整洁，布局合理，文字注释必须使用工程字书写，不准用徒手画3）毕业论文须用A4单面打印，论文50页以上的双面打印4）图表应绘制于无格子的页面上5）软件工程类课题应有程序清单，并提供电子文档5.装订顺序1）设计（论文）2）附件：按照任务书、开题报告、外文译文、译文原文（复印件）次序装订目录摘要IAbstractII1 文献综述 1 1.1 大黄简介1 1.2大黄有效成分1 1.2.1 大黄酸1 1.2.2 大黄素21.2.3 芦荟大黄素31.2.4大黄酚41.2.5大黄素甲醚4 1.3 大黄药理作用4 1.4 大黄有效成分的分析与测定51.4.1 大黄中有效成分的提取方法51.4.1大黄有效成分的分离及含量测定方法62 实验材料与方法7 2.1实验仪器与试剂7 2.1.1 实验仪器7 2.1.2 试剂7 2.1.3 色谱条件8 2.2实验方法82.2.1标准溶液的配制82.2.2样品的配制8 2.3实验数据分析讨论82.3.1线性关系考查92.3.2精密度实验92.3.3样品含量的测定92.3.4正交实验103 结论104 参考文献115 致谢 12 6 外文原文137 外文翻译 药用大黄茎叶中有效成分的分析与测定王兴伟（陕理工化工学院 化工专业1101班，陕西汉中 723001）指导老师：季晓晖 摘 要大黄主要成分为多种蒽醌类化合物。目前，大黄蒽醌的测定方法主要有电化学法、光度法和色谱法，而高效液相色谱是最快捷最有效的测定方法。本文采用了高效液相色谱法来测定大黄中大黄素、大黄酸这两种大黄蒽醌，相比传统液相色谱分析，该方法能准确简便的测定出大黄中的蒽醌类衍生物，大大节省了分析时间，为我国大黄科学研究提供一定的科学依据。 关键字 高效液相色谱法；大黄；大黄素；大黄酸I Analysis and determination of the active components of medicinal rhubarb stem and leaf(Grade11, Class 1, Chemical Engineering Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,Shaanxi)Tutor : Ji Xiaohui Abstract:The main ingredients of rhubarb were a variety of compounds of the kind of compound. At present, the deter- mination method of rhubarb is mainly electrochemical, spectrophotometry and chromatography, while HPLC is the most e- efficient and effective method for determination,The high performance liquid chromatography (HPLC) method to determine- emodin and rhein both rhubarb anthraquinone, compared to the traditional liquid chromatography analysis. The method cana- ccurate simple determination of rhubarb anthraquinone derivatives, saving a lot of time analysis, can provide some scientific basis for Rhubarb science research in our country. Keyword:HPLC Rhubarb emodin rhubarb acidII 1 文献综述1.1 大黄简介 大黄是多种蓼科（Poly gonaceae)大黄属（Rheum）的多年生植物的合称，也是中药材的名称。在中国地区的文献里，“大黄”指的往往是马蹄大黄，大黄栽培种主要为掌叶大黄（R.palmatum），次为唐古特大黄（R.palmatum var.tanguticum）和药用大黄（R.officinale）。本实验样品为药用大黄，又名南大黄，这种大黄是蓼科植物药用大黄，被我国药典1规定为中药大黄的原植物之一，主要产于陕西、四川、湖北、贵州、云南、河南等地，生于海拔1200-4000米山沟或林下，多有栽培，根状茎及根供药用。1.2 大黄有效成分大黄主要有效成分为蒽醌衍生物2，这些蒽醌衍生物以部分游离、大部分与葡萄糖结合成苷3的形式存在。游离型的苷元有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄酚等。结合状态的蒽苷是泻下的有效成分，主要包括蒽醌苷和双蒽酮苷，双蒽酮苷中有番泻苷A、B、C、D、E、F，是改泻的主要成分，此外，还有食用大黄苷，鞣质类物质没食子酰葡萄糖苷、没食子酸、d-儿茶素，以及有机酸和雌激素样物质。1.2.1大黄酸 大黄酸化学名为1,8-二羟基-3-羧基蒽醌，为咖啡色针晶，升华后为黄色针晶。熔点为321322。不溶于水，能溶于吡啶、碳酸氢钠水溶液，微溶于乙醇、苯、氨仿、乙醚和石油醚。药理药效：（1）抗肿瘤4活性 大黄酸对小鼠黑色素瘤、艾氏腹水癌、肝癌、乳腺癌、P388白血病细胞都有一定的抑制作用。腹腔注射大黄酸50g/kg、21天，对小鼠黑色素瘤抑制率为76%。对艾氏腹水癌抑制作用的IC50值为40g/kg，大黄酸对体肝癌和小鼠腹水肝癌抑制作用的机制之一是影响其线立体和微丝结构。（2）抗菌活性在1.525mg/mL深度，大黄酸对葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、枯草杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌等均有抑制作用。其作用之一是抑制线粒体呼吸链电子传递。大黄酸对金黄色葡萄球菌的核酸和蛋白质合成有较强的抑制作用，对无细胞系统DNA的生物合成也有抑制作用。（3）免疫抑制作用大黄酸能抑制生物体抗体产生，抑制碳粒廓清能力，减轻免疫器官的重量，降低白细胞数。（4）利尿作用大黄酸能使尿中钠、钾离子浓度升高，促进输尿管蠕动，增加尿量。（5）泻下作用大黄酸本身无泻下作用，其肠内菌转化产物大黄酸蒽酮有泻下活性，能够降低结肠对钠和氯离子的吸收，增加钾离子分泌。前列腺素在大黄酸蒽酮泻下活性上起到了重要作用。（6）抗炎作用大黄酸的1,8二乙酰化物已用于治疗骨关节炎。在肠道内，1,8二乙酰大黄酸的乙酰基可完全被水解掉，有效物质形式应为大黄酸。（7）治疗糖尿病肾病研究表明，大黄酸具有改善糖代谢异常，逆转胰岛素抵抗，有效防止糖尿病肾病的独到疗效及新的药效特点，是目前已知治疗糖尿病肾病药物所不具备的，并且安全性较好。研究人员对大黄酸进行了系统的体外和体内活性研究，发现大黄酸能够通过抑制细胞葡萄糖转运蛋白的功能，抑制细胞糖代谢己糖胺通路的活性，抑制内皮细胞PAI-1的表达，保护内皮细胞的功能，逆转胰岛素抵抗等发挥其治疗糖尿病肾病的作用，这些都是糖尿病肾病治疗中新的作用机制。其药效已在一系列动物模型，如1型糖尿病肾病（STZ大鼠模型，NOD小鼠模型）和2型糖尿病肾病（高糖高脂饮食模型，db/db小鼠模型5）模型中给予了验证。目前，国际上尚无类似的疗效如此独特的治疗糖尿病肾病的新药。大黄酸抗癌作用分子机制：大黄酸能有效抑制肺癌细胞A549的生长，通过四甲基偶氮唑盐比色法（MTT6法） 发现大黄酸抑制A549细胞的生长。凋亡实验7显示大黄酸处理的细胞明显呈现出染色质边缘化，出现凋亡小体，核固缩等凋亡形态，说明大黄酸能引起癌细胞的凋亡。通过配体竞争性实验，结果发现大黄酸可以竞争9-cis-RA和RXR结合。在更详细的分子机理研究中发现，9-cis-RA能减轻大黄酸对肺癌细胞的生长抑制。糜蛋白酶的酶切实验发现大黄酸与RXR结合能诱导RXR的构型变化。在转录水平上,报告基因实验得出大黄酸与RXR结合能分别抑制RXR同源二聚体、RXR/TR3和RXR/RAR异源二聚体的转录活性。研究结果表明,大黄酸的作用靶点是RXR，它对癌细胞的生长抑制作用和促进细胞凋亡的作用是通过抑制RXR的转录激活来实现的。大黄酸属于蒽醌类化合物，由于蒽醌类物质广泛存在于中草药，推测中草药中有一部分是通过影响RXR来行使作用的。目前国内已有单体大黄酸作为一类新药已被国家科技部列为“十五”国家重大科技专项，旨在确证临床疗效、体内和体外活性实验结果的基础上，按照国家药品监督管理局有关中药一类新药的要求，完成临床前研制工作，并在获得临床研究批文的基础上，完成临床研究和取得新药证书。在国外，大黄酸被用作合成关节炎良药双醋瑞因的原料。大黄酸是配制保健品的最佳原料，可降脂减肥、通便排毒，清洁内环境，预防胃癌，延缓衰老。1.2.2 大黄素大黄素又名朱砂莲甲素、泻素 ，化学名为1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌，为橙黄色长针状结晶(丙酮中结晶为橙色,甲醇中结晶为黄色)，熔点256257。具有蒽醌的特殊反应。几乎不溶于水，溶于乙醇及碱溶液。药理药效：（1）抗肿瘤活性的作用 大黄素对小鼠实体肉瘤S-180，小鼠肝癌、乳腺癌、艾氏腹水癌、淋巴肉瘤、黑色素瘤和大鼠瓦克瘤及肺癌A-549均有抑制作用8，其抑制率在30%以上。在50mg/kg每日剂量下对小鼠黑色素瘤生长的抑制率为73%；在75mg/kg每日剂量下对小鼠乳腺癌的抑制率为45%。大黄素可延长P388白血病小鼠的存活期，延长率在40%以上，其作用机制之一是抑制癌细胞的DNA、RNA和蛋白质的生物合成，抑制癌细胞的氧化脱氢。（2）抗微生物生长作用 大黄素对金黄色葡萄球菌209P、链球菌、白喉杆菌、枯草杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、流感杆菌、肺炎球菌、卡他球菌等均有抑制作用；对临床常见厌氧性细菌有较强的抑制作用；其MIC略高于甲硝唑，在8g/mL浓度能使76%91%的厌氧菌生长受抑。大黄素抗菌作用机制与抑制线粒体呼吸链电子传递、抑制呼吸与氨基酸、糖和蛋白质代谢中间产物的氧化和脱氢等有关，抑制核酸和蛋白质合成的最终结果，使细菌生长受抑。（3）免疫抑制作用 按70mg/kg剂量给大鼠腹腔注射大黄素，能够抑制大鼠抗体产生、抑制碳粒廓清能力、减轻免疫器官的重、降低白细胞数、降低腹腔巨噬细胞的吞噬功能。体外在10mg/mL浓度对3H-TdR和3H-Urd参入淋巴细胞有明显的抑制作用。（4）解痉、止咳作用 大黄素对乙酰胆碱所致离体大鼠肠管的痉挛有很强的抑制作用，约为罂栗碱的4倍。大黄素还有明显的止咳作用。（5）对心血管系统的作用 大黄素在小剂量对离体蟾蜍心脏有兴奋作用，而大剂量则有抑制作用。大黄素还有降压作用。（6）利尿作用 大黄素可使尿中钠和钾含量增加，促进输尿管蠕动，增加尿量。（7）泻下作用 大黄素可抑制钠和钾离子从肠腔转运至细胞，使水分滞留在肠腔内，刺激大肠，促进其蠕动，从而起到泻下作用，但作用较弱。 大黄素有泻下活性，由于在体内易被氧化，实际泻下作用很弱，如与糖结合成苷类，则可发挥泻下作用。大黄素除游离存在外，尚以还原状态（如蒽酚、蒽酮的衍生物）或与糖结合成苷类存在。例如，在新鲜植物中发现的大黄素蒽酚或大黄素蒽酮（熔点250258），都是大黄素的还原产物，如经长时间贮存，往往被氧化成蒽醌类。大黄素-1-O-D-葡萄糖苷的熔点为189190；大黄素-8-O-D-葡萄糖苷的熔点为239241，二者都是大黄素与葡萄糖结合的苷，同时存在于大黄中。前者也是虎杖中有抑菌作用的活性成分之一。目前大黄素还应用于饲料（鱼、虾），主要作为诱食剂使用，提高鱼、虾吃食率，以促进生长。临床应用口服大黄素在肠内易于吸收，23小时后血中即达最高浓度，以后慢慢下降，尿及胆汁在服药后48小时即达高峰，由尿排出可持续2天，在体内的分布以肝肾为最多。亦有人把它制成注射剂，用于肌肉和静脉注射。大黄素被吸收后，由肾排出大黄酚，它能使酸性尿变成棕黄色，使碱性尿变成紫红色。在临床上，用大黄素纯品治疗肿癌，主要用于白血病、胃癌等肿瘤，而最常用的则用于抑菌。它对很多细菌如各种葡萄球菌、溶血性链球菌、白喉杆菌、霍乱孤菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、皮肤真菌、枯草杆菌、草分枝杆菌、淋球菌、炭宜杆菌、草状菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌等均有抑制作用，其中对葡萄球菌、淋球菌、链球菌更为有效。本品对真菌、病毒、原虫也有效。同时，还具有利尿、利胆、解痉、降低血压抑制免疫功能等作用。近代临床几乎各科都用，如治疗乙型脑炎与腮腺炎、伤寒、痢疾、尿路感染、淋病、肺炎、蜂窝组织炎、化脓性皮肤病、中耳炎、脉管炎等，和其他药物配伍治疗急性及亚急性阑尾炎、烧伤、小儿麻痹、湿疹及若干真菌引起的皮肤感染，另外可治疗肝炎、蛲虫、口腔炎、口唇溃疡、消化不良、高血压和动脉硬化等，因此，大黄素在临床上应用极广。最新资料表明：大黄素可以影响角朊细胞体外增殖；可预防冠脉介入性治疗后再狭窄，可抑制人肾成纤维细胞。大黄素虽然毒性小，但孕妇禁用，因为它可能导致孕妇流产。 大黄素的生理活性决定它不仅可用于医疗，亦可以用于保健和日用化工品中，如有人把它用于护发和护肤品中，亦有人把它编入天然色素中去，国外，人们把它也作为轻泻剂。1.2.3 芦荟大黄素 芦荟大黄素化学名为1,8-二羟基-3-羟甲基蒽醌，为橙色针状结晶(甲苯), 或土黄色结晶粉末。 熔点223224，易升华。可溶于乙醛、苯、热乙醇、稀氨水、碳酸钠和氢氧化钠水溶液，易溶于热乙醇。在乙醚及苯中呈黄色, 氨水及硫酸中呈绯红色。芦荟大黄素有很多药理药效：（1）抗肿瘤活性 芦荟大黄素对P388白血病细胞有抑制作用，延长生存期。其作用机制之一是抑制癌细胞的DNA、RNA和蛋白质的生物合成。（2）抗菌活性 在1.525mg/ml浓度，芦荟大黄素对葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、枯草杆菌、炭疽、副伤寒杆菌、痢疾杆菌等均有抑制作用，其中对葡萄球菌和链球菌最敏感，抑菌的有效浓度为1525ug/mL。对金黄色葡萄球菌209P、大肠杆菌、福氏痢疾杆菌在体外抑菌浓度分别为7.5mg/L、600mgL 其抗菌作用均为抑菌而非杀菌。其作用机制之一是抑制线粒体呼吸链电子传递。芦荟大黄素对金黄色葡萄球菌的核酸和蛋白质合成有较强的抑制作用。芦荟大黄素对临床常见厌氧性细菌有较强的抑制作用，其中对常见脆弱杆菌能抑制90100菌株生长,其MIC略高于甲硝唑。在8g/mL浓度能使76%91% 的厌氧菌受抑。（3）免疫抑制作用 芦荟大黄素能抑制生物体抗体产生，抑制碳粒廓清能力，减轻免疫器官的重量，降低白细胞数，降低腹腔巨噬细胞功能。体外在100g/mL浓度对3HTDR和3HUrd参入淋巴细胞有明显的抑制作用。（4）泻下作用 芦荟大黄素有较强的泻下活性，肠内菌代谢芦荟大黄素 ，大黄酸，大黄酸蒽酮，后者有较强的泻下作用。临床上用作泻药，具有增进食欲和大肠缓泻作用。 据国外医学报导，芦荟甙是在人体内寄生菌作用下，水解为芦荟大黄素，这种芦荟大黄素，刺激肠壁蠕动，同时由于渗透压改变，有利于肠道内废物排除，从而达到刺激性缓泻，这种刺激泻下作用对便秘和痔疮有特殊疗效。特别是对中老年性便秘，治疗效果更明显. 芦荟大黄素现在代应用中主要在医药化工中间体、保健食品添加剂、化妆品原料及护发原料等。1.2.4 大黄酚 大黄酚为六方形或单斜形结晶(乙醇或苯),熔点为196，几乎不溶于水， 略微溶于冷醇，易溶于沸乙醇，溶于苯、氯仿、乙醚、冰醋酸及丙酮等，极微溶于石油醚。大黄酚具有较明显的止咳作用，对甲型链球菌、肺炎球菌、流感杆菌及卡他球菌有不同程度的抑制作用。能促进肠管的动物,并能促使神经兴奋和肌肉麻痹。口服或皮下注射, 均有明显缩短血液凝固时间的作用。大鼠试验证明, 大黄酚有利尿作用。1.2.5 大黄素甲醚 大黄素甲醚又名朱砂莲乙素、非斯酮，金黄色针状结晶，熔点为203207,几乎不溶于水，微溶于冷乙醇，易溶于沸乙醇，溶于苯、氯仿、 乙醚、丙酮、冰醋酸、氢氧化钠及热碳酸钠溶液，极微溶于石油醚。大黄素甲醚对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌和痢疾杆菌等26种细菌均有抑制作用；在沙门氏菌TA1535试验有突变作用；对人体宫颈癌Hela细胞生长抑制作用较强。大黄素甲醚是高活性植物源杀菌剂，以天然植物大黄为原料，经精心提取其活性成分，加工研制而成，对白粉病、霜霉病、灰霉病、炭疽病等有很好的防治效果，对人畜低毒，对环境友好，特别适合于绿色和有机蔬菜生产。大黄素甲醚是保护性杀菌剂，诱导作物产生保卫反应，抑制病原菌孢子萌发、菌丝的生长、吸器的形成，使得作物免受病原菌的侵害，达到防病的效果。1.3 大黄药理作用 大黄是我国的四大中药之一，又名火参、金木、破门、绵纹等。在我国传统医学中应用已久，始载于我国现存最早的药学专著神农本草经，因其色黄，故名。大黄性味苦寒，药性峻烈，素有“将军”之称。历代本草均有收载：千金方称大黄为锦文大黄；吴普本草称大黄为黄良；李当之药录称其为将军；而中药材手册则称之为川军，藏语叫“君木扎”。它有许多药理作用。（1） 泻下作用 大黄泻下作用确切，大黄泻下的有效成分为蒽醌类和二蒽酮类以及它们的苷类，而主要泻下成分为二蒽酮类化合物番泻苷，但现代研究还表明，大黄中还存在其它一些未知的泻下成分。大黄的泻下成分能排泄于乳汁中。因此体弱虚弱者或妇女胎前产后均应慎用。（2） 抗菌作用 实验证明，大黄对多种细菌有不同程度的抑制作用，其中对葡萄球菌、链球菌最敏感，对白喉杆菌、枯草杆菌、伤寒、副伤寒杆菌以及痢疾杆菌等也较敏感。其抑菌的有效成分为蒽醌衍生物，其中大黄酸、大黄素、芦荟大黄素的作用最强。大黄抗病毒作用也很广泛，其抗单纯疱疹病毒的作用，主要通过抑制病毒的吸附和穿入过程而阻止病毒的复制。（3） 抗炎作用 大黄能清除组织和血浆内的炎性介质，显著降低危重症患者血清中肿瘤坏死因子、白细胞介素和内毒素水平。郭昌燕等应用富含脂质过氧化物丙二醛(MDA)的鼠肝与中药大黄孵育，观察大黄对MDA的影响。结果表明，大黄对MDA呈明显抑制作用，且抑制作用有明显的量效关系。临床应用大黄可以抑制MDA生成，减轻组织器官损伤，防止病情恶化。（4） 保肝利胆作用 Arosio等发现，芦荟大黄素对CCL所致的小鼠急性肝损害有保护作用，不仅能阻止肝细胞的死亡，而且对脂质过氧化引起的炎症反应也有保护作用。大黄不仅可以增加胆汁流量，而且能促进排胆，松弛奥狄括约肌。同时大黄还能使胆红素和胆汁酸的含量增加。临床上用的胆道排石汤中大黄是主药之一。（5） 对胰腺分泌及其消化酶的影响 大黄对TNF-(肿瘤坏死因子)作用下的胰腺组织具有保护作用。可提高相应了NF-Or浓度下的胰腺细胞的细胞存活率。大黄还能促进胰液分泌，在模拟胃肠道条件下，对胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶的活性均有明显的抑制作用，但对胃蛋白酶无影响。中医认为的大黄苦寒伤胃，与其影响消化酶有关。（6） 对胃和十二指肠的影响 大黄对大鼠应激性及幽门结扎性胃溃疡均有治疗和防止出血作用，作用类似于甲氰咪呱。大黄对低血容量性和内毒素性休克动物胃肠黏膜有显著保护作用。对危重症患者胃肠功能衰竭也有防治作用。（7）止血作用 各种动物实验证明，大黄能缩短凝血时间，降低毛细血管通透性。改善血管脆性，使纤维蛋白原增加，降低抗凝血酶的活性，使血管收缩活动增加，促进骨體制造血小板因而促进血液凝固。大黄还可以影响微循环促进局部止血。止血有效成分是大黄酚、大黄素甲醚及没食子酸等。也有报道，大黄对正常人的凝血功能无明显的影响。（8） 隆血脂作用 大黄可使蛋黄及高脂饲料诱导的高脂血症的小鼠血清及肝脏胆固醇、甘油三酯和过氧化脂质明显降低，其有效成分可能是蒽醌类、儿茶素类及多糠。（9） 抗肿瘤作用 大黄的抗瘤谱较广。有报道称大黄抗肿瘤作用主要是通过抑制肿瘤细胞的增生、促进细胞凋亡、抑制细胞色素P450lAl(CYPlAl)和抗突变作用，以及抑制N-乙酰转移酶的活性实现的。大黄儿茶素、大黄素、大黄酸都是大黄抗肿瘤的有效成分。（10） 免疫抑制作用 大黄能抑制红细胞抗体的产生。并有抑制活性T细胞的作用，能增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，大黄素对钙离子的作用呈剂量依赖性，有利于对免疫细胞的调节。（11） 对泌尿系统的影响 大黄素能抑制肾小管细胞、肾小球系膜细胞的增殖。另外，大黄酸可以抑制糖尿病大鼠肾脏高代谢，明显减少尿蛋白，并可抑制高糖培养条件下肾小球系膜细胞的增殖及细胞外基质的合成，可以逆转7GF-p(转化生长因子p)诱导的近端肾小管上皮细胞肥大和TGF-1所致的系膜细胞I型葡萄糖转运蛋白的高表达以及系膜细胞糖摄人的增加也有显著抑制作用。（12） 抗衰老 大黄在抗衰老方面有很大的药用价值。实验表明，大黄制剂在促进老年人记忆功能及缩短大便间隔时间上均明显优于对照组。同时对D-半乳糖所致小鼠亚急性衰老模型记忆减退有较好的改善作用，还能明显延长果蝇的平均寿命和最高寿命。增加2-3月龄小鼠游泳能力和耐缺氧能力。（13） 毒性作用 生大黄，尤其是鲜大黄服用过量可引起恶心、呕吐、腹痛、头晕。大黄蒽醌类具有肝毒性，大鼠服用3-9月，可出现肝组织进行性变化及甲状腺瘤。还可引起性腺退化及萎缩，使妊娠大鼠死胎率增加，胎仔体重受抑制，但未见胎仔畸形，孕妇慎用。1.4 大黄有效成分的分析与测定1.4.1 大黄中有效成分的提取方法 有效成分的量的多少， 与提取方法有很大关系。大黄中有效成分的提取方法主要有溶剂提取法、超声提取法和超临界萃取法。（1）溶剂提取法 溶剂提取法一般指从中草药中提取有效部位的方法，此法依据中草药中各组分在溶剂中溶解度的不同， 从而选用适当的溶剂把各组分分别提取出来。溶剂提取法提取大黄是将大黄样品用适当溶剂于索氏提取器中回流提取至无色， 减压除去溶剂后进行氧化、水解、用氯仿等有机溶剂多次提取经处理后所生成的全部蒽醌甙元， 然后进行分离以及含量测定。提取率受溶剂种类、浓度、浸泡及浸泡时的温度、煎煮时间、煎沸时间等因素的影响。所用溶剂多以水和乙醇为主， 提取方法分为冷浸法和热提法。（2）超声提取法 超声萃取法是利用超声波力学产生的空化作用、机械效应、热效应等加速细胞内有效物质的释放、扩散和溶解，显著提高提取效率的方法。当大量的超声波微作用于介质时介质会被撕裂成多个小空穴，这些空穴瞬间闭合会产生高达几千个大气压的瞬间压力，压力将植物组织中细胞破裂瞬间完成以利于溶剂浸透到植物细胞内部，使细胞中的有效成分溶于溶剂中。超声提取法所用时间短，对蒽类成分没有破坏作用，能显著的提高提取效率。（3）超临界萃取法 超临界流体萃取分离过程的原理是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的，借助于处于超临界条件下的流体所具有的高溶解性，使天然植物中的许多成分溶解在超临界流体中，操作过程中采用降压的方法，将溶解到超临界流体中的溶质“脱溶”，从而达到分离的目的。纪松岗10等人采用超临界萃取对大黄样品进行了分离，研究了萃取温度、萃取压力和改性剂量对萃取效率的影响。苟奎斌11等人把超临界萃取法用于首乌喘息灵胶囊中大黄素的定量测定中，用正交实验法优选超临界萃取工艺，并用反相高效液相色谱法进行了测定，结果快速、准确而且效率较高。超临界流体萃取是近代分离领域出现的新技术，具有萃取效率高、环境污染小、萃取溶剂便于挥发、提取物较为“干净”、省时、操作条件易于改变等特点。 除上述三种主要方法外，还有通过吸附脱附法12提取分离大黄蒽醌甙成分的研究报道。随着科学技术的进步以及新仪器及新方法的出现对大黄有效成分的提取方法将会不断增加，效果会越来越好。 1.4.2 大黄有效成分的分离及含量测定方法 大黄中有效成分的分离测定常用方法有如下：（1）纸色谱法 纸色谱法又叫纸层析法，它适用于一些精度不高的分析，苏学良13等人用纸层法研究了蒽醌衍生物的纸上层析取得了一定的进展，由于纸色谱法分离效率较低，所以逐渐被其它层析方法所代替。（2） 柱色谱法 柱色谱法又称柱层析，固定相装于柱内，流动相为液体，样品沿竖直方向由上而下移动而达到分离的色谱法。大黄酚和大黄素甲醚结构相似，极性相近，用一般层析方法很难分离，李军林14等人用柱层硅胶，石油醚作洗脱剂制备性分离出大黄素甲醚和大黄酚，并与纤维素柱层析进行了比较。孙阳15等人用硅胶H常压柱，石油醚2乙酸乙酯作洗脱剂高效的分离出大黄素甲醚和大黄酚。柱色谱的主要优点是相对的低成本和可处理的固定相，后者可以避免重复利用的交叉污染和固定相的分解。（3） 薄层色谱法 薄层色谱法（TLC)是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使移动相（溶剂）在流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的，此法在大黄的分离中是一种常用的层析方法。吸附剂载体最常用的是硅胶G、硅胶GF、硅胶H，其次有硅藻土、氧化铝和聚酰胺等。汪宝琪16等人用硅胶GF，以石油醚:二甲苯:甲苯:甲醇为展开剂成功分离出了大黄素和大黄酚，并且以甲苯:丙酮:水作为大黄酸展开剂展开，对三种成分用B2环糊精单分子胶束荧光法进行了测定。何丽一17等在硅胶G 薄层上用四种不同展开剂分离了大黄中大黄酚、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素及大黄素甲醚这五种蒽醌甙元。（4）高效液相色谱法 高效液相色谱法简称HPLC，根据分离原理的不同又可分为液-液色谱法、液-固色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法、离子色谱法、空间排阻色谱法，日本学者18报道用Sen shu Pak SS21251N柱，以15%乙酸2四氢呋喃进行梯度洗脱，用UV 2361nm 检测，在70min内分离了大黄中蒽醌衍生物、葡萄糖甙类和番泻甙类共13 种化合物。袁萍、周东斌19等人用高速逆流色谱法成功的分离并测定出了大黄中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚和芦荟大黄素这五种蒽醌衍生物的含量。毛平20等人用反相高效液相色谱法对糖尿灵中成药中大黄酸的含量进行了测定。Liu 等21人把计算机辅助软件Dry Lab运用于反相高效液相色谱分离大黄中五种羟基蒽醌衍生物的实验中，成功模拟出了五种化合物保留时间与梯度洗脱条件之间的模型，并优化出分离测定的最佳条件，在此条件下通过对两种不同产地的大黄样品的测定，成功找出了萃取效率最高的样品制备方法。我们可以把这一计算机模拟方法广泛地用于到其它中草药的分离分析中。 与上面的3种方法相比高效液相色谱法具有高压、高效、高灵敏度、应运范围广、分析速度快、载液流速快的特点，高效液相色谱法是在中药有效成分分析中用的最多也是比较成熟的方法。（5）高效毛细管电泳法 高效毛细管电泳法简称HPCE，是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分离方法。这项方法为近年来发展最快的一种分离分析技术，具有分离效率高、分析速度快和样品用量少等特点，尤其适用于药味较多、化学成分较复杂的中药复方化学成分的分析。国内宗玉英等22人建立了利用胶束电动毛细管色谱法分离和测定大黄中大黄素、芦荟大黄素和大黄酸含量的方法。Sheu等23人用毛细管电泳法不但成功分离出上述三种蒽醌甙元，而且还分离出了番泻甙A 与番泻甙B。Ji24等人用胶束电动毛细管色谱法，在H3BO 32NaOH (SDC)缓冲溶液中成功地分离并测定出了大黄及牛黄解毒片中的大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酚这五种成分。Li25 等人用微乳胶束电动毛细管色谱法，用磷酸盐的缓冲溶液也分离出大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酚。纪松岗10等人采用超临界流体萃取胶束电动毛细管色谱法分离测定了大黄中的芦荟大黄素、大黄素和大黄酸，被测组分在10min内全部分离，这种方法准确、简便、快速、结果也比较准确。黎艳26等人利用毛细管电色谱法也成功分离出大黄中大黄素、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚这四种有效成分。与高效液相色谱相比较，毛细管电泳法具有高效、快速、溶剂消耗少、抗污染能力强等优点，所以高效毛细管电泳在天然植物及中草药的分离测定中的应用范围越来越宽阔。2 实验材料与方法2.1 实验仪器与试剂2.1.1 实验仪器 高窗体顶端 Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）色谱柱4.6250mm，5m基本系统包括快速高分离液相系统、二元液相系统、四元液相系统、单元液相系统、纯化系统、HPLC-Chip/MS 系统、纳流液相系统、毛细液相系统，检测分为二极管阵列检测器SL、荧光柱检测器、多波长检测器 SL、示差折光检测器、可变波长检测器、多波长检测器SL， DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验有限公司），电热恒温水浴锅(北京科伟兴汉有限公司)，电热套（北京科伟永兴仪器有限公司），AL204-IC型电子天平(日本AND)，FW177型中草药粉碎机(津泰斯特仪器有限公司）2.1.2 试剂 大黄素标准品（购于上海源叶生物科技有限公司，纯度98）。甲醇：色谱纯 氯仿 两种大黄分别购于汉中镇巴县清水白河两地2.1.3 色谱条件 色谱柱：应用Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6250mm，5m），流动相为1%磷酸-99%甲醇，流速为1.0mL/min，进样体积为10g，柱温为30，检测波长为254nm。（1）流动相的选择 本次研究选择大黄素为分析对象，这种大黄蒽醌类化合物均为极性化合物，固选择以甲醇为流动相，用微柱高效液相色谱进行分离。为了避免脱尾现象，所以在流动相中加入少量0.1%的磷酸调节，来抑制分析物的离解。实验表明：随着磷酸体积的增加各组分的保留时间也增加，但对分离度的影响不大。因此选择甲醇:0.1%磷酸(80:20)作为流动相。（2） 波长的选择 大黄中的蒽醌成分多属于大黄素型和茜草素型27，这两类蒽醌衍生物主要为三取代和四取代蒽醌28，研究表明用254nm为检测波长时曲线关系良好，因此选择波长为254nm，考虑到分析速度和分离度，流动相的流速为1.0L/min。 综合以上条件，本次试验选定的条件为色谱柱：应用EclipseXDB-C18色谱柱（4.6250mm，5m）流动相选择甲醇:0.1%磷酸比为80:20，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，进样体积10L，柱温为30。2.2 实验方法2.2.1标准溶液的配置 准确称取大黄素标准品5.0mg，以色谱纯甲醇溶解定容至50mL的浓度分别为100g/mL的标准品储备液，进样前以纯甲醇稀释并用0.22针头过滤器过滤。2.2.2样品的配置 在605下干燥恒重并将大黄样品粉碎后过200目筛，准确称取1g并加入50mL分析纯氯仿加热回流120min，冷却，蒸干氯仿，用20%硫酸溶解残渣，以色谱纯甲醇定容至50mL，用0.22针头过滤器过滤，即制得样品试液。2.3 实验数据分析讨论 在选定条件下，用所配置的大黄素标准品进行液相色谱，所得色谱图如图1所示，由图可见大黄素在 6.5 min时达到了分离，随后的样品分析结果也表明所测定样品中各组分在此条件下均能实现良好分离，可以满足实际样品测定的需要。图1 大黄素对照品液相色谱图图2 大黄样品1液相色谱图图3 大黄样品2液相色谱图2.3.1 线性关系考察 精密吸取混合标准品对照液5、10、15、20按上述色谱条件进行液相色谱测定峰面积（Y），以峰面积分别对各进液量(X)回归，绘制标准曲线，得回归方程：大黄素 A=3.3009100C+14.298 R=0.9372 A表示峰面积 C表示各组分浓度（L/mL）2.3.2 精密度试验精密吸取上述对照品溶液10微升，重复进样5次，计算大黄素的峰面积平均值和RSD见表1 表1名称大黄素峰面积平均值78.3836RSD1.9% 2.3.3 样品含量的测定表2 样品中大黄素测定结果样品类型 产地 大黄素 含量 RSD 大黄 清水 9.02 1.23 白河 9.74 1.54 2.3.4 正交实验：以回流时间（A）、溶剂用量（B）和溶剂（C）为考查因素进行正交实验，实验条件如下表表3序号条件A/hB/mLC/氯仿:乙醇10.51001:021801:132501:2 表4 氯仿和乙醇混合溶剂提取结果分析A/hB/mL氯仿:乙醇大黄素/g10.5501:29.33120.5801:19.32730.51001:09.32241501:09.32451801:29.422611001:19.34172501:19.45682801:09.238921001:29.721 由表4可得最佳条件为A（2h）B(100) C(氯仿比乙醇1:2)，在此条件下大黄素的分离效果最好3 结论通过查阅资料，本文建立了一个通过高效液相色谱法同时测定药用大黄中大黄素的方法，通过实际样品的测定得出大黄素在6.5min时得到分离，与参考资料比较，实验结果比较接近，得到了预期的效果，验证了此方法的可行性。此方法具有快速、简单、灵敏度高等优点，可大黄中有效成分的分析与测定提供一定的参考价值。参考文献1 中华人民共和国药典 M .二部.北京:化学工业出版社, 2005:附录181- 182.2 陈发奎主编.常用中草药有效成分含量测定 M .北京:人民卫生出版社1997:28-51.3 张丹,蒋心惠.反相高效液相色谱法测定大黄药材中游离及结合型蒽醌衍生物的含量J.分析化学,31(4):459-462.4 倪弘,薛小平,杨秀竹. 大黄酸抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎性介质活化的作用机理J.天津中医,2001,(01):35-36.5 杜宏,邵加庆,顾萍. 大黄酸治疗对db/db小鼠第1相胰岛素分泌的影响J.中国中药杂志,2010,(20):2764-2767.6 禹莉,凌云志,顺铂.对肝癌细胞株HepG2增殖和SATB