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动物微生物及免疫学(实践教学) 开题报告 病猪肝脏中大肠杆菌与沙门氏杆菌的分离鉴定 班 级： 动物医学2009-1 联系方式： 1528352XXXX 指导教师： XXX 时 间： 2011-6-20 动物微生物及免疫学(实践教学) 开题报告组长XXX成员XXX XXX班级动医2009-1课题名称病猪肝脏中大肠杆菌与沙门氏杆菌的分离鉴定联系电话1528352XXXX电子邮箱XXXXXXXXXXXX163.com立题依据大肠杆菌（E.coli）和沙门氏菌(Salmonella)同属肠杆菌科，分别为埃希氏菌属和沙门氏菌属的代表菌。大肠杆菌为革兰氏阴性的直杆菌，两端成对，散在或成对，大多数以周生鞭毛运动。碱性染料对本菌有良好的染色，菌体两端偶尔略深染。兼性厌氧。在琼脂培养基上生长24h后，形成圆形凸起、光滑、润湿、半透明、灰白色菌落;麦康凯琼脂上形成红色菌落；在伊红美蓝琼脂上产生黑色带金属闪光的菌落在SS琼脂上一般不生长或生长较差，生长着呈红色。本菌能够发酵多重碳酸化合物产酸产气。大多数菌能够迅速发酵乳糖。大肠杆菌可分为致病性大肠杆菌和非致病性大肠杆菌两类。其血清型比较多：而沙门氏菌作为一种重要的生化特性和抗原结构相似的人畜共患的肠道病原菌。迄今为止已经发现了2523个血清型。沙门氏菌革兰氏阴性，兼性厌氧。通常都以周生鞭毛运动。绝大多数发酵葡萄糖产酸产气。在三塘铁（TSI）上产生硫化氢。在肠道杆菌选择或鉴别培养基上，大多数菌因为不发酵乳糖而呈无色菌落。麦康凯琼脂上典型菌落呈透明、无色，有时带有暗色中心。绝大多数沙门氏菌对人和动物有致病性，能引起人和动物多种临床表现的沙门氏菌病，并未人类食物中毒的主要病原之一。根据两种菌在肠道杆菌分离鉴定培养基上的生长特征，本次实验我们将以病猪肝为菌源设计实验对两者进行分离培养，再利用生化实验进一步鉴定。实验目的病猪肝中的大肠杆菌和沙门氏杆菌的分离培养及鉴定实验用品一、器械：显微镜，载玻片，擦镜纸，高压蒸汽灭菌器，恒温箱，电炉，天平，酒精灯，量筒，烧杯，玻璃棒，三角瓶，漏斗，培养皿，试管，接种环，胶头滴管，PH试纸，纱布，试管塞，扎绳，火柴，吸水纸，无菌操作台等。二、药品材料：病猪肝脏，各种培养基制备所需化学药品，革兰氏染色化学药品，显微镜油镜用油和擦镜的二甲苯试液三、培养基及制备1、普通琼脂培养基的制备称取：牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，蛋白胨10g，蒸馏水1000ml称重，加热煮沸，补水，调节PH值7.47.6，分装入三角瓶包装，灭菌。待适宜温度（5060）后，倒入平皿，每平皿1015ml，将皿盖盖上。并将培养皿于桌面上轻轻旋转，使培养基平铺于皿底，制成普通琼脂平板。2、麦康凯琼脂培养基的制备称取：NaCl 0.5g，琼脂2.53.0g，蛋白胨2g，乳糖1g，胆盐0.5g，1%中性红水溶液0.5ml，蒸馏水1000。除中性红水溶液外，其余各成分混合于锅内加热溶解，调节PH7.07.2，煮沸，以脱脂棉花过滤。加入中性红水溶液摇匀。121灭菌15min，待冷却50时，倾成平板。等平板内培养基充分凝固后，置温箱内烘干表面水分。实验用品1g，氯化钠5g，硫代硫酸钠0.3g，琼脂12g，0.4%酚红水溶液6.3ml，水1000ml。以上成分置于水中煮沸溶解，调节PH7.4，分装直径15mm的试管，每管10ml，在121中灭菌10min.趁热做成底层部分约2.5cm高的高层斜面3、三糖铁培养基的制备称取牛肉浸膏3g，蛋白胨20g，枸橼酸铁0.3g，乳糖10g，蔗糖10g，酵母膏3g，葡萄糖1g，氯化钠5g，硫代硫酸钠0.3g，琼脂12g，0.4%酚红水溶液6.3ml，水1000ml。以上成分置于水中煮沸溶解，调节PH7.4，分装直径15mm的试管，每管10ml，在121中灭菌10min.趁热做成底层部分约2.5cm高的高层斜面。4、尿素琼脂培养基制备基础成分：蛋白胨 1g、氯化钠 5g、葡萄糖 1g、磷酸二氢钾2g、酚红溶液0.012g、琼脂15g、蒸馏水900ml浓尿素：尿素20g、蒸馏水100ml、调整pH值至6.86.9。过滤除菌方法：溶解15g琼脂与水内，加入其他成分，121高压灭菌15分钟。冷至5060，再加100ml浓尿素。混匀后，分装灭菌试管内。培养基做成斜面或高层。方法和步骤1、肝组织取样,然后用小刀在组织上划一小口2、将接种环伸入肝组织小口内接触取样，再接种到两个麦康凯平板，37培养24h。3、疑似菌落筛选：分A、B两组培养1)A组准备三糖铁和普通琼脂斜面，分别挑去疑似大肠杆菌菌落3-5个接种，37培养24h。；2)B组准备三糖铁、尿素琼脂及普通琼脂斜面，分别接种疑似沙门氏菌，37培养24h。注意：接种的菌落几个培养基要一一对应并标记，保证后续试验顺利进行。TSI预期结果：斜面底层产气硫化氢沙门氏菌-+/-+大肠杆菌+/-4、初步鉴定：A组中，对符合大肠杆菌TSI菌落特征的细菌制片G染色，镜检。不符合者停止鉴定；B组中，对符合沙门氏菌TSI菌落特征和尿素分解阴性的细菌进行后续鉴定。不符合者停止鉴定。5、生化实验：取A、B组中合格菌对应的普通琼脂平板上的细菌进行生化实验，每种生化发酵管均37培养24h，然后观察记录结果。注：生化实验预期结果葡萄糖乳糖蔗糖麦芽糖甘露醇肌醇MRVPC尿素硫化氢大肠杆菌黄色气柱黄色气柱黄色或紫色黄色气柱黄色紫色红色黄色淡绿色黄色淡黄色沙门氏菌黄色气柱紫色紫色黄色气柱黄色黄色红色黄色深蓝色黄色黑色6、分析得出最终鉴定结果。注意事项1、严格遵守各项实验操作，如无菌操作，以避免结果的偏差； 2、最好按实验计划准时操作，或有所推迟，以确保每次培养都能达到规定时间，如24h；3、操作人员应注意安全。如酒精使用灯、有毒药物使用的安全； 4、实验前后应注重个人卫生，穿实验服、实验后吸收等，避免有毒菌感染；5、每日操作及观察结