色谱柱的再生.docx

江苏*药业有限公司Jiangsu * Pharmachem Co., Ltd.液相色谱柱的再生姓名：*部门：QC岗位：QC摘要：HPLC是现代工业分析常用仪器，液相色谱柱是HPLC色谱分离的核心部分。为了得到良好的分离效果和延长色谱柱的寿命，减少公司分析成本，本文针对液相色谱柱使用过程中容易发生的问题，并结合公司产品特性，介绍色谱柱的保养及再生方法。所谓再生，是指使用合适的溶剂或其它方法将色谱柱的污染物去除，以达到提高柱效，改善分析效果的目的。关键词：色谱柱 再生 保养 柱效1.前言液相色谱分离系统由两相固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶，流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。 因此，液相色谱分离的关键之一是色谱柱中的固定相。柱效的好坏直接影响目标化合物的分析和检测。但在液相色谱运行过程中，基于产品（尤其是Flubendazole）和色谱条件的特殊性，色谱柱极易发生问题，因此了解色谱柱使用维护知识和基本再生原理是必要的。2.色谱柱按键合到基质上的官能团可分为： 反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。 正相柱：填料是极性的，官能团为CN氰基、NH2氨基等。 离子交换键合相： 阳离子官能团：SO3H磺酸基、COOH羧基等。 阴离子官能团：R4N+季铵基、-氨基等。本文所涉及色谱柱（公司编号H029，用于氟苯咪唑Flubendazole有关物质测定）,是反相色谱柱中的ODS色谱柱，于9月份在分析过程中柱效严重下降，分离效果变差，系统适用性不符合要求，在用10异丙醇甲醇溶液冲洗后，柱效仍无改善，被换下作再生处理。ODS柱是十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力。3.再生原理样品中含有的一些物质，如盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质等是一些可能在使用时与HPLC柱发生相互作用的物质。这些物质有比分析者的目标物或少或大的保留值。那些保留值较小的物质如盐类一般来说在空体积时就被冲出色谱柱。这些非目标产物的干扰能被检测器检测到而且能形成色谱峰，基线上移或者是负峰。如果样品成分在柱子中有很强的保留而且流动相溶液成分不足以把这些物质洗脱下来，多次上样后，这些吸附在柱子表面的物质通常就会积累在柱头。有着中等保留值的样品能被缓慢洗出而且表现为宽峰，基线扰动，或者基线漂移。有时候这些被吸附的样品成分累积到一定程度足以使他们开始形成新的固定相。分析物能与这些杂质作用形成一定的分离机理。保留时间会波动，拖尾会出现。如果足够的污染产生，柱子的反压能超过泵所能承受的最大压力，使柱子无法工作以及在堵塞处产生空体积。这时，我们就要对色谱柱进行再生。 再生的关键是了解污染物的性质，并找到合适的溶剂（流动相）将其去除。4.再生溶剂选择反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度是：H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃 最常用的流动相组成是：甲醇-H2O和乙腈-H2O， 反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来。5.实验5.1仪器，设备和试剂废旧色谱柱 型号：Shimpack VP-ODS 4.6150mm，3.5mS/N：7042895 厂家：日本Shimadzu 编号：H029仪 器 Agilent 1200试 剂 乙腈 醋酸铵 纯化水5.2色谱条件柱温：40 检测波长：250nm 流速：1.3ml/min 运行时间：45 min 流动相：A：醋酸铵溶液（7.5g/L）B：乙腈流动相洗脱程序：时间minA（）B（）0.090101575253045553210903710903890104590105.3实验方法配制浓度为1mg/ml的氟苯咪唑（批次：2031109906）样品溶液，进样体积：10mL。5.4再生效果 再生处理后，理论踏板数明显提高，主峰与后面相邻峰的分离效果更好，经过测定符合Flubendazole有关物质检测系统适用性要求，各杂质峰均能有效检出。见图谱。色谱柱H029理论踏板数Plates分离度Resolution其它再生处理前146391.44峰高小，峰拖尾，变宽，有肩峰，鬼峰，杂质未能有效检出再生处理后447702.50峰高增加，峰型尖锐，不拖尾，无鬼峰，杂质能有效检出图1：再生前谱图图2：再生后谱图6.结论如果污染是因强保留物质累积引起的，可用流动相中较强的溶剂以相当于20个柱体积的溶剂冲洗污染物。残留的脂质能用非水溶剂如甲醇、乙腈、四氢呋喃清洗。如果使用的是缓冲液系统，则要先用无缓冲流动相(即把缓冲液换成水)以相当于510个柱体积的量冲洗，再更换强溶剂继续冲洗。 但有时强溶剂也无法将残留在色谱柱上的污染物洗掉，需要使用更强的溶剂或者多种溶剂清洗柱子。对于含蛋白质类的污染物，0.05mol/L稀硫酸冲洗非常有效，流速0.5ml/min。溶剂与溶剂之间的组合有很多，有时生产厂家会推荐溶剂系统。清洗、再生所用的系列溶剂都是强度逐渐增加的，通常最后一个溶剂是疏水的(如醋酸乙酯甚至是烃)，可以用来溶解非极性物质，如脂质和油类。清洗过程中必须保证冲洗溶剂之间的互溶性，清洗过程结束时，必须借助中等强度能互溶的中间溶剂回到初始溶剂系统。异丙醇是一种非常好的中间过渡溶剂，既能与正己烷或二氯甲烷互溶，又能与水相溶剂互溶。但异丙醇粘度非常大，必须在较低的流速下使用，以免泵压过高。一般情况下，极性固定相(如Si，NH。，Diol基色谱填料)的再生可以依次使用2030倍色谱柱体积的正已烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇冲洗色谱柱(因异丙醇的粘度较大，冲洗过程中随时注意调整冲洗流速)，然后再以相反的溶剂顺序冲洗色谱柱。非极性固定相(如反相色谱填料C18，C18，CN 等)的再生可依次用2030倍柱体积的甲醇：水=10：90(V/V)、乙腈、异丙醇冲洗色谱柱，然后再以相反顺序冲洗色谱柱。键合型的离子交换柱可以用缓冲溶液、水、甲醇冲洗。例如，典型的硅胶键合柱，在没有缓冲溶液的情况下，可以用甲醇、乙晴：异丙醇一75：25(vV)、异丙醇、二氯甲烷、正己烷依次冲洗。用二氯甲烷或正己烷中洗后，考虑到溶剂相容性，柱子必须再用异丙醇冲洗后才能用原来的水相溶剂。四氢呋喃是另外一种比较受欢迎的去除污染的溶剂。如果柱子被严重污染，可以用二甲基亚砜(DMSO)或者二甲基甲酰铵和水按50：50的比例混合，用低于0.5ml/min的流速冲洗色谱柱。对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在用水冲洗后用0.1mol/L 的氨水冲洗，然后再用水冲洗，直至碱溶液完全流出。另外，大多数强保留污染物都会累积在柱头上，对柱子反冲可以缩短冲洗时间。当然还要看所用色谱柱是否允许反冲。无论正冲还是反冲，最好不要接检测器，以免污染物进入检测池。频率越高越容易清洗，所以有规律地清洗柱子，可以预防重大问题的发生。污染严重的色谱柱冲洗无效时，需将柱内填料取出进行处理，或更换新填料。还可以将柱头入口处被污染的填料取出，重新补装同类型的填料，然后再改变柱流向进行再生。这种逆流再生方法，可以使大多数柱子性能得到恢复。7.延伸 大多时候而言，色谱柱的再生只是死马当活马医，对于工厂而言，正确使用和科学的维护更能降低成本，更为重要。当柱子和色谱仪连结时，阀件或管路一定要清洗干净。本人参照有关书籍结合实际工作经验，从流动相、样品、保护柱等方面提出色谱柱维护应注意的一些问题。 (1)流动相：流动相使用前必须经脱气和过滤处理。即使仪器配有自动脱气机，也最好采用超声脱气或其它简便的脱气方法对流动相进行预脱气。尽量避免使用高粘度溶剂(如异丙醇)作为流动相，避免流动相组成及极性的剧烈变化。流动相应尽量使用色谱纯，减少流动相中杂质对色谱柱的污染和对检测器的影响。水用超纯水，流动相最好用0.45 m或0.22m 的膜过滤。大多数反相色谱柱的pH稳定范围是27.5，硅胶柱pH8时会发生硅胶溶脱，键合型柱pH2时会发生键合相断裂，流动相尽量不超过色谱柱的pH范围。普通C18柱尽量避免在40 以上的温度下分析。柱内不溶物容易引起色谱柱的堵塞，影响样品的分离。不溶物产生的原因是有溶剂的不互溶、样品溶解液和流动相不互溶或者由于温度改变或固定相干涸而产生沉淀。为避免上述问题，要注意溶剂之间的互溶性。若两种溶剂不互溶，需经过中间溶剂慢慢过渡。保存时应将色谱柱两端密封，并尽量保持室温恒定。 (2)样品：对内径5mm 的柱子，样品需经0.45mm的膜过滤，更细的柱子要0.22 mm 的膜过滤。基体比较复杂的样品需经过一定的样品预处理，例如海洋沉积物、中药提取液、体液等，需要采用萃取等方法除去对柱子有损坏的较大杂质，例如色素、多糖、蛋白质等。尽量减少进样量，避免过载。 (3)保护柱