蚕蛹蛋白多肽保健功效的研究.doc

摘 要实验研究蚕蛹蛋白多肽的保健功效，包括抗疲劳作用和免疫调节作用两个部分。抗疲劳实验将蚕蛹蛋白多肽分为高、中、低剂量组，分别为2.4、1.2、0.6g/kgd喂饲小鼠28d，观察小鼠爬杆时间、负重游泳时间，测定血清尿素氮、肝糖原和肌糖原含量，测定游泳前、游泳后0、15、60min血清乳酸含量的变化。实验结果表明蚕蛹蛋白多肽能显著增加小鼠爬杆时间和负重游泳时间，增加小鼠运动过程中肝糖原和肌糖原含量，较少血清尿素氮的含量，并能显著降低游泳后血清乳酸的增加量；免疫调节实验也将蚕蛹蛋白多肽分为高、中、低剂量组，分别为5.0、2.6、0.5g/kgd喂饲小鼠40d，观察小鼠免疫器官指数变化、迟发型变态反应（DTH）、抗体生成细胞数和碳廓清能力等四个实验项目。实验结果表明与阴性对照组比较，蚕蛹蛋白多肽能显著增加小鼠胸腺指数，增加小鼠足跖肿胀度，增加小鼠抗体细胞生成数量，增加单核巨噬细胞吞噬能力。实验得到如下结论：蚕蛹蛋白多肽具有明显的抗疲劳作用和免疫调节作用。关键词：蚕蛹蛋白；多肽；抗疲劳；免疫调节AbstractThe experimental study on health function of silkworm pupa protein peptides, including anti-fatigue effect and immune regulation effects of two parts. Silkworm pupa protein polypeptide anti-fatigue is divided into high, medium, and low dose groups, respectively, 2.4, 1.2, 0.6g/kg d mice fed 28D, observation of climbing time, loaded swimming time in mice, determination of urea nitrogen, serum liver glycogen, and muscle glycogen content, determination of swimming, swim back before changes of serum lactic acid content of 0, 15 g. Experimental results indicates that silkworm pupa protein more peptide can significantly increased small rats climbing Rod time and loading swimming time, increased small rats movement process in the liver glycogen original and muscle glycogen content, less serum urea nitrogen of content, and can significantly reduce swimming Hou serum lactic acid of increased volume; immune regulation experimental also will silkworm pupa protein more peptide is divided into high, and in the, and low dose group, respectively for 5, and 2.6, and 0.5G/kg d feed feeding small rats 40D, observation small rats immune organ index changes, and late hair allergy (DTH), and antibody generated cell number and carbon clearance ability, four a experimental project. Experimental results show that compared with the negative control group, SilkWorm pupa protein or peptide can significantly increase the mouse thymus index, increase mouse Plantar foot swelling, increase the number of antibodies in mice cells, increase the phagocytosis of mononuclear-macrophage. Experimental come to the following conclusion: silkworm pupa protein polypeptide has obvious anti-fatigue effect and immune regulation effects. Keywords: silkworm pupa protein; peptide; anti-fatigue; immune regulation目 录摘 要IAbstractII1.概述12.材料与方法22.1材料、试剂与仪器22.2蚕蛹蛋白多肽的制备22.3 实验动物及分组22.4实验方法832.4.1负重游泳实验32.4.2爬杆实验32.4.3血尿素的测定32.4.4血乳酸的测定32.4.5肝糖原的测定42.4.6肌糖原的测定42.4.7小鼠免疫器官指数的测定52.4.8迟发型变态反应足跖增厚法（DTH）52.4.9抗体生成细胞数检测（Jerne改良玻片法）52.4.10小鼠碳廓清实验62.5统计分析63.结果与分析63.1蚕蛹蛋白多肽对小鼠游泳时间、爬杆时间的影响63.2蚕蛹蛋白多肽对小鼠血清尿素氮、肝糖原和肌糖原含量的影响73.3蚕蛹蛋白多肽对小鼠血乳酸的影响83.4蚕蛹蛋白多肽对小鼠免疫器官指数的影响93.5蚕蛹蛋白多肽对小鼠迟发型变态反应（DTH）的影响 .93.6蚕蛹蛋白多肽对小鼠抗体生成细胞数的影响103.7蚕蛹蛋白多肽对小鼠碳廓清能力的影响104.结论11参考文献：12- V -2011年“挑战杯”吉林省竞赛作品 蚕蛹蛋白多肽保健功效的研究1.概述 我国是养蚕大国，蚕蛹资源十分丰富，而且蚕蛹具有较高的营养价值。据报道，鲜蛹中含蛋白质14%15%，干蛹中含蛋白质45%50%，含有18种氨基酸，配比均衡，且人体必需氨基酸含量丰富，其生物效价与酪蛋白和大豆蛋白相当1-4，具有补充机体营养、促进生长发育、抗疲劳、抗衰老、提高人体免疫力等多种功能5-6，是一种优质蛋白质资源。蚕蛹蛋白水解后形成的多肽及氨基酸具有多种生理功能，多肽特别是小分子寡肽的吸收速度比游离氨基酸更快7。本实验采用一种电磁裂解装置制备蚕蛹蛋白多肽，研究其抗疲劳作用及免疫调节作用。- 1 -2011年“挑战杯”吉林省竞赛作品 蚕蛹蛋白多肽保健功效的研究2.材料与方法2.1材料、试剂与仪器蚕蛹 市售；昆明种小鼠，68周龄，各半，体重1822g，由吉林大学实验动物中心提供。全血乳酸测定试剂盒 、(二乙酰一肟法)、璃游泳缸（80cm80cm70cm）、玻璃杆（25cm0.8cm）、铅丝、752型分光光度计、ECA-2000B型半自动生化分析仪、超速离心机、水浴锅、温度计、秒表、电子秤、卡尺(精密度0.02mm)、绵羊红细胞(SRBC)、微量注射(50L)、二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、玻片架、200目筛网、SRBC、补体(豚鼠血清)、Hanks液、SA缓冲液、琼脂糖、722分光光度计、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO3等。2.2蚕蛹蛋白多肽的制备蚕蛹蛋白多肽电磁裂解装置其工作原理是当物料进入裂解仓后，由高频交变电磁场的作用下，物料升温，物料中分子在交变电磁场影响下，不断扭转、拉伸，使其分子断裂，物料中的水分被加热成水蒸气后由冷凝器降温，收集的冷凝水中含有多种小肽成分。收集到的冷凝水即为蚕蛹蛋白多肽液。2.3 实验动物及分组将小鼠随机分为4组，每组72只，组间体重经检验无显著差异。对照组、低剂量、中剂量组和高剂量组，饲养受试物量分别对应为：0、0.6、1.2和2.4g/kg的蚕蛹蛋白多肽，对照组给同体积的蒸馏水。每10g体重给予受试物0.2ml。采取灌胃法，连续饲喂28d后，测定各指标。将小鼠随机分为4个组，即即3个实验组和1个对照组，每组48只小鼠，组间体重经检验无显著差异。对照组、低剂量、中剂量组和高剂量组，饲养受试物量分别对应为：0、0.5、2.6、5.0 g/kg BW（分别相当于人体推荐用量的30、10倍和3倍），同时设一个阴性对照组（给予蒸馏水）。采用经口给予蚕蛹蛋白多肽，按0.2ml/10g BW的容量灌胃。2.4实验方法82.4.1负重游泳实验末次给予受试物30min后，给小鼠负体重5%重量，将小鼠放于水深不少于30cm，水温251的游泳箱中。记录自游泳开始至头部全部沉入水中8s不能浮出水面的时间作为小鼠游泳时间。2.4.2爬杆实验 末次给予受试物30min后，将小鼠放在爬杆架的有机玻璃棒上，使其肌肉处于紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳从有机玻璃上跌落下来的时间。第三次跌落时终止实验，累计三次的时间作为爬杆时间。2.4.3血尿素的测定 末次给予受试物30min后，将小鼠放于水温251的游泳箱中游泳90min，息60min后摘眼球取血，取血清用试剂盒(二乙酰一肟法)测定，按试剂盒说明书进行操作。2.4.4血乳酸的测定末次给予受试物30min后，剪尾进行第一次取血，处理好伤口后不负重，放于水温301的水中游泳10min停止，剪尾进行第二次取血，安静15min后剪尾进行第三次取血，安静60min后剪尾进行第四次取血，每次取血0.1ml，分别按试剂盒要求测定血清乳酸含量。2.4.5肝糖原的测定末次给予受试物30min后，将小鼠放于水温301的水中游泳60min后停止，立即处死小鼠取出肝脏，精确称取200mg，加入三氯乙酸（TCA）4ml，每管匀浆1min，3000r/min离心15min，取上清液转移至另一试管内。在沉淀中加入TCA 4ml。匀浆1min，再次离心15min，取上清液，与第一次离心的上清液合并，充分混匀。取1ml上清液，每管加入95%的乙醇4ml,充分混匀至两种液体间不留有界面。室温放置过夜。沉淀完全后将试管于3000r/min离心15min。小心倒掉上清液并使试管放置10min，用2ml蒸馏水振荡溶解并转移至10ml比色管中，同时在标准管中加入2ml蒸馏水，将各管置于冰水浴中，加入10ml蒽酮试剂，混匀，冷却至室温后，将各管置于沸水浴中煮沸15min，立即移至冰水浴，冷却至室温，混匀，在620nm波长下，用空白管调零，比色测定吸光度。每100g肝组织中糖原的毫克数(A1/A2)0.5(8/W) 1000.9式中，A1和A2分别为试样管和标准管吸光度、W为所取的肝组织重量（g）；0.5是0.5ml葡萄糖标准液中的葡萄糖含量、8为100mg肝组织的提取液体积、0.9为将葡萄糖换算成糖原的系数。2.4.6肌糖原的测定末次给予受试物30min后，将小鼠放于水温301的水中游泳60min后停止，立即处死小鼠取出肌肉，以0.9NaCl溶液冲洗后，用滤纸吸干，准确称取肌肉1g，放入盛有3ml 30KOH的试管中，置沸水浴煮20min，取出冷却后，将其转移至50ml容量瓶中，用水多次洗涤试管，一并收入容量瓶，加水至刻度，摇匀待用。置沸水浴中l0min使肌肉组织全部溶解。蒽酮比色法测定肌糖原含量，测定方法同1.4.1.5的测定。2.4.7小鼠免疫器官指数的测定 随机取高、中、低、剂量组及阴性对照组小鼠各12只。于末次给药后24h处死，取脾脏和胸腺，用滤纸吸干水分后在分析天平上称重，计算脏器指数（脏器重量体重）。2.4.8迟发型变态反应（足跖增厚法DTH） 随机取高、中、低、剂量组及阴性对照组小鼠各12只。小鼠腹腔注射2的绵羊红细胞，致敏4天后测量左后足跖厚度，然后在测量部位皮下注射20(v/v)绵羊红细胞，每只20l，注射后24小时测量左后足趾部厚度，同一部位测量3次，取平均值。以前后足跖厚度的差值（足跖肿胀度）来表示DTH的程度。2.4.9抗体生成细胞数检测（Jerne改良玻片法）随机取高、中、低、剂量组及阴性对照组小鼠各12只。末次给样前5天给受试小鼠每只腹腔注射0.2ml 2%(v/v)SRBC细胞悬液进行免疫，5天后处死，无菌取脾制成脾细胞悬液。将表层培养基（1g琼脂糖加双蒸水至100ml）加热溶解后，放4550水浴保温，与等量pH7.27.4、2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50l 10%SRBC（v/v，用SA缓冲液配置），25l脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待凝固后，将其水平倒扣于片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体（1:8）加入玻片架凹槽内，继续孵育11.5h，计数溶血空斑数。用空斑数/全脾细胞表示抗体生成细胞数。2.4.10小鼠碳廓清实验 随机取高、中、低、剂量组及阴性对照组小鼠各12只。按0.1ml/10g体重计算，小鼠尾静脉注射印度墨汁（将印度墨汁原液用生理盐水稀释4倍），分别在注射后2、10分钟从眼眶静脉丛取血20l，加入到2ml 0.1Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白，600nm波长测OD值，然后将小鼠处死，取肝脏、脾脏称重。计算吞噬指数（K）及校正吞噬指数（a），表示小鼠碳廓清的能力。吞噬指数K=(logOD1- logOD2)/(t2- t1)，校正吞噬指数a=体重/(肝重+脾重)K1/3。2.5统计分析数据均采用s表示；统计分析软件对结果进行单因素方差分析和检验。3.结果与分析3.1蚕蛹蛋白多肽对小鼠游泳时间、爬杆时间的影响由表1可见，与空白组比较，蚕蛹蛋白多肽各剂量组明显延长小鼠的游泳时间和爬杆时间。低剂量组延长游泳时间9.72，中剂量组延长游泳时间17.26，高剂量组延长游泳时间42.72，以高剂量组延长游泳时间最长，各剂量组呈明显的剂量依赖性。低剂量组延长爬杆时间19.28，中剂量组延长爬杆时间33.54，高剂量组延长爬杆时间44.35，以高剂量组延长游泳时间最长，各剂量组呈明显的剂量依赖性。因此，蚕蛹蛋白多肽可延长小鼠的负重游泳时间和爬杆时间，增强小鼠的耐力。表1蚕蛹蛋白多肽对小鼠游泳时间、爬杆时间的影响(，n=12)Table 1 The effect of silkworm polypeptides on the time of swimming and climbing pole of mice(，n=12).组别 剂量(g/kgd) 游泳时间(min) 延长率(%) 爬杆时间(min) 延长率(%)对照组 0 24.182.15 27.282.35低剂量组 0.6 26.534.27* 9.72 32.543.27* 19.28中剂量组 1.2 28.343.42* 17.26 36.434.64* 33.54高剂量组 2.4 34.513.14* 42.72 39.383.24* 44.35注：*.与对照组相比较p0.05，*.与对照组相比较p0.01。3.2蚕蛹蛋白多肽对小鼠血清尿素氮、肝糖原和肌糖原含量的影响由表2可见，与对照组比较，蚕蛹蛋白多肽组的血清尿素氮含量降低(p0.05)，肝糖原含量增加(p0.05)，肌糖原含量增加(p0.05)。实验结果表明蚕蛹蛋白多肽高剂量组能增加运动过程中的肝糖原和肌糖原的贮备，减少运动过程中血清尿素氮的含量。表2蚕蛹蛋白多肽对小鼠血清尿素氮、肝糖原和肌糖原含量的影响(，n=12)Table 2 The effect of silkworm polypeptides on the content of plasma urea, liver glycogen , muscle glycogen (，n=12)组别 剂量(g/kgd) 尿素氮含量(mmol/L) 肝糖原(%肝脏) 肌糖原(%肌肉) 对照组 0 23.731.24 2.960.93 0.570.05低剂量组 0.6 22.651.56 3.141.45 0.690.04*中剂量组 1.2 20.721.91* 3.362.42* 0.750.07*高剂量组 2.4 16.122.05* 3.641.18* 0.930.06*注：*.与对照组相比较p0.05，*.与对照组相比较p0.01。3.3蚕蛹蛋白多肽对小鼠血乳酸的影响由表3可见，游泳实验前各组小鼠的血清乳酸量无明显差异。游泳10min后立即采血测定的血清乳酸量显示，对照组和蚕蛹蛋白多肽各剂量组乳酸含量都有所增加，中剂量组小鼠血清乳酸低于对照组(p0.05)，高剂量组显著低于对照组(p0.01)。休息15min后再次测定血清乳酸值，中剂量组低于对照组(p0.05)，高剂量组明显低于对照组(p0.01)，血清乳酸值的下降明显。休息60min后再测定血清乳酸值，中剂量组低于对照组(p0.05)，高剂量组明显低于对照组(p0.01)，血清乳酸值的下降呈明显的剂量依赖性。表3蚕蛹蛋白多肽对小鼠血乳酸的影响(，n=12)Table 3 The effect of silkworm polypeptides on the lactates of mice (，n=12)血乳酸含量（mmol/L）组 别 游泳前 游泳后0min 游泳后15min 游泳后60min对照组 26.545.13 48.874.52 35.425.45 20.043.42低剂量组 24.754.17 45.865.44 29.733.42 17.184.16中剂量组 25.843.46 42.234.48* 27.653.24* 16.823.53*高剂量组 23.754.52 38.754.21* 24.852.82* 15.552.62*注：*.与对照组相比较p0.05，*.与对照组相比较p0.01。3.4蚕蛹蛋白多肽对小鼠免疫器官指数的影响表4蚕蛹蛋白多肽对小鼠免疫器官指数的影响(，n=12)Table4The effect of silkworm polypeptides on immune organ indexes of mice(，n=12).组别 剂量(g/kgd) 脾脏重量(mg) 脾脏指数(mg/g) 胸腺重量(mg) 胸腺指数(mg/g)对照组 0 115.1212.15 4.250.31 68.2712.37 2.920.32低剂量组 0.5 116.5214.21* 4.280.58 72.549.28 3.050.43中剂量组 2.6 118.3413.44* 4.310.43 76.4110.64 3.160.57*高剂量组 5.0 117.5113.12* 4.270.28 79.3510.26 3.190.61*注：*.与对照组相比较p0.05，*.与对照组相比较p0.01。3.5蚕蛹蛋白多肽对小鼠迟发型变态反应（DTH）的影响 .由表5可见，与对照组比较，蚕蛹蛋白多肽组中剂量组的足跖肿胀度增加显著(p0.05)，蚕蛹蛋白多肽高剂量组足跖肿胀度增加极显著(p0.01)。表5蚕蛹蛋白多肽对小鼠迟发型变态反应（DTH）的影响(，n=12)Table5 The effect of silkworm polypeptides on DTH in mice (，n=12)组别 剂量(g/kgd) 足跖肿胀度(mm) 对照组 0 0.48 0.15 低剂量组 0.5 0.49 0.13 中剂量组 2.6 0.61 0.14* 高剂量组 5.0 0.73 0.12* 注：*.与对照组相比较p0.05，*.与对照组相比较p0.01。3.6蚕蛹蛋白多肽对小鼠抗体生成细胞数的影响由表6可见，与对照组比较，蚕蛹蛋白多肽组中剂量组的溶血空斑数增加显著(p0.05)，蚕蛹蛋白多肽高剂量组的溶血空斑数增加极显著(p0.01)。蚕蛹蛋白多肽中高剂量组能显著增加小鼠抗体细胞生成的数量。表6蚕蛹蛋白多肽对小鼠抗体生成细胞数的影响(，n=12)Table 6 The effect of silkworm polypeptides on splenic antibody formation in mice (，n=12)组别 剂量(g/kgd) 溶血空斑数(103/全脾) 对照组 0 26.18 3.26 低剂量组 0.5 28.35 4.31 中剂量组 2.6 38.47 5.36* 高剂量组 5.0 45.62 6.13* 注：*.与对照组相比较p0.05，*.与对照组相比较p0.01。3.7蚕蛹蛋白多肽对小鼠碳廓清能力的影响由表7可见，与对照组比较，蚕蛹蛋白多肽低剂量组校正吞噬指数增加显著(p0.05)，蚕蛹蛋白多肽中、高剂量组校正吞噬指数增加极显著(p0.01)。并呈现明显的剂量依赖性，蚕蛹蛋白多肽能显著增加小鼠单核巨噬细胞吞噬能力。表7蚕蛹蛋白多肽对小鼠碳廓清能力的影响(，n=12)Table 7 Th