基质固相分散技术在农药残留分析中的应用.doc

基质固相分散技术在农药残留分析中的应用陈 军（湖南农业大学生物安全学院2009年农药学博士）摘要：基质固相分散(MSPD)样品前处理技术，对固体、半固体或粘性液体样品中目标物质分析具有独特的特性，在现代农药残留分析中应用越来越广泛。本文介绍了MSPD 的发展、原理和特点，简述了MSPD 的影响因素，并且对MSPD 在农药残留分析中的研究与应用、存在的问题以及发展前景进行了综述。关键词：基质固相分散；农药残留；应用Application of Matrix Solid-phase Dispersion in Analysis of Pesticide ResiduesAbstract: Matrix solid-phase dispersion (MSPD) is a new sample preparation technique for solid, semi-solid, and viscous samples developed over the last several years and finding ever-increasing application in pesticide residue analysis. This article presents the development, principles, and characteristics of MSPD, with brief discussion of the factors affecting MSPD and a summary of the research, application, remaining problems, and future development prospects of MSPD in pesticide residue analysis.Key words: matrix solid-phase dispersion (MSPD); pesticide residues; utilization近年来，随着农药品种的不断增多，使用范围不断扩大，农药残留已给环境、农作物及生物体安全带来了极大的影响。发展快速、可靠、灵敏和实用的农药残留分析技术无疑是控制农药残留、保证食用者安全和避免贸易争端的基础1。而农药残留检测是复杂基质中痕量组分的检测技术，因此，农药残留分析之前要有适合于各种目标物物理化学性质的提取、净化等预处理步骤，这些预处理过程往往在分析中起着主要作用。经典的前处理方法如索氏提取、液液分配、柱色谱、共沸蒸馏等，都要进行多次重复操作不仅花费大量时间，而且有机溶剂用量大，又需多步净化，萃取效率低。近年来，已报道或已取得广泛应用的前处理技术主要有：固相萃取(solidphase extraction ，SPE)、基质固相分散（Matrix solid-phase dispersion ，MSPD）、固相微萃取(solid-phase microextraction ，SPME)、超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，SFE)、加速溶剂萃取(accelerated solvent extraction ，ASE)、微波辅助萃取(microwave aided extraction ,MAE)、分子印迹技术(molecular imprinted Technique , MIT)和凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography,GPC)等，这些新技术符合现代人们对农药残留分析的环境友好、健康安全和高效经济的三大要求2-12。其中基质固相分散技术作为一种新的样品处理技术，可将提取净化一步完成，显示出了其省时省力，快速高效的特点。本文就近几年迅速发展的基质固相分散（MSPD）前处理技术及其在农药残留分析中的应用情况做了简要的介绍。1 基质固相分散（MSPD）技术1.1 MSPD技术的原理及优点基质固相分散（MSPD）是类似于固相萃取的一种提取、净化、富集技术，1989 年由美国Louisiana 州立大学的Steven Barker13首次提出并给予理论解释，其基本原理是将试样直接与适量反相填料(C18 或C8 键合硅胶)研磨、混匀制成半固态物质，然后装柱，用洗脱剂淋洗。根据分析物在聚合物/组织基质中的分散和溶剂的极性将分析物迅速分离。MSPD 所用的填料与固相萃取（SPE）相同，但是作用的方式不同。MSPD 中，固相载体在研磨过程中提供剪切力，破坏样品组织结构，将样品研磨成更小的部分，键合的有机相将样品组分溶解并更好地分散在载体表面。样品在载体表面的分散状态取决于其组分的极性大小。极性分子与载体表面未被键合的硅烷醇结合，或形成氢键；弱极性分子则分散在键合相与组织基质形成的两相物质表面。显微扫描电镜观察可证明MSPD 方法对样品基质分离分散效果明显。传统的农药残留分析，在提取和净化过程中，要经过多次的液液分配、干燥、浓缩及过滤转移，多种操作和对提取物的化学处理将会导致结果的不稳定，同时，也需要大量的样品（一般为20g 左右）及大量的提取溶剂或用制备规模的柱分离，而MSPD是一种基于SPE 的样品前处理技术，可直接处理固体、半固体和粘性液体样品，提取、净化一步完成。它的独特之处在于样品分离分散在固体表面键合的有机相中，成为整个层析系统的一部分，提供样品分离新空间，可以避免样品均化、沉淀、离心、转溶、乳化、浓缩等造成的被测物的损失，节约了分析时间，减少了溶剂用量，操作简单，分析结果相同或优于传统方法，同时易实现自动化。MSPD 适用于农药的多残留分析，特别适合于进行一类化合物或单个化合物的分离,内源物或外源物均可。除动物组织外，还适合于植物样品。目前该技术已被广泛应用于分离动物组织、水果和蔬菜中的药物、除草剂、杀虫剂及其它污染物14。1.2 MSPD 柱的制备MSPD 的制备是在玻璃研钵中将键合相载体与组织基质混合，用玻璃杵将其研磨成为均一相。研钵和杵都应用玻璃或玛瑙制品，用瓷或其它多孔渗水材料有可能造成目标化合物的损失。样品和键合相载体的最佳比例是1：4，大多数MSPD 中，典型的样品用量为0.5g13。混匀之后，将产生的半固态物质转移到柱中，底部预先垫上一层玻璃棉，填入混匀的样品后，上部需再垫上一层玻璃棉，以防止样品外漏，装好后用合适大小的活塞轻轻挤压，使得混合物中间没有裂痕。当样品填充好之后，即可进行溶剂洗脱。MSPD 主要通过重力作用洗脱，当溶剂流动不畅时，可用吸液球在柱头加压或是用真空减压装置控制流速。经MSPD 柱后的淋洗液可通过florisil 柱进一步净化，或者在同一MSPD 柱的底部填入florisil 硅土、无水硫酸钠等，加强净化效果，最后的流出液可直接进色谱分析。1.3 影响MSPD 分析的因素影响MSPD 的因素与SPE 相似，都是基于色谱原理分离和提取目标化合物，但MSPD 较SPE 复杂，它将样品分散到整个柱中，并与固定相、担体、淋洗剂都发生动态反应。因此，影响MSPD 的因素有基质种类、固定相的性质、担体的性质、洗脱剂的性质等15 , 16。1.3.1 固体支持物的性质目前所有报道中，MSPD 都采用硅胶键合固相支持物，其中有机相发挥了作用。样品与吸附剂一同装柱，一个重要因素是样品不可太湿，否则装柱和洗脱都很困难。固体支持物的孔径对MSPD 效果没有明显影响，然而其粒径相对来说较重要。使用320m 粒径会导致流量太小或不流动。大多MSPD 应用中使用4 0m 粒径。也有报道使用40100m 粒径的混合材料，这使MSPD效果更好。1.3.2 键合相的性质键合相在MSPD 中具有很重要的作用。一般碳链长，固定相含碳量高，固定相极性小；碳链短，固定相极性大。含氰基、氨基的固定相极性较大，常用作正相吸附剂，用于极性较大农药的萃取。Ferandez. M等17用液相色谱/离子阱质谱和飞行时间质谱测定橄榄油中的特丁津除草剂，采用液液萃取和以氨基硅胶为基质分散的固相萃取法，将2g 氨基与样品的2ml 乙腈萃取液混匀，净化采用Florisil 硅土小柱，用乙腈洗脱，特丁津的回收率大于96%,方法精密度(n=5)小于5%。 MSPD 中应用较多的是反相键合相，如C18 和C8，因其具有亲脂性，结合溶剂有助于破坏细胞膜并将组织分散，主要用于分离亲脂性的物质。1.3.3 样品基质的影响因为样品基质成为层析相的一部分，不同样品的油脂成分、蛋白质含量及其分布状态不同，所以目标物在不同基质中的测定结果和回收率也不相同。基质在载体中的分散状态与键合相在载体上的稳定结合不同，基质组分会与载体和洗脱液发生动态相互作用，某些基质成分也会被洗脱下来。与SPE 柱用于液体样品一样，MSPD 中有时候也需要加入酸、碱或离子对试剂到基质或是洗脱剂中，以改变其性能。分析物和样品组分的电离或电离的抑制可大大影响特定分析物与基质组分和洗脱溶剂相互作用的性质。李朝阳等18运用MSPD 方法对三种土壤中的甲氰菊酯进行提取，三种土壤的有机质含量、pH 及颗粒组成各不相同，以弗罗里硅土吸附，石油醚-乙酸乙酯洗脱。结果发现，有机质含量较高的土壤，由于其提取出的杂质较多，净化效果变差，回收率较低。1.3.4 洗脱剂的性质和添加顺序洗脱液的种类及其添加顺序是MSPD 成功最重要的因素。洗脱溶剂的选择与分析物和载体键合相的性质密切相关。理想的洗脱溶剂应具备以下两个要求：(1)溶剂强度足够大,即使用该洗脱溶剂时分析物的保留因子Kw尽可能小。(2)溶剂应与后续的检测方法相适应。因此分析者可以改变洗脱分布模式或采用更进一步的净化方式以获得好的分离效果。通常情况下，按照溶剂的极性从小到大开始洗脱，先用正己烷淋洗，然后依次用乙酸乙酯、乙腈、甲醇，最后用水淋洗13。2 基质固相分散(MSPD)在农药残留分析中的应用MSPD 以其独特的特性和优点在样品分析中广泛应用，可用于分析动植物组织、果汁、谷物、牛奶、蔬菜、水果等样品，常被用于在从牛奶和动物组织中分离药物。近年来，MSPD 在农药残留分析中应用报道逐渐增多，被用来检测果蔬、牛奶、谷物等的农药残留，主要分析的农药种类有氨基甲酸酯、有机磷、有机氯杀虫剂以及多种除草剂、杀菌剂等。目前国内外MSPD 在农药残留分析中的应用研究取得了较大进展，它已被应用到人血、动物组织、奶、苹果、桔子、梨、土豆、生菜等样品的安全分析中。有关报道见表1。国外在MSPD方面做出了大量成功的实例：Viana27对MSPD 方法进行条件优化，考察了氧化铝、硅胶和弗罗里硅土三种吸附剂，弗罗里对样品的净化效果最好，同时也优化了洗脱剂，选择二氯甲烷洗脱，C8小柱净化，并对朝鲜薊、莴苣、番茄中的毒虫畏、毒死蜱等9 种农药进行了测定。Torres28比较了用MSPD 和传统的液液分配两种净化方法对萃取水果、蔬菜中13 种杀菌剂及杀虫剂残留的效果，结果表明，以C18 为分散剂的MSPD 效果较好，回收率为70%105%。Alfonso Di Muccio 等29使用C18 作填料，利用MSPD分离后，对蔬菜、水果中1 3 种氨基甲酸酯类农药进行了LC-MS 检测，平均回收率为64%106%，平均检出限为0.0010.01mg/kg，这比EU 的MRLs 低10100 倍。Valenzuela30用C8 为MSPD 分散剂，二氯甲烷为淋洗液提取净化柑橘类样品中的农药残留，HPLC-UV 检测，样品添加回收率为74%84% ，相对标准偏差为2%4% 。Fernandez17将MSPD 用于蔬菜和水果中13 种氨基甲酸酯类农药的液相色谱分析，C18 、C8 、苯、CN 、NH2为分散剂，用二氯甲烷- 乙腈混合液淋洗，所得平均回收率为64%106%，相对标准偏差为5%15%。2002 年Blasco 将此技术和液相色谱分析结合测定蔬菜和水果中杀菌剂31。表1 MSPD 在农药残留分析中的应用实例被分析物基质固相材料洗脱剂文献杀菌剂果蔬C18 硅胶乙酸乙酯19农药蜜蜂弗罗里 硅胶中性氧化铝正己烷乙酸乙酯20有机磷 菊酯类杀虫剂水果C18乙酸乙酯21农药及其代谢物饮用水C18 弗罗里二氯甲烷22苯并咪唑类药物牛肌肉组织C18乙酸乙酯23有机磷类农药中草药活性炭 Celite 545 弗罗里乙酸乙酯24抗蚜威、双甲脒蔬菜、水果C18丙酮25呋喃丹小麦C18二氯甲烷26在国内，杨容等25、26成功应用MSPD 方法，使用ODS 键合相作填料，二氯甲烷洗脱，提取了水果蔬菜、稻谷、玉米等基质中的异丙威、溴氰菊酯、抗蚜威、双甲脒、克百威等，回收率均在90%以上；奉夏平等32 建立了用MSPD 快速测定蔬菜、水果中多种有机氯农药残留的方法；楚序红等33先后利用MSPD-GC/MS 测定苹果汁中105种和266 种农药残留。李建科等34在提取浓缩苹果汁中的5种有机磷农药残留时，以C18 键合硅胶为固定相，正己烷-乙酸乙酯-丙酮洗脱，GC 测定，比较了MSPD与液-液萃取方法的回收率大小。结果表明，MSPD 萃取技术加标0.1mg/kg 时回收率达96%以上，比传统的液-液萃取的回收率提高10%25%。一些新的MSPD 填料也得到了应用，张智超等35建立了以涂敷AgNO3 的碱性氧化铝为分散剂的MSPD 法提取、气相色谱/电子捕获检测器检测的大蒜中痕量二甲戊灵的分析方法。通过研究洗脱剂的极性和用量、固相分散剂的含水量和AgNO3 涂敷量对回收率及净化效果的影响，优化了MSPD 条件，对建立的分析方法进行了评价。结果表明：MSPD 提取液中的基质组分对目标物的响应没有显著影响，基质效应可以忽略。方法的回收率为8493，检出限( S/N= 3)和定量限( S/N = 10)分别为2.0 和6.7g/kg。Bogialli 等36建立了一种简便快速的检测牛奶中氨基甲酸酯农药残留的方法，采用基质固相分散技术作为前处理方法，以沙子（40200 目）作为固相载体，与牛奶一起搅拌至近干，装柱，90热水洗脱，回收率在76%104%范围内，方法可靠。3 基质固相分散(MSPD)在农药残留分析上存在的问题与展望MSPD 是截然不同的萃取样品技术，它还拥有许多其它方法的特点。它能直接处理固体、半固体和粘性样品，提供一个剪切力，同时分离分散键合固定相上的样品，随后作为填料装柱，拥有独特的层析特点，提供样品分离新空间，创造了M S P D 的独特之处。但是MSPD 用于农药残留分析时主要存在以下两个方面问题：一方面，目前随着农药残留限量标准日益严格，由于MSPD 取样量较少，故所得检测限较高，不能满足残留分析要求。要解决上述问题，一是在取样量较少的情况下，采用价格昂贵、精密度更高的仪器(GC/MS、LC/MS 等)进行检测；二是增加取样量，但给净化增添难度。因此，在一定程度上限制了其发展。另一方面MSPD 方法中样品与被分析的目标化合物一同分散在固体表面键合的有机相中，目标化合物随洗脱剂流出的同时，样品成分也被洗脱，难以分离、达到理想的净化效果。可以预见，随着科技的进步和现代检测手段的不断发展，MSPD 必将进一步成熟，技术理论日益成熟。将MSPD 样品处理技术与免疫分析技术、高专一性、高灵敏度仪器的相结合，会使分析更加快速和简化。其在农药残留分析中的应用必将越来越广泛，也将逐渐用于日常的农药残留监测。参考文献1 仲维科, 郝戬, 樊耀波, 等. 食品农药残留分析进展J. 分析化学评述与进展, 2000, 28(7): 904-910.2 冯世德, 王波, 曲红杰. 农药残留分析技术进展概述J. 黑龙江农业科学, 2005, (3): 27-29.3 于徊萍, 王彩梅. 食品农药残留分析的现代进展J. 吉林粮食高等专科学报, 2001, 16(1): 15-17.4 杨曼君. 农药残留分析中的提取新技术J. 农药科学与管理,2000, 21(1): 13-15.5 黄德智, 岳永德, 汤锋. 农药残留分析的研究进展J. 安徽农业科学, 2002, 30(4): 523-526, 541.6 吴春先, 慕立义. 我国农药残留分析技术发展概述J. 农药科学与管理, 2002, 23(2): 13-16.7 冯秀琼. 农药残留分析技术进展概况J. 农药, 1998, 37(2):8-10.8 Walter F, John W P, Robert A G, et al. Supercritical fluid extraction of organochlorme pesticides in eggs J. Agric Food Chem, 1999, 47: 206-211.9 Jimenez J J. Determination of rotenone residues in raw honey by solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography J. Chromatography A, 2000, 871: 67-73.10 曲虹云, 张军民. 当前国际上先进的农药残留分析技术J. 黑龙江农业科学, 2000, 37(5): 37-39.11 陈华才. 简论农药残留量检测中的样品前处理技术J. 中国计量学院学报, 2002, 13(3): 240-244.12 易军, 李云春, 弓振斌. 食品中农药残留分析的样品前处理技术进展J. 化学进展, 2002, 14(6): 415-424.13 Barker S A. Matrix solid-phase dispersion J. Chromatography A, 2000, 885: 115-127.14 王绪卿，吴永宁 等. 色谱在食品安全分析中的应用.北京：化学工业出版社，2004:3032.15 李莉, 钱传范, 江树人, 等. 蔬菜和水果中农药残留基质固相分散技术的应用A ,江树人主编. 农药与环境安全国际会议论文集M. 北京: 中国农业大学出版社, 2005: 277-282.16 Barker S A. Applications of matrix solid-phase dispersion in food analysis J. Chromatography A, 2000, 880: 63-68.17 Ferandez M, Picd Y, Manes J. Determination of carbamate residues in fruits and vegetables by matrix solid-phase dispersion and liquid chromatography-mass spectrometryJ. Chromatography A, 2000, 871: 43-56.18 李朝阳，张智超，周其林等. 底物固相分散法测定土壤中甲氰菊酯残留量J.分析实验室，2003，22（3）：1315. 19 M Navarro, Y Pico , R Marin, et al. Application of matrix solid-phasedispersion to the determination of an ewgeneration of fungicides infruits andvegetablesJ. Journal of Chromatography A, 2002, 968: 201-209.20 Bozena Morzycka. Simple method for the determination of trace levels of pesticides in honey bees using matrix solid-phasedispersion and gas-chromatography J. Journal of Chromatography A, 2002, 982: 267-27321 E. Maria Kristenson.Miniaturized automated matrix solid-phasedispersion extraction of pesticides in fruit followed by gas-chromatographic mass spectrometric analysis J. Journal of Chromatography A, 2001, 917: 277-286.22 Farid E Ahmed.Analyses of pesticides and their metabolites in foods and drinks J. Trendsin Analytical Chemistry, 2001,20(11).23 张素霞, 李俊锁, 钱传范. 牛肌肉组织中苯并咪唑类药物的基质固相分散-高效液相色谱多残留分析法J. 中国兽医学报, 2000, 20(6): 569-571.24 冯秀琼, 唐庆勇. 中草药中有机磷农药多残留的同时测定J. 农药科学与管理, 2002, 23 (2): 17-20.25 杨容, 刘海燕, 鲁晓芳. 基质固相分散分离高效液相色谱法测定食物中痕量抗蚜威和双甲脒J. 河北农业大学学报, 2003, 26(2): 114-117.26 杨容. 基质固相分散- 高效液相色谱法测定小麦中痕量呋喃丹J. 河北大学学报(自然科学版), 2003,23(3): 269-271.27 E. Viana, J.C. Molto, G.Font, Optimization of a Matrix Solid-Phase Dispersion Method for the Analysis of Pesticide-Residues in Vegetables J. Chromatogr. A, 754（1996）437.28 Torres C M, Pico Y, Manes J. Analysis of pesticide residues in fruit and vegetable by matrix solid-phase dispersion(MSPD) and different gas chromatography element-selective detectors J. Chromatography A, 1995, 41(11-12): 685-692.29 Muccio A D, Barbini D A, Generali T, et al. Clean-up of aqueous acetone vegetable extracts by solid matrix partition for pyrethroid residue determination by gas chromatography electroncapture detectionJ. Chromatography A, 1997, 765: 39-49.30 Valenzuela A I, Lorenzini R, Redondo M J. Matrix solid-phase dispersion microextraction and determination by high-performance liquid chrom