饮用水的检验操作规程.doc

饮用水的检验操作规程目的：为检验生活饮用水建立一个标准操作规程。适用范围：生活饮用水检验操作。责任：生活饮用水检验人员对本规程的实施负责，检验室主任对本规程的有效执行承担监督检查责任。程序：1. 设备和仪器：酸度计、浊度计、立式比色器、电炉、紫外-可见分光光度计、恒温水浴锅、分析电子天平及各种玻璃仪器。2. 试试剂和试液：氯化铂（干燥）：烟酸铬黑T、EDTA-2Na标准溶液（0.01mol/L）锌标准溶液（0.01mol/L）、氯化铵、氨水、氯化钠、硝酸钾、铬酸钾等。 氨-氯化铵缓冲液：称取5.4g氯化铵溶于20ml水中，加35ml浓氨，用水稀释至100ml。 铬黑T指示剂：0.1g铬黑T加10g氯化钠，研匀后装于棕色瓶中。 1:3硫酸液：向3份水中缓缓加入浓硫酸1份。 0.005mol/L草酸溶液：精密称取6.3032g基准草酸溶于水中，并准确容至1000ml量瓶中。 0.02mol/L高锰酸钾溶液：称取3.16g高锰酸钾加1000ml水煮沸1015分钟，加塞静置710天，取上清液（玻璃砂芯漏斗过滤）。0.002mol/L高锰酸钾溶液：取上述0.02mol/L高锰酸钾溶液稀释，并用0.005mol/L草酸溶液标定【标定：取大三角瓶加蒸馏水100ml，加1:3硫酸5ml，精密加草酸溶液（0.005mol/L）10ml，加热煮沸5分钟，趁热用高锰酸钾溶液（0.002mol/L）滴至浅红色（30秒不褪）为终点（F=10.00/V）】。 锌粉：用0.01mol/L盐酸和水洗净，干燥。 显色剂：取对氨基苯磺酸1.0g，-萘胺0.1g和酒石酸8.9g研匀后，棕色瓶保存。30%氯化铵溶液。 Kcl-Hcl缓冲液（PH 1.8）：将0.2MKcl溶液50ml与0.2MHcl溶液16.6ml混匀，用水稀释至200ml。 硝酸钾标准溶液：取105恒重4小时的硝酸钾3.6090g用水溶解并定容至500ml（此溶液每1.0ml含硝酸盐氮1.000mg）。 1%对氨基苯磺酰胺溶液。 0.1%盐酸N-(1-萘基)-乙烯二铵溶液。 氨氮标准溶液：（监用新配）吸取10.00ml氨氮标准贮备液，用水定容至1000ml（每1.0ml含10.0g氨氮）。 50%酒石酸钾溶液：取50g酒石酸钾钠溶于100ml纯水中加热煮沸至不含氨为止，冷却后再用纯水补充至100ml。 纳氏试剂：称取100gHgI2与70gKI，溶于少量纯水中，将此溶液缓缓倒入冷却的500ml32%氢氧化钠溶液中，并不停搅拌，再用水稀释至1000ml，用橡皮塞紧避光保存。（注意：存放已久的纳氏试剂，用已知量的氨氮标准液显色，两小时内不得浑浊，否则重配）。 亚硝酸盐氮标准贮备液：称取0.2463g，于干燥器内放置24小时的亚硝酸钠用水定容至1000ml，并加氯仿2ml保存，此液1.00ml含50g亚硝酸盐氮。 Nacl标准液：取Nacl适量于700灼烧1小时，冷却后，称取0.8242g加水溶解并定容至1000ml（每1.0ml含0.500mg氯化物）。 铬酸钾溶液：取铬酸钾5g，溶于少量蒸馏水中，加入AgNO3标准液至红色沉淀不褪，搅拌均匀后，放置过夜，过滤，滤液用水定容至100ml。 AgNO3标准溶液：取105干燥30分钟并于干燥器中冷却至室温的硝酸银2.3950g加水溶解并定容至1000ml容量瓶中，用上述Nacl标准溶液标定。 邻苯甲苯胺溶液:称取1.246g氯铂酸钾，再用具盖称量瓶称取1.000g干燥的氯化铂共溶于100ml纯水中，加入100ml浓盐酸，然后用纯水定容至1000ml，此标准溶液的色度为500度。3. 色度3.1原理：用氯铂酸钾和氯化钴配成铂-钴标准溶液，同时规定每升水中含1mg铂时所具有的颜色作为1个色度单位，称为1度，用目视法比色测定水样色度。3.2操作：取两支50ml比色管，一支加1.5ml铂-钴标准比色液，加纯水至刻度；另一支加待测水样50ml，两者同置白色背景下，目视比色，水样颜色与标准比色液一致并不得深于标准比色液。3.3限度：不得超过15度。4浑浊度：41原理：浊度仪通过测定某一角度上的透射光的强度，以达到测定水样的目的。4.2操作：4.2.1打开浊度仪电源，使仪器稳定。4.2.2在水箱中装少量纯水调节“微调”使显示为0.4.2.3倒出水箱中纯水，用待测水样冲洗数次，再装适量待测水样进行测定。4.2.4清洗水箱，晾干，关掉电源。4.3限度：不得超过3度。5.PH值：5.1操作：用酸度计进行测定。5.2限度6.58.5。6.臭和味：6.1操作：取100ml水样，置于250ml三角瓶中，振摇后从瓶口嗅水的气味，同时，取少量水放入口中，不要咽下去，尝尝水的味道。6.2限度：不得有异臭和异味。7.总硬度：7.1原理：将水样的PH值调到100.1后，以铬黑T为指示剂，用EDTA滴定液滴定，当达到等当点时，溶液中的Ca2，Mg2被EDTA完全络合，溶液就从酒红色变为蓝色。7.2操作：精密量取待测水样50ml，加缓冲溶液5ml，铬黑T少量，立即用EDTA-2Na滴定液（0.01mol/L）滴至溶液 显蓝色，即可。7.3计算： V0.01F1000100.09 总硬度= (mg/L) 50 式中：V为消耗EDTA-2Na滴定液（0.01M）的体积（ml）。 F为EDTA-2Na滴定液的校正系数。7.4限度：应少于450mg/L。8.耗氧量：8.1原理：样品中的还原物质在酸性条件下，被过量的高锰酸钾氧化，然后用草酸来分解剩余的高锰酸钾。8.2方法：精取100ml待测水样置250ml三角瓶中，加1:3硫酸5ml，自滴定管中加0.002mol/L高锰酸钾溶液10ml，大火迅速蒸煮，保持5分钟（此时溶液应红色），立即精密加入0.005M草酸溶液10ml（应为无色），继续用0.002mol/L高锰酸钾滴定液滴至浅红色（V1）,空白（100ml蒸馏水）同作（V2）.8.3计算： （V1-V2）FkMnO40.002158.06 耗氧量= 1000 V取样量 式中：V1样品消耗高锰酸钾滴定液的体积（ml）。V2空白消耗高锰酸钾滴定液的体积（ml）。V取样量样品的取样量（ml）。FkMnO4高锰酸钾滴定液的校正因子。158.06每ml高锰酸钾（0.002mol/L）相当于158.06mg的氧。 注意：测定时如水样的高锰酸钾（0.002mol/L）超过了加入量的一半，由于高锰酸钾的浓度过低，因而影响了氧化能力，使测定结果偏低，应少取样品稀释后重做。 8.4限量：本品的耗氧量应少于2.5mg/L. 9.硝酸盐氮： 9.1原理：在含有氯化铵的酸性溶液中加入锌粉，使硝酸根离子还原为亚硝酸根离子，亚硝酸根离子与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，再与-萘胺发生偶联反应，以生成的红色偶氮色素进行定量分析。9.1.1方法：取硝酸钾标准液0.5ml加水至25ml，另取待测水样25ml，两者各分别加30%氯化铝1ml，Kcl-Hcl缓冲液（PH 1.8）1ml，锌粉0.2g，摇匀后放置10分钟，滤过，滤液中加入显色剂60mg，使溶解混匀，放置30分钟后，于520nm的波长处，测定吸收度，空白同做。9.2原理：PH 1.7以下水中亚硝酸盐与对氨基苯磺酸胺起重氮作用，再与盐酸N-(1-萘基)-乙烯二铵产生偶合反应，生成紫红色的偶氮染料，比色定量。9.2.1方法：取待测水样50ml，加入1%对氨基苯磺酸胺溶液1ml，摇匀后放置2-8分钟，加0.1%盐酸N-(1-萘基)-乙烯二铵溶液1.0ml，立即摇匀，并置于立式比色器中，与标准系列进行比色，直接读出亚硝酸盐氮的含量。空白管以纯净水同法操作。9.3计算： A样C对0.5硝酸盐氮= 1000 亚硝酸盐氮 A对V取样量式中 A样样品的吸收度。 C对对照品的浓度。 0.5对照品取样量（ml）。 A对对照品的吸收度。 V取样量样品的取样量（ml）。9.4限量：本品含硝酸盐氮应小于20mg/L。10.氨氮：10.1原理：水中氨与纳氏试剂（K2HgI4)在碱性条件下生成黄至棕色化合物，其色度与氨氮含量成正比。10.2方法：取两支比色管，甲管中精密加入0.25ml氨氮标准溶液，加纯净水至50ml，乙管中加50ml待测水样，两管中各加入1ml50%酒石酸钾钠溶液，混匀后再分别加入1ml纳氏试剂，静置10分钟，白色背景下比较，样品管颜色应浅于对照管颜色。10.3计算： 10.00.25 氨氮= =0.05mg/L 5010.4限量：本品含氨氮应少于0.05mg/L。11.氯化物：11.1原理：水样中的Cl-与加入的AgNO3的Ag形成白色沉淀，而过量的AgNO3能与K2CrO4反应，形成砖红色的铬酸银，从而测出氯化物的含量。11.2方法：精密量取待测水样100ml，加2ml铬酸钾溶液，用硝酸银标准溶液滴定至生成桔红色沉淀，空白同法操作。11.3计算： W（V1V2） 氯化物= 1000 V 式中：W每1ml硝酸银标准溶液相当于氯化物的量（mg/L）。 V样品取样量（ml）。 V1样品消耗硝酸银标准溶液的量（ml）。 V2空白消耗硝酸银标准溶液的量（ml）。11.4限度：应少于250mg/L。12.肉眼可见物。12.1方法：将水样摇匀，直接观察。12.2限度：不得含有。13.微生物限度：按微生物限度检验操作规程（SOP-QC-070-00）。本品的细菌总数应小于100个/L，大肠菌应小于3个/L。14.检验操作完毕，填写好生活饮用水监测记录（REC-QC-022-00）。微生物限度检验操作规程目的：建立微生物限度检验的标准程序。适用范围：原辅料、中间产品、成品及所有需要控制微生物限度的物料。责任：进行微生物限度检验的人员对实施该规程负责，检验室主任对本规程的有效执行承担监督检查责任。程序：1. 设备及用具：微生物限度检查用设备及用具，应包括保证菌检操作的环境及各项试验所用的仪器用具等。1.1菌检操作设备超净工作台、3035及2025恒温培养箱、真空泵、生物学显微镜、酒精灯。1.2仪器、用具除菌滤器、抽滤瓶、吸管、注射器、试管、量筒、烧杯、载玻片、培养皿、注射器针头、镊子、剪子、橡皮塞、橡皮管、棉花、吸管筒、接种针、工作衣、帽、口罩、鞋等。1.3试剂1.3.1培养基 营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）、胆盐乳糖培养基(BL)、虎红琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）、麦糠凯琼脂培养基（MacC）、三糖铁琼脂培养基（TIS）、十六烷三甲基溴铵琼脂培养基、胆盐硫乳琼脂培养基（DHL）、沙门氏、志贺氏菌属琼脂培养基（SS）、四硫磺酸钠亮绿增菌液（TTB）、亚碲酸盐肉汤培养基、卵黄高盐琼脂培养基、5%乳糖发酵管、甘露醇高盐琼脂培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、糖、醇发酵培养基、枸橼酸盐培养基、蛋白胨水培养基、绿脓菌素（pyocyanin）测定用培养基(PDP琼脂)、赖氨酸脱羧酶试验培养基、硝酸盐胨水培养基、尿素琼脂培养基、氰化钾培养基、明胶培养基。1.3.2试药 虎红（四氯四碘荧光素）、牛肉浸出粉、沙黄（番红）、枸橼酸铁铵、DL-赖氨酸、L-赖氨酸、磷酸二氢铵、酸性复红、液体石蜡、胰蛋白胨、牛胆盐、酚红。1.3.3试液亚硝酸钠（钾）试液、亚甲蓝试液、甲基红试液、二盐酸二甲基对苯二胺试液、氢氧化钾试液、沙黄（番红）试液、虎红试液、无菌对氨基苯甲酸试液、草酸铵试液、盐酸试液、无菌尿素试液、无菌枸橼酸钠-氯化钠试液、氯化三苯四氮唑试液、-萘酚乙醇试液、曙红钠试液、亮绿试液、氰化钾试液、靛基质试液、结晶紫试液、碘试液。1.3.4稀释剂 无菌吐温-80-氯化钠溶液、0.9%无菌氯化钠溶液、无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2）。1.3.5指示液 中性红指示液、酚红指示液、溴麝香草酚蓝指示液、酸性复红指示液（Andrade指示剂）、溴甲酚紫指示液。1.3.6消毒剂： 0.1%新洁尔灭溶液、75%酒精、2%甲酚皂液、40%甲醛。2.试验前的准备工作2.1用具的洗刷2.1.1试管 使用过的试管经消毒后，用洗涤剂洗刷，然后用自来水冲洗4-5次，将试管倒立，内外冲洗干净，再用纯化水冲洗1次，晾干备用。2.1.2培养皿 使用过的培养皿经消毒后，将培养基倒出或刮出，用洗涤剂洗刷内外，再用饮用水冲洗4-5次，用纯化水洗一次，烤干或晾干备用。培养皿如被抗生素或消毒剂污染，则应在清洁液内浸泡过夜，再用饮用水冲数次，纯化水冲洗1次。2.1.3橡皮塞 先用应用水冲洗干净，再用纯化水冲洗1次。2.1.4吸管 使用过的吸管，经消毒后，用流水冲洗，冲去吸管上端的棉花（新的吸管无此程序，直接浸泡），放入清洁液内浸泡过夜，用饮用水冲洗数次，再用纯化水冲洗1次，晾干备用。2.1.5滤器 用饮用水冲洗数次后，再用纯化水冲洗干净。2.1.6烧杯、量筒、抽滤瓶等玻璃器皿，用饮用水冲洗数次，晾干后再用清洁液浸泡过夜，取出，用饮用水冲洗数次，纯化水冲洗1次，晾干备用。2.1.7剪刀、镊子用水冲洗干净，放在盘内在恒温室干燥，备用。2.1.8无菌衣、裤、帽、口罩等，用水洗涤干净，配套后装入布口袋，扎紧袋口，再用牛皮纸包好。2.2用具的灭菌将包扎好的用具，除另有规定外，在1210.5蒸汽灭菌30min。物品取出时切勿立即置冷处，以免急速 灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压，易致染菌，应置温箱内加热烘干。2.3菌检室的要求2.3.1菌检室光线应明亮，但要避免阳光直射，应有适宜的换气设备，但不得有强烈气流，防止室内空气扰动，温室最好在20-24，相对湿度保持在45%-60%。2.3.2菌检室内设备应力求简单，除必要的设备、用具外，试验台、椅子等最好不选用木制品。2.3.3菌检室内应设置适当紫外灯及日光灯。紫外灯距实验台面一般为1.2-1.5m。2.3.4菌检室应定期全面清扫，并备有药液，菌检室清扫工具必须专用。2.3.5工作前，菌检室（包括缓冲间）应紫外灯照射，以达到灭局效果，保持环境的无菌。2.3.6工作前，需用消毒药液擦拭超净工作台及工作面。工作后，用消毒药液再擦拭一遍，并擦拭墙壁、地面及一切可能污染的死角。2.4菌检室菌落检查2.4.1取内径90mm的灭菌干燥培养皿，无菌操作注入已融化的冷却至约45的肉汤琼脂培养基约15ml，凝固后倒置，经30-35培养48小时，证明无菌后，取平板3-5个，分别放置工作位置的左、中、右等处，开盖暴露30min后，置30-35培养48小时，取出检查。100级洁净区（室）平板杂菌平均不得超过1个菌落。2.4.2菌检室菌落不合要求时，应立即采取有效办法彻底消毒处理，直至重复检查合格要求为止。2.5入菌检室的要求2.5.1操作人员进入菌检室前，应在缓冲室按规定穿戴已灭菌的工作衣、帽子、口罩及鞋。一般情况下，进入菌检室后不再外出，因而每次试验所需物品应统一计划好，开始工作后不得随意出入，要求工作人员严格执行无菌制度，工作完毕将室内彻底清理，恢复使用前原状。2.5.2进入菌检室的物品、工具，需经高压蒸汽灭菌，不能高压蒸汽灭菌的，需用消毒液擦拭其外部。3.培养基3.1根据检查的微生物不同，应选用适当的培养基。3.2菌检用培养基的制成品应澄清=无沉淀，且需进行无菌试验：将已备妥的培养基，按其用途分别置于30-35培养48小时及20-25培养3天，均应无菌生长。如有菌生长须重新制备培养基，否则不能保证无菌检查结果的可靠性。4操作4.1抽样及供试品的保存4.1.1抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应抽选有疑问的样品，但因机械损伤明显破裂的包装不得作为样品。4,1,2凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀以及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检查。4.1.3抽样量一般为检验用量（2个以上最小包装单位）的三倍量。4.1.4一般采用随机抽样方法抽样。4.1.5公式品在检验之前，应保存在阴凉干燥处（勿冷藏或冷冻），以防供试品的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。4.1.6供试品在检查之前，应保持原包装状态，严禁开启，包装已开的样品不得作为供试品。4.2供试品溶液的制备4.2.1液体供试品 吸供试品10ml，加入90ml稀释剂中，混匀，作为供试品，油剂可加适量吐温-80，合剂（王浆或蜂蜜者）可用供试品作为供试液。4.2.2固体、半固体或粘稠液 取供试品10g置0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀后，作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量吐温-80，并适当加温，但不应超过45.a. 非水溶性供试品 称取供试品10g（10ml），加入灭菌吐温-80（30ml），灭菌液体石蜡10ml与0.9%灭菌氯化钠溶液60ml（或50ml），同置匀浆仪中，乳化或其它适宜方法乳化，作为供试液，在制备过程中，必要时可适当加温，但不应超过45. b不溶于水的膜剂供试品 取规定量，剪碎，加稀释剂100ml（必要时可增加稀释剂），浸泡，振摇，作为供试液。 c肠溶胶囊（片）供试品 取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液（PH6.8）100ml的锥形瓶中，于45水浴中，保温，振摇，使溶解，作为供试液。4.2.3含抑菌成分供试品 供试品如干扰控制菌检验，按以下方法处理后，依法检查。a稀释法 将供试液种入大量的培养基中，使液体供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。b.离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，离心（每分钟3000转）30分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可先离心（每分钟500转）5分钟，取全部上清液，再行集菌处理。c.薄膜过滤法 取规定量的供试液，置稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm，孔径不大于0.450.02m微孔滤膜的薄膜过滤器内，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50-100ml，取出滤膜备检。d.中和法 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的供试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。5.检查法5.1细菌、霉菌与酵母菌检验操作规程5.1.1平皿菌落计数法 取均匀供试液，再稀释成1:102、1:103等适宜的稀释度，分别取三个稀释度的供试液各1ml，置于平皿内，再注入约45的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释度作2-3个平皿。5.1.2细菌计数用营养琼脂培养基，霉菌计数用虎红琼脂培养基，酵母菌计数用浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，合剂用虎红琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基。5.1.3取供试验用的稀释剂各1ml，置已灭菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备【平板，培养、检查，不得长菌。5.1.4细菌培养时间为48小时，分别在24小时及48小时点计菌落数，一般以48小时菌落数为准：霉菌、酵母菌培养时间为72小时，分别在48及72小时点计菌落数，一般以72小时菌落数为准。5.1.5营养琼脂平板一般点计细菌菌落，虎红琼脂平板一般点计霉菌菌落。在特殊情况下，前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂平板仅点计酵母菌菌落数，液体制剂同时点计霉菌菌落及酵母菌菌落数。含蜂蜜及王浆的合剂的霉菌、酵母菌菌落数分别测定，合并计数。菌落若蔓延成片，不宜计数。5.1.6菌数报告规则： 细菌宜选取平均菌落数在30-300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30-100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。如有1个稀释级在30-300（30-100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稀释级在30-300（30-100）之间时，按下式计算两级比值： 高稀释级的平均菌落数稀释倍数比值= 低稀释级的平均菌落数稀释倍数 比值2时，以两稀释级的均值报告，比值2时，以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30-300之间时，以后2个稀释级计算间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在30-300之间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级菌落数乘以稀释倍数报告；如当1:10或（1:100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1:10稀释级）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个。5.1.7培养基稀释法：取供试液（原液或1:10供试液）3份，每份个1ml，分别注入5个平皿内（每皿各0.2ml），每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。每1ml注入的5个平板点计的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得三组数据。以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。5.1.8结果判断5.1.8.1细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数、控制菌各项均符合该品种微生物限度5.1.8.2细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试两次，以三次结果平均值报告。5.1.8.3眼科用药的霉菌（酵母菌）菌落数复试报告，须以二次复试结果均不得长菌，方可判为供试品合格。5.1.8.4如发现营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵母菌）菌落数或虎红琼脂培养基平板上生长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时，应判为供试品不合格。5.1.8.5各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判为该供试品不合格。5.2大肠杆菌检验操作规程5.2.1增菌培养：取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），取胆盐乳糖培养基3份。每份各100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作空白对照。培养18-24小时（必要可延至48小时）。空白对照应无菌生长。其余2份培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯平板，培养18-24小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落生长，或有菌落但不同于表1所列的特征，可判为未检出大场杆菌。 表1 大肠杆菌菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。5.2.2分离培养：如生长的菌落与表1 所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的中心，沾取培养物，每次应挑取2-3个疑似菌落，接种于营养琼脂培养基斜面上。置361培养18小时，供革兰氏染色镜检及生化试验用。在上述检验过程，若发现疑似的其它规定控制菌时，亦应继续鉴定。5.2.3革兰氏染色镜检：取上述斜面培养物，涂片，固定。以结晶紫染液染色1分周公，水洗。革兰氏碘液媒染1分钟，水洗，滤纸吸干余水。以95%乙醇脱色20-30秒钟，水洗。滴加沙黄染液复染1分钟，待干后镜检。大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢短杆菌。由于菌龄等原因，菌体长短可有变化。5.2.4生化反应5.2.4.1乳糖发酵试验：将上述斜面培养物接种于乳糖发酵管，置361培养24-48小时，观察结果。大肠杆菌应发酵乳糖并产酸产气，或产酸不产气。产气者，以酸性复红为指示剂的培养基显红色；以溴麝香草酚蓝为指示剂的培养基显黄色，产气者，杜氏管内有气泡。为避免迟缓发酵乳糖造成假阴性，可选用5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌可于24小时内出现阳性反应。5.2.4.2IMViC试验 靛基质试验：将斜面培养物接种于蛋白胨水培养基中，置361培养482小时。沿管壁加入靛基质试液0.3-0.5ml，轻微摇动，观察液面颜色。阳性反应为液面呈瑰红色；阴性反应为试剂本色。 甲基红试验：将斜面培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，置361培养482小时。于每1ml培养液中加入甲基红指示剂1滴，立即观察结果，阳性反应培养液为鲜红色或桔红色；阴性反应呈黄色。 V-P试验： 将斜面培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，置361培养482小时。于每2ml培养液中加-萘酚乙醇试液1ml，摇匀，再加40%氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，观察结果。阳性反应立刻或数分钟后出现红色，加试剂后4小时内，无红色反应时为阴性，如出现红色亦判为阳性。 柠檬酸盐利用试验：将斜面培养物接种于柠檬酸盐培养基斜面，置361培养482小时。观察结果。斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝时为阳性反应；斜面无菌苔生长，培养基颜色无改变为阴性反应。若斜面有微量菌苔生长或颜色改变等可疑现象时，应将待检菌株重新分离、纯化后，再行试验。大肠杆菌的IMViC反应模式为 或 。对出现可疑反应的培养物，应将所分离的待检验菌株于EMB或麦康凯琼脂平板上重新划线分离后，再做生化试验证实。5.2.4.3结果报告：当空白对照试验呈阴性，供试品检查完全符合下列结果时，判断为检出大肠杆菌。 （1）染色镜检是革兰氏阴性菌无芽孢杆菌。 （2）乳糖发酵产酸产气或产酸不产气。 （3）IMViC实验反应为 或 5.3沙门氏菌检验操作规程5.3.1增菌培养：取营养肉汤培养基3份，每份各100ml，2份分别加入供试液10ml，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作空白对照。培养18-24小时，空白对照应无菌生长。取其余2份培养液各1ml，分别接种于四硫磺酸钠亮绿培养基10ml中，培养18-24小时。5.3.2分离培养：分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门氏、志贺氏菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，于361培养18-24小时或延至40-48小时。检验平板上有无疑似沙门氏菌落。沙门氏菌在上述平板上典型菌落形态见下表：培养基菌落特征DHL琼脂无色至浅橙色，半透明，多数菌株菌落中心带黑色或几乎全黑。SS琼脂无色至浅橙色，半透明或不透明，有的菌株落中心带黑褐色。EMB琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落。麦康凯琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，有时中心暗色。 当阳性对照的平板上呈现阳性菌落时，供试品的平板上无菌落生长，或有菌落但不同于所列特征时，可判断为未检出沙门氏菌。 由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门氏菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意挑选。5.3.3初步筛选试验：如供试品平板上的菌落特征有与表所列菌落形态特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触菌落的中心部位，沾取选择平板的疑似菌落二个或更多个，划线接种于TSI琼脂斜面并穿刺底层。置361培养18-24小时观察结果。沙门氏菌在TSI琼脂斜面的反应为：斜面呈碱性（红色）底层呈酸性（黄色），硫化氢阳性（底层黑色）或阴性（无黑色）。而供试品疑似菌斜面未见红色、底层未见黄色，可判断为未检出沙门氏菌。否则，应继续做革兰氏染色、生化试验、动力检查与血清凝集试验。5.3.4生化试验：取沙门氏菌疑似菌株的TSI斜面培养物，做以下实验：5.3.4.1靛基质试验：用接种环沾取少量培养物，接种至蛋白胨水培养基中，照大肠杆菌试验方法项下操作，判断结果，沙门氏菌应为阴性反应。5.3.4.2尿素酶试验：用接种环沾取培养物，划线接种于尿素琼脂培养基斜面上，置361培养242小时。观察结果。如斜面变为红色为阳性反应，阴性反应不变色。沙门氏菌应为阴性反应。5.3.4.3氰化钾试验：取361培养20-24小时的疑似菌数营养肉汤培养液，用接种环沾取1环，接种至氰化钾培养基内，另取一环接种于对照培养基内。接种后即以橡胶塞塞紧，置361培养24-48小时，观察结果。对照管内有菌生长（浑浊）。试验管也有菌生长者为阳性（不受抑制），无细菌生长时为阴性（受抑制）。沙门菌应为阴性反应。应十分注意密封管口，夏天分装培养基宜在水浴中进行以防氰化钾分散，产生氢氰酸逸出，致使氰化钾浓度下降，细菌生长，造成假阳性。5.3.4.4赖氨酸脱羧酶试验：用接种环沾取少量培养物，接种在赖氨酸脱羧酶培养基中，试验管呈紫色时为阳性反应（赖氨酸脱羧产碱）；黄色为阴性反应。沙门氏菌为阳性反应。5.3.5动力检查：用接种针沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂培养基管，置361培养242小时.观察结果。有动力的细菌能运动到穿刺线外呈四周扩散生长。使培养基呈现浑浊蔓延现象；无动力的细菌仅沿穿刺线生长，周围培养基清晰。无动力表现的培养物，应在室温保留2-3天后，再观察。沙门氏菌除少数例外，均具有周身鞭毛，能运动。5.3.6血清凝集试验：在洁净载玻片近中心区的一端，以接种环沾取沙门氏菌属A-F“0”多价血清2-3环，再挑取TSI斜面上部的培养物少许，与血清混合（要小心操作，以防飞溅，污染四周），将载玻片前后侧动，在暗背景下观察结果。如为阳性反应，通常在5分钟内出现凝集现象。有时反应迟缓，需将玻片置培养器内，并在皿内放湿棉球一个，以防干涸，约过20分钟，再观察结果。凡与血清出现凝集者，应以生理盐水与同一菌株培养物作对照试验。对照应无凝集现象方可确定为阳性反应。当血清未出现凝集时，应以接种环上取上述斜面培养物，置于含少量生理盐水的试管中。制成浓菌悬液，在100水浴中保温30分钟，待冷，再作凝集试验。如出现凝集， 判为阳性反应；如不出现凝集，则为阴性反应。5.3.6.1结果报告及处理：凡疑似菌株培养物生化试验及血清试验结果按下表情况报告结果或提出进一步鉴定意见：序号血清凝集试验（A-F“0”血清）生化反应报告及处理意见凝集反应10030分钟凝集反应生理盐水对照1符合检出沙门氏菌2符合检出沙门氏菌3不符合未检出沙门氏菌4不符合进一步鉴定5不符合进一步鉴定6符合进一步鉴定5.4绿脓杆菌检验法5.4.1增菌培养：取胆盐乳糖培养基3份，每份各100nl。2份分别加入规定的量的供试液。培养18-24小时，空白对照应无菌生长。供试品如有绿脓杆菌生长，表层常有黄绿色或蓝绿色。有抑菌成分的滴眼剂等液体制剂，可取代供试品2ml，用薄膜过滤法过滤，并冲洗滤膜，将滤膜剪成2片，分别接种于2个100ml胆盐乳糖培养基上（与金黄色葡萄球菌同时检验时，取样4ml，过滤后剪成4片，分别置于二种培养在4个中），其中1个加入规定量的对照菌作阳性对照，置361培养24-48小时。5.4.2分离培养：以接种环沾取增菌培养液（如有菌膜，应挑取之），划线于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基平板，置361培养18-24小时。绿脓杆菌在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上的典型菌落为扁平无定形，边缘不齐，周边呈扩散现象，常互相融合，表面湿润，无光泽，呈灰白色。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝色。但亦有不产色素的菌株，菌落亦有粗糙型和侏儒型等。应注意挑选。阳性对照的平板呈阳性菌落，供试品分离平板若无菌落生长，可作出“未检出”报告。若生长，以接种针沾取2-3个疑似菌落培养物分别接种至营养琼脂基斜面上，置361培养18-24小时，取培养物革兰氏染色，并作氧化酶试验。5.4.3革兰氏染色镜检：取普通肉汤琼脂斜面培养物涂片，革兰氏染色，镜检。绿脓杆菌为革兰氏阴性菌、无芽孢杆菌，菌体长短不一，可呈多形性排列，成双或短链状。本品菌体一端有1根鞭毛，以总体观察，可见活泼动力，以鞭毛染色法，可见单偏鞭毛。5.4.4生化试验5.4.4.1氧化酶试验：取一小块白色洁净的滤纸片置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸片上，随即滴加1滴新配制的1%盐酸二甲基对苯二胺试剂，在30秒内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性；培养物不变色，氧化酶试剂为阴性。如证实为非革兰氏阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均可判为未检出绿脓杆菌。否则，应进行绿脓菌素试验。5.4.4.2绿脓菌素试验：取营养琼脂斜面培养物，接种在测定绿脓菌素用的PDP琼脂斜面上，置361培养24小时后，在试管内加氯仿3-5ml，搅拌培养基并充分振摇，使培养物中的色素提取在氯仿液内。待氯仿提取液呈蓝绿色时，静止片刻，用毛细管将其移至另一试管中，并在该液中加HCL（1mol/L）约1ml。振摇后，静置片刻，如HCL液层内出现粉红色，即为阳性；无粉红色出现，为阴性反应。试验同时应有空白对照试验。对阴性反应的培养物，应再接种PDP琼脂，置361培养2-3天后，再进行检查。上述实验结果中，绿脓菌素阴性反应的培养物，应继续进行以下试验。5.4.4.3硝酸盐还原产气试验：以接种环沾取营养琼脂斜面培养物，接种于硝酸盐胨水培养基中，置361培养24小时，观察结果。如在培养基的杜氏管中有气体产生，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将硝酸盐分解产生氮气。5.4.4.4 42生长试验：以接种环挑取营养琼脂斜面培养物于无菌盐水中，制成菌悬液，然后取菌悬液接种于营养琼脂培养基斜面上，立即置411水浴箱中培养24-48小时，斜面若有菌生长者为阳性；反之为阴性。5.4.4.5明胶液化实验：以接种针沾取营养琼脂斜面培养物，穿刺接种于明胶培养基内，置361培养24小时，取出放冰箱内10-30分钟，如培养基仍呈溶液状，即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者，为阴性反