多肽合成与生物活性肽课件

多肽合成与生物活性肽 1 多肽合成与生物活性肽 多肽合成与生物活性肽 2 一 多肽与多肽合成 多肽合成与生物活性肽 3 氨基酸 甘氨酸 Gly G 丙氨酸 Ala A 苯丙氨酸 Phe F 谷氨酰胺 Gln Q 天冬酰胺 Asn N 缬氨酸 Val V 亮氨酸 Leu L 异亮氨酸 Ile I 脯氨酸 Pro P 甲硫氨酸 Met M 半胱氨酸 Cys C 巯基 丝氨酸 Ser S 羟基 苏氨酸 Thr T 羟基 酪氨酸 Tyr Y 酚羟基 色氨酸 Trp W 吲哚基 谷氨酸 Glu E 羧基 天冬氨酸 Asp D 羧基 赖氨酸 Lys K 氨基 精氨酸 Arg R 氨基 组氨酸 His H 胺基 多肽合成与生物活性肽 4 多肽 蛋白质 氨基酸 首 尾 以酰胺键相连 相连的氨基酸数较少时称多肽 较多时称蛋白质 多肽 蛋白质 多肽合成与生物活性肽 5 人工合成胰岛素1965年 我国上海生化所 上海有机所和北京大学的科学家经过6年多的努力 在世界上首次人工合成具有生命活力的蛋白质 牛胰岛素 1953年合成八肽 催产素 获得了1955年诺贝尔化学奖 胰岛素由A B两个肽链组成 A链有21个氨基酸 B链有个30个氨基酸 A链和B链间由三个二硫键连接起来 多肽合成与生物活性肽 6 上面的氨基酸缩合脱水形成肽的反应式在生物体内的多肽 蛋白质的合成是成立的 但在人工合成多肽时 这一反应式是不能实现的 多肽合成与生物活性肽 7 液相法合成多肽 多肽合成与生物活性肽 8 固相多肽合成方法Merrifield在1962年开创了固相多肽合成法 并于1984年获得诺贝尔化学奖 固相多肽合成法的原理 用交联聚合物树脂作为载体 肽的合成在交联聚合物树脂内进行 共价固载于载体上 交联聚合物树脂在任何溶剂中都不能溶解 但在某些溶剂中可溶胀 这样反应物 催化剂等可扩散到树脂内部参与反应 每一步反应结束后 通过简单的过滤 洗涤 即可将剩余的反应物 催化剂 副产物等去掉 然后进行下一步反应 最后将合成的肽从树脂上裂解下来 多肽合成与生物活性肽 9 聚合 多肽合成与生物活性肽 10 功能基基化 多肽合成与生物活性肽 11 多肽合成与生物活性肽 12 固相合成 多肽合成与生物活性肽 13 固相合成的优点 可以用过量的反应试剂使反应完全 每步的产物都固定于不溶于任何溶剂的固相载体上 因此所需产物与其它过量试剂 催化剂等小分子试剂的分离可通过简单的过滤而实现 在裂解前的所有操作步骤中 固相载体始终处于同一容器中 没有任何机械损失 可以用大过量的反应试剂及催化剂 使每一步反应趋于完全 提高产率 使最后的产物的纯化更加容易 没有液相法中遇到的当肽链较长时不易找到合适的溶剂的问题 容易实现自动化 现已有自动化程度很高的自动多肽合成仪 多肽合成与生物活性肽 14 二 生物活性肽 多肽合成与生物活性肽 15 生物活性肽在生命活动中起着非常重要的作用 如胰岛素 生长激素 促肾上腺皮质激素 催产素等 许多天然活性肽或天然活性肽的类似物也是非常重要的药物 多肽作为药物具有如下优点 高效 专一 用量少如鲑鱼降钙素剂量为20 g 支 50000支 g 结构多变 随着各种生物技术和计算机模拟技术的发展 可得到具有各种功能的多肽药物如在计算机模拟的基础上 设计合成了治疗艾滋病的多肽药物T 20 FDA已批准200多种多肽和蛋白质药物的临床应用 代谢产物为无毒的氨基酸 多肽合成与生物活性肽 16 抗菌素的耐药性抗菌素的使用挽救了无数的生命 使人的预期寿命增加了十年以上 但随着抗菌素的使用 细菌也逐渐对其产生了耐药性 一个新药研制的平均周期是约10年 而一个新抗菌素临床使用后细菌对其产生耐药性的平均时间为约2年 一些超级细菌对目前使用的所有抗菌素包括被称为抗菌最后防线的万古霉素具有耐药性 细菌感染住院的患者中约7 由于耐药细菌感染而死亡 阳离子抗菌肽 多肽合成与生物活性肽 17 抗菌素的种类 内酰胺类大环内酯类喹诺酮四环素类氨基糖苷类磺胺类 多肽合成与生物活性肽 18 耐药机理 1 细菌变异细胞壁上抗菌素的结合部位 使抗菌素失去与细胞壁的结合能力 如万古霉素与细菌细胞壁粘肽末端的 D Ala D Ala结合 从而抑制细菌的某些生理功能 起到抑菌作用 多肽合成与生物活性肽 19 抗万古霉素的细菌则把 D Ala D Ala变异成 D Ala D Lac 使万古霉素对其失去结合力而不起作用 多肽合成与生物活性肽 20 2 通过分泌 内酰胺酶而破坏化学上很不稳定的 内酰胺类抗菌素的 内酰胺环 3 分泌某种酶修饰抗菌素上的某些基团如乙酰化羟基等 多肽合成与生物活性肽 21 阳离子抗菌肽 1981年Boman等人从西哥罗佩蛾 MothHyalophoracecropia 体中分离得到抗菌多肽天蚕素 cecropin Nature 1981 292 246 抗菌肽广泛存在于动植物体内 用来对付细菌 病毒和真菌等 已发现的抗菌肽已超过1000种 抗菌肽中都含有较多的碱性氨基酸 在生理条件下带净正电荷 因此也叫阳离子抗菌肽 多肽合成与生物活性肽 22 抗菌肽的阳离子部分与细菌的细胞膜 阴离子性磷脂膜 的磷酸基负离子结合 静电作用 多肽的疏水部分与细胞膜的碳氢链结合 疏水作用 从而起到抑菌作用 抗菌机理 多肽合成与生物活性肽 23 抗菌肽不易产生耐药性的原因由于阳离子多肽与细菌细胞膜的结合的特异性不高 细菌不易通过简单的变异或修饰多肽产生耐药性 抗菌肽的副作用大部分抗菌肽除具有抗菌活性外 对哺乳动物细胞也有毒性 如溶血活性 抗菌肽的抗菌活性和溶血活性都由多肽的两亲性引起 但一些抗菌肽具有溶血活性 而另一些抗菌肽没有溶血活性的现象不能达到满意的解释 多肽合成与生物活性肽 24 多肽合成与生物活性肽 25 多肽合成与生物活性肽 26 BC bloodcell H haemolymph E epithelialtissue M Zasloff Nature 2002 415 389 395 多肽合成与生物活性肽 27 TableCommercialdevelopmentofantimicrobialpeptidesofanimaloriginModeofusePeptideCompanyApplicationStageToticalMSI 78GenaeralInfecteddiabeticCompletedPhaseIII notfootulcersapprovedbyFDA pend ingadditionalstudiesToticalMBI 226MicrologixCatheterinfectionPhaseIIIToticalMBI 594MicrologixAcnePhaseIIOralIB 367IntrobioticsMucostisPhaseIIIOralP 113DemegenGingivitisPhaseIISystemicHeliomycinEntomedAntifungalPreclinicalSystemicHumanAMPharmAntibacterialPreclinicallavotoferricinSystemicBPIXomaMeningococcalPhaseIIImeningitisM Zasloff Nature 2002 415 389 395 多肽合成与生物活性肽 28 目前的研究热点 抗菌机理 溶血机理提高抗菌活性 抗菌活性不够高 因而用量较大减小链长 肽链较长时合成成本高 且免疫源性高较少溶血副作用 多肽合成与生物活性肽 29 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ NH2Melittin的氨基酸序列 蜂毒肽 melittin 类似物 我们的研究发现 蜂毒肽12 26残基片断基本保留抗菌活性 但溶血活性基本消失 蜂毒肽由26个氨基酸组成 具有很强的抗菌活性 同时还具有很强的溶血副作用 多肽合成与生物活性肽 30 Melittin的短缺肽及其类似物抗菌和溶血活性 多肽合成与生物活性肽 31 以M 12 26 为模板 逐个改变1 9位的疏水性GLPALISWIKRKRQQ NH2 结果 右侧氨基酸的疏水性增加 则其抗菌活性显著的增加 左侧氨基酸的疏水性增加 则其抗菌活性略有增加 右侧氨基酸的疏水性增加 则其溶血活性减小 左侧氨基酸的疏水性增加 则其溶血活性增加 多肽合成与生物活性肽 32 三 聚合物修饰多肽 蛋白质药物 多肽合成与生物活性肽 33 多肽 蛋白质药物的缺点口服生物利用率低消化系统各种蛋白水解酶的降解作用保存寿命短血液半衰期短血液及各器官中蛋白水解酶的降解作用 肾过滤清楚作用具有免疫原性不易穿透生物膜 多肽合成与生物活性肽 34 聚乙二醇 poly ethyleneglycol PEG poly ethyleneoxide PEO 特性 两亲性 既亲水又亲油 可溶于水和许多有机溶剂如卤代烃 链高度柔顺 无毒 可静脉注射 口服和外用高生物相容性 是已知聚合物中对蛋白质的吸附作用最小的聚合物 表面用PEG修饰可减小对蛋白质吸附 进而降低被RES的俘获和免疫反应 多肽合成与生物活性肽 35 多肽 蛋白质药物用PEG修饰 MainadvantagesofPEGylatedprotein 多肽合成与生物活性肽 36 ApprovedPEGconjugates 多肽合成与生物活性肽 37 ApprovedPEGconjugates continued 多肽合成与生物活性肽 38 PEG修饰多肽 蛋白质药物的作用柔顺的PEG链及其结合的水分子对多肽 蛋白质起到保护作用 减小蛋白酶对其的降解作用 PEG修饰使其分子量增大 减小肾过滤的清除作用 PEG的保护作用减小其免疫原性 PEG化后在更宽的pH和温度范围内更稳定 使多肽 蛋白质药物具有更高的疗效显著延长其血液半衰期副作用小保存时间长 多肽合成与生物活性肽 39 PEG分子量 支化对修饰多肽 蛋白质药物的影响PEG分子量愈大 则对多肽 蛋白质的保护作用愈大 血液半衰期愈长 免疫原性愈小 支化的PEG对多肽 蛋白质的保护作用比直链PEG的大 PEG化往往使多肽 蛋白质的体外生物活性降低 PEG分子量愈大 体外生物活性降低降低得愈多 PEG分子量的大小对多肽 蛋白质的保护作用的影响和对其体外生物活性的影响是相互矛盾的 多肽合成与生物活性肽 40 Interferon 2a的PEG化 ReactionmechanismofthesynthesisofPEG2 IFN P Bailon etal BioconjugateChem 2001 12 195 202 多肽合成与生物活性肽 41 InVitroAntiviralActivitiesofInterferon 2aandPEG2 IFN Interferon 2aPEG化后其血清半衰期增加了70倍 多肽合成与生物活性肽 42 Invivoantitumoractivityofinterferon 2a toppanel andPEG2 IFN bottompanel 多肽合成与生物活性肽 43 Growthhormone releasingfactor GRF 的PEG化 如果多肽中含有多个氨基 PEG化往往得到混合物 P Espositoa etal Adv DrugDeliveryRev 2003 55 1279 1291 PrimaryaminoacidsequenceofGRF 多肽合成与生物活性肽 44 InvitrobiologicalactivityofthetwoisomerscompositionGRF 1PEG5000andofthetwosinglemono PEGylatedisomers 多肽合成与生物活性肽 45 Biologicalstabilityinhumanpooledplasma 多肽合成与生物活性肽 46 多肽合成与生物活性肽 47 抗菌肽的PEG化Nisin用5000kDa的PEG修饰后抗菌活性完全丧失 A Guiotto etal IlFarmaco2003 58 45 50 多肽合成与生物活性肽 48 tachyplesin用5000kDa的PEG修饰 Y Imura etal Biochim Biophys Acta2007 1768 1160 1169 多肽合成与生物活性肽 49 PEG分子量 支化对修饰多肽 蛋白质药物的影响PEG分子量愈大 则对多肽 蛋白质的保护作用愈大 血液半衰期愈长 免疫原性愈小 支化的PEG对多肽 蛋白质的保护作用比直链PEG的大 PEG化往往使多肽 蛋白质的体外生物活性降低 PEG分子量愈大 体外生物活性降低降低得愈多 PEG分子量的大小对多肽 蛋白质的保护作用的影响和对其体外生物活性的影响是相互矛盾的 多肽合成与生物活性肽 50 PEG修饰降低生物活性的原因直接修饰在活性部位 PEG的位阻作用 从热力学原理分析 多肽的PEG化后其平动和转动熵的增加是使其活性降低的普适原因 多肽合成与生物活性肽 51 用大分子量PEG修饰多肽 文献中采用 粗线代表多肽 细线代表PEG 用小分子量PEG修饰强疏水性多肽的聚集和与受体的作用 多肽合成与生物活性肽 52 Self assemblyofPEGylatedpeptidesandshieldingeffectbyPEGshell 多肽合成与生物活性肽 53 多肽的固相合成及其PEG化 MAGLLALILWIKRKR NH2mPEG750 MAmPEG750 GLLALILWIKRKR NH2mPEG1100 MAmPEG1100 GLLALILWIKRKR NH2 多肽合成与生物活性肽 54 TEMimagesofmPEG750 MA a andmPEG1100 MA b aggregates 多肽合成与生物活性肽 55 DegradationprofilesofMA mPEG750 MAandmPEG1100 MAincubatedwithchymotrypsin 3 64 g mL atpH4 5and37 C 多肽合成与生物活性肽 56 DegradationprofilesofMA mPEG750 MAandmPEG1100 MAincubatedwith20 bovinecalfserumat37 C 多肽合成与生物活性肽 57 AntimicrobialactivitiesofMA mPEG750 MAandmPEG1100 MA 多肽合成与生物活性肽 58 药物的靶向释放 多肽合成与生物活性肽 59 药物的控制释放缓释在一定的时间内以较恒定的释放速率释放 药物的缓释不仅减少了给药次数 减小药物用量 提高疗效 还大大减小药物副作用 靶向释放使药物主要释放在病灶部位 而正常组织中的药物浓度很小 这样可使用很小的剂量而病灶部位仍可达到较高的药物浓度 这可大大降低某些毒性较大的药物如许多抗癌药对正常组织的毒性 低水溶性药物的释放一些药物的水溶性很小 很难直接给药 将药物负载于纳米载体内 通过纳米载体将其运送