毕业论文--莱茵衣藻酸敏感突变体的表型分析.docx

摘 要莱茵衣藻，大小为7微米到10微米，是当前最理想的纤毛类研究模式生物，部分原因是由于它易于培养和操纵其遗传学的能力，具体来说是因为（1）它具有很短的繁殖时间；（2）它是既是异养生物又是兼性自养生物；（3），它可以有性和无性繁殖；（4）它有丰富的遗传信息可用。虽然它没有神经细胞的支配，但是鞭毛能够通过精确的调控来应对不同的环境变化，而这种复杂精确的调控机制涉及很多领域的知识。本文意图找出对莱茵衣藻的生长运动和鞭毛情况有影响的酸浓度，为下一步研究酸性响应基因做基础。作为海洋生物及鞭毛模式生物的衣藻，面对二氧化碳浓度升高导致的海洋酸化，其纤毛发生酸化响应，导致能动性和长短的改变，影响细胞分裂及相关生命活动。因此，研究纤毛酸化响应的相关基因是很有必要的，这有助于我们了解酸化响应机制并且找出面对海洋酸化问题海洋生物的保护。本实验的研究内容主要有1、建立莱茵衣藻酸化响应基因突变体库。2、观察突变体库中对酸敏感并响应的突变株；3、取突变株15个和一个野生型作对照，固体培养基进行pH梯度筛选，找到抑制衣藻生长的酸浓度。4、96孔板中液体培养基不同pH条件下培养，观察衣藻运动情况和鞭毛情况。得出结论为：随着pH降低，突变体生长运动逐渐变缓。在选中的15个经过初筛的突变体中，编号44,2-37,3-41对酸十分敏感，7,90新，12-44对酸不敏感，其余对酸较为敏感。关键词：莱茵衣藻； 酸化响应； 鞭毛Abstract Chlamydomonas reinhardtii, the size of 7 microns to 10 microns, is the most desirable ciliate study model of the creature, partly because of its ability to easily cultivate and manipulate its genetics, specifically because (1) it has a short (3) it can have sexual and asexual reproduction; (4) it is rich in genetic information available. (2) it is both heterotrophic and facultative; Although it does not dominate the nerve cells, the flagellum can respond to different environmental changes through precise regulation, and this complex and precise regulatory mechanism involves many areas of knowledge.This paper intends to find out the acid concentration that affects the growth movement and flagellum of Chlamydomonas reinhardtii and make the basis for the next study of acid response genes.As a marine creature and flagellum model of the body of Chlamydomonas reinhardtii, in the face of increased carbon dioxide concentration caused by acidification, the cilia acidification response, leading to changes in activity and length, affecting cell division and related life activities. Therefore, it is necessary to study the related genes of cilia acidification response, which helps us to understand the mechanism of acidification response and to find the protection of marine organisms in the face of ocean acidification. The main contents of this study are to establish the mutant library of algae-lytic acid response gene. 2, to observe the mutation in the mutant library of acid and response to the mutant; 3, Fifteen mutants and one wild type were used as control, and the solid medium was screened by pH gradient to find the acid concentration that inhibited the growth of Chlamydomonas reinhardtii.4, 96-well plates were cultured under different pH conditions to observe the movement of Chlamydomonas reinhardtii and flagellum.It was concluded that the growth of the mutant gradually slowed down with the decrease of pH. Of the 15 selected mutants, numbered 44, 2-37, 3-41 were sensitive to acids, 7,90 new, 12-44 less sensitive to acids, and the rest were more sensitive to acids.Keywords: Chlamydomonas reinharda; Acidification response; flagellum III目 录绪 论1第1章 莱茵衣藻酸敏感突变体库的建立6第1节 相关材料6第2节 试验方法6第3节 结果分析7第2章 转化子筛选及表型筛选7第1节 相关材料7第2节 试验方法8第3节 结果分析9第3章 确定突变株生长适宜的酸浓度及变体株表型观察10第1节 相关材料10第2节 试验方法10第3节 结果分析14结 论16致 谢17参考文献18绪 论第1节 莱茵衣藻鞭毛研究的背景和意义11 学术价值 莱茵衣藻，大小为7微米到10微米，作为最理想的纤毛类研究模型，长期以来就受到研究者关注，虽然它没有神经细胞的支配，但是鞭毛能够通过精确的调控来应对不同的环境变化，而这种复杂精确的调控机制涉及很多领域的知识。现在 , 全球 100 多家著名实验室已建立了衣藻实验生物学研究体系及多个研究主题和相应的遗传系统 , 奠定了衣藻的学术地位。我所研究的酸化响应涉及鞭毛的组装和解聚，以及其相关基因和分子机制，具有很大的学术价值。12 应用价值 衣藻是一种单细胞绿藻,属于低等植物。基于衣藻在生物化学、遗传学、细胞结构等方面的优势,衣藻作为模式生物被广泛用于植物科学的研究中包括光合作用等。此外,衣藻具有两根以细胞微管为主形成的鞭毛。因此,衣藻也是研究细胞微管动态学变化的良好模式生物。纤毛解聚对细胞分裂的调控是近些年的一个重要发现，说明纤毛另一方面不为人熟知的作用，而作为海洋生物及鞭毛模式生物的衣藻，面对二氧化碳浓度升高导致的海洋酸化，其纤毛发生酸化响应，导致能动性和长短的改变，影响细胞分裂及相关生命活动。因此，研究纤毛酸化响应的相关基因是很有必要的，这有助于我们了解酸化响应机制并且找出面对海洋酸化问题海洋生物的保护。另外，纤毛是人体内广泛存在的一种细胞结构，体内的纤毛不仅可以提供运动的动力来源 , 推动呼吸道表面的黏液层向咽部运动 、推动生殖道内的卵子和精子细胞完成受精 , 还可以充当细胞感受器 , 感受周围环境中的信号变化并协助信号转导至细胞内。由基因缺陷或其他原因引起的纤毛结构异常和功能异常可导致多种纤毛相关疾病的发生它的缺陷与诸多人类疾病和发育异常密切相关，例如，肾囊肿、失明、失聪、失敏、内脏反转、肥胖、生殖不育，甚至肿瘤的发生等。因此，以莱茵衣藻这种模式生物来研究纤毛的酸化响应具有高效意义重大的优点。13 国内外研究现状莱茵衣藻（绿藻）是已经研究了“30年的基本模型和应用生理学与生物化学光合biflagellate微藻”。在此期间莱茵衣藻可用于操纵的资源数目大增。其中包括用于生长良好的操作方法，有性繁殖和诱变，以及公布了众多的生化分析和报告基因分析。支撑研究细胞生物学的各个方面衣藻库存中心，具有 300质粒， 2700株的集合。细胞核基因叶绿体的序列和线粒体基因组已经完成。由于现有的大量表达数据，以及社会各界的努力，约17万个基因都产生了研究成果。目前的核基因组数据库已经是93的完整版本。细胞代谢的复杂性，也可通过基因组范围的代谢模型进行很好的研究。近年来关于纤毛的研究一直是个热点。而纤毛的组装与解聚对纤毛的结构与功能是关键的，但是具体机制还了解的不多。纤毛轴丝的微管结构成分来源于胞质中的前体物质库（precursor pool），但是该前体物质库是如何调控的却了解很少。关于酸对于莱茵衣藻的影响据研究已经得知：1.pH5.0乙酸、300mMNaCl以及25mM、50mM和150mMNa2CO3胁迫均会引起莱茵衣藻光合色素降解，并且此种降解作用与光照条件无关。除叶绿素降解外，乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫还使莱茵衣藻的光合特性发生改变，Fv/Fm、Y()和ETR均发生了不同程度的降低；低强度胁迫使qP增强，而高强度胁迫则降低了qP；在一定时间内，所有胁迫处理均使NPQ增强。2.乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫均能诱导莱茵衣藻迅速产生大量的O2-和H2O2，当乙酸胁迫10min时，两种ROS含量均达到最大值；当NaCl和Na2CO3胁迫30min时，ROS含量达到最大值。在ROS含量升高的同时，细胞内SOD、POD和CAT活性也发生相应变化，其中低强度胁迫使这些酶的活性得到了不同程度的提高。3.莱茵衣藻在乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫处理后，对照株系CW-Arg及SGAT敲减株系T和A的SGAT酶活性均显著增强，Set和Gly含量升高，并且随NaCl胁迫强度增强，酶活性进一步增强、两种氨基酸含量进一步升高。虽然在正常以及乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫条件下，T和A株系的生长状况均弱于CW-Arg，但是在胁迫条件下，T和A株系受到的影响明显大于对照株系。这表明藻类植物的光呼吸途径与其抗逆性密切相关，逆境胁迫促进藻类植物的光呼吸途径运转，而光呼吸途径受阻后，藻类植物抵抗逆境胁迫的能力明显降低。4.采用抑制剂SHAM阻断乙醇酸-醌氧化还原酶系统或MOA阻断甘氨酸脱羧酶后，莱茵衣藻细胞内Ser含量明显降低，Gly含量明显升高，这表明其光呼吸途径的正常运转已受到明显影响。在NaCl胁迫条件下，经抑制剂处理的细胞所产生的ROS均明显少于未用抑制剂处理的细胞，其中SHAM处理后ROS含量最低，这表明SHAM阻断的反应即乙醇酸生成乙醛酸可能为光呼吸途径中ROS的产生位点。由于MOA处理阻断了甘氨酸向丝氨酸的转化，因此也影响了乙醇酸转化为乙醛酸，所以其ROS产量低于对照，但高于SHAM处理。采用NaCl胁迫SGAT敲减效果较强的A株系，由于丝氨酸向甘氨酸的转化被阻断，所以其ROS产生量也明显低于对照株系CW-Arg。这些结果表明，藻类植物的光呼吸途径也会导致ROS产生，其产生位点是叶绿体中乙醇酸经乙醇酸-醌氧化还原酶系统催化形成乙醛酸的反应。5.莱茵衣藻不能直接吸收利用外源L-Ser和L-Lys，而是通过胞外脱氨氧化的方式进行利用，并且此种脱氨过程依赖于氮饥饿，同时乙酸能促进此过程的进行。莱茵衣藻可利用L-Cys作为唯一氮源，其吸收量随胞外浓度增加或饲喂时间延长而增加，并且其被动扩散吸收过程不影响细胞对L-Leu的被动扩散吸收。6.pH5.0乙酸胁迫莱茵衣藻30min后，其DNA开始降解，在胁迫6h时DNA降解为150-350bp的片段。ZnSO4处理对此降解过程具有明显的抑制作用，并且1mMZnSO4的抑制作用明显强于0.5mM。在pH5.0乙酸胁迫1h和2h时，分别有10和95的莱茵衣藻细胞内出现呈TUNEL阳性染色的细胞核，在胁迫4h时所有的细胞内均出现此细胞核，这表明pH5.0乙酸可诱导莱茵衣藻细胞发生PCD。7.乙酸(34.3mM)在pH5.0时可诱导莱茵衣藻细胞发生PCD，而H2SO4、HCl、H3PO4、磷酸缓冲液和乳酸在pH3.0时才能诱导细胞死亡，这表明溶液酸度不是诱导PCD的主要原因，而与乙酸自身的性质有关。当溶液中含有50mM乙酸，pH为6.0时，细胞死亡；然而当乙酸浓度增加至150mM，pH为7.0时，细胞则不死亡，在此情况下，溶液中的乙酸主要以乙酸根离子形式存在，因此，细胞死亡与溶液中的乙酸根离子浓度无关，而与溶液的pH值和乙酸分子浓度同时相关。8.在pH5.0乙酸诱导莱茵衣藻发生PCD的过程中，VOCs大量释放，其中在2h时释放量最大，并且成分最多，主要包括有烷烃类、烯烃类、醛类、醇类、酮类、酯类和萜烯类等34种化合物。此外，300mMNaCl和150mMNa2CO3胁迫莱茵衣藻2h也可诱导其释放大量的VOCs。乙酸和NaCl胁迫均可诱导己醛(GLVs)释放，其峰面积分别为23.49107和3.14107；而Na2CO3胁迫则不能诱导己醛释放，其诱导的特异性成分是3，4-二甲基-己烷和5-甲基-2-庚烯。长叶烯是此三种胁迫诱导释放的主要萜烯类化合物，其峰面积分别为5.82107(乙酸)、3.11107(NaCl)和4.00107(Na2CO3)。9.将乙酸、NaCl和Na2CO3胁迫诱导的莱茵衣藻VOCs通入正常生长的莱茵衣藻溶液中，其细胞生长受到明显抑制，而其叶绿素含量、Fv/Fm、H2O2含量和抗氧化酶活性均不同程度增加，这表明非生物胁迫诱导的VOCs可能具有在藻类植物间进行信息传递的作用。第2节 莱茵衣藻基因重组转化的主要方法和研究进展衣藻是一种单细胞绿藻,属于低等植物。基于衣藻在生物化学、遗传学、细胞结构等方面的优势,衣藻作为模式生物被广泛用于植物科学的研究中包括光合作用等。此外,衣藻具有两根以细胞微管为主形成的鞭毛。因此,衣藻也是研究细胞微管动态学变化的良好模式生物。玻璃珠搅拌法利用基因枪法进行遗传转化时需要昂贵的仪器设备 , 而且在衣藻中进行真核转化时效果不佳 , 于是 Kindle等 仿照酵母的转化方法 , 尝试快速 、廉价的玻璃珠搅拌法 , 亦称“珠磨法”。其原理是将小玻璃珠和衣藻细胞共振荡 , 然后利用玻璃珠产生的瞬间剪切力快速撕开衣藻的细胞膜 , 从而导入外源基因。1989 年 , Kindle 等 通过玻璃珠 -外源DNA -衣藻共振荡技术 , 把硝酸盐还原酶基因导入去壁的 nitl -衣藻缺陷株中 , 恢复了该突变株的硝酸盐还原酶活性 , 并通过共转化把精氨琥珀酰裂合酶基因导入衣藻 nit1 突变株中。(共转化效率是 10 % 50 %)。他们的试验结果表明,采用0.5 mm玻璃珠,在(PEG)=0.05 的条件下 , 去壁衣藻和线性 DNA 共振荡约 15 s 可获得较好的转化效果，转化率达 103个转化株/ g 质粒 .线性 DNA 的转化率要高于超螺旋质粒,而具有同源序列也很重要。该转化方法建立后被许多实验室所采用 , 通过该法成功导入的外源基因有 ble 、aph 等。该方法具有价廉、无需特殊仪器、重复性好、转化频率高、整合基因的拷贝数低等特点 ,但需要去细胞壁的衣藻细胞。电穿孔法电穿孔法也叫电激法,它是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性,形成可逆的瞬间通道 , 外源 DNA 通过通道进入细胞。该法操作简单快速 、转化率较高,常用于细菌、植物和动物细胞的转化、融合。现该法已把 CAT 和GUS 基因转入胡萝卜、烟草、玉米、大豆 、矮牵牛、甘蔗、甜菜、水稻、小麦和土豆等植物中并获得瞬间表达。2002 年 , Ladygin 等通过电激法把潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)导入细胞壁缺陷的莱茵衣藻，在直交脉冲电压(1kv/ cm , 2ms)下把携带 hpt 基因的质粒导入衣藻 , 光照培养 16 18h 后,在10 mg/ L 的潮霉素B 平板上进行筛选 , 转化率是 103 个转化子/106 个受体细胞,接近“珠磨法”的转化率。对照试验表明 , 去壁衣藻比野生型衣藻的转化率高。hpt 整合进衣藻核基因组后 , 可以在衣藻中稳定表达和遗传。通过电穿孔来转化单细胞的方法称为电转化方法，常用于属于绿藻藻类的莱茵衣藻中。菌株CC3395和CC425，细胞壁较少突变体缺乏精氨琥珀酸裂解酶（由编码的电穿孔ARG7），在质粒pJD67（其中包含的存在ARG7）用于优化条件于将外源DNA的。变化的条件包括渗透压，温度，外源DNA浓度，电压和电容。优化后，获得的最大转化频率为每微克DNA2105个转化体;该频率比使用玻璃珠引入外源DNA的当前标准方法获得的高两个数量级。玻璃珠转化程序最初被开发用于将DNA引入酵母中，尽管方便，但通常导致转化效率低（200转化子/gDNA）。电穿孔或乙酸锂/单链DNA /聚乙二醇方法可以产生酵母中106个转化体/gDNA的转化频率。我使用的转化方法就是电转化方法，而核转化所使用的筛选表及是营养缺陷型受体藻恢复生长所依赖的基因，入能合成精氨酸-琥珀酰裂解酶基因，获得外源精氨酸-琥珀酰裂解酶基因转化的精氨酸缺陷型受体藻，能在无精氨酸平板上生长，形成藻落。其余研究方法如提质粒、PCR、电泳、液体或固体培养基培养、显微镜观察等等。本实验的技术路线就是一个正向遗传学的思路，即建突变体库，从中找的酸敏感藻株，通过TAIL PCR找到其突变基因，大量克隆并研究其作用。我所做的部分可行性很高，不仅因为实验室体系成熟，并且衣藻在分子水平上可操作性强，大量文献也有技术上的支持。第3节 本实验的研究方法及技术路线31 研究方法 1、建立莱茵衣藻酸化响应基因突变体库。2、观察突变体库中对酸敏感并响应的突变株；3、取突变株15个和一个野生型作对照，固体培养基进行pH梯度筛选，找到抑制衣藻生长的酸浓度。4、96孔板中液体培养基不同pH条件下培养，观察衣藻运动情况和鞭毛情况。32 技术路线建立突变体库观察并找到对酸敏感并响应的突变株设计pH梯度培养基找到抑制衣藻生长运动的酸浓度观察莱茵衣藻生长运动情况及鞭毛验证并完成论文。第4节 论文的内容安排 水体酸化已成为现今世界广为存眷的情况成绩之一，除无机酸外，无机酸也是惹起情况酸化的主要缘由，个中乙酸是无机酸的重要成份，普遍存在于天然界中，其含量可高达毫摩尔程度，对藻类植物的发展具有伟大的潜伏威逼。除酸化外，干旱和半干旱地域的水体因为过度蒸发而存在分歧水平的盐碱化，所以藻类植物还面对着盐碱化的影响。是以，鉴于酸化和盐碱化正日益严重，日趋影响着水域生态体系均衡与情况平安，本文以单细胞形式植物莱茵衣藻为试验资料，从莱茵衣藻酸化响应突变体库的建立开始，按照时间和具体操作顺序叙述我所进行了的大学生毕业设计。正文部分除绪论外主要会涉及到突变体库的建立、转化子筛选、表型筛选、设pH梯度及表型鉴定。第1章 莱茵衣藻酸敏感突变体库的建立及转化子的筛选第1节 相关材料11 模板及试剂 野生型莱茵衣藻：21gr（由清华大学潘俊敏教授馈赠）；载体：pSI103；抗生素：巴龙霉素；限制性内切酶：Kpn1；醋酸钠，无水乙醇，氯仿，70%乙醇；培养基：添加了巴龙霉素的TAP，TAP。12 实验仪器 超净工作台，恒温水浴锅，摇床，高压灭菌锅，琼脂糖电泳仪，高速离心机，冰箱，电击杯，电穿孔仪，搅拌器，旋涡混合仪等。第2节 实验方法21 技术路线收集莱茵衣藻细胞质粒线性化线性化质粒提纯电转化22 收集莱茵衣藻细胞 在加入10Tween-20溶液1/2000（v / v）之前，将细胞培养物在冰上冷却;这有助于细胞核细胞的沉淀。通过在4下以800g离心5分钟收集细胞，并将其重悬于含有指定浓度（通常为40mm）蔗糖的Tris乙酸磷酸盐（TAP）培养基中，最终密度为1108至4108个细胞。23 pSI103质粒的线性化体系(100l)：pSI103=10l(200g/ml)，KpnI=4l,buffer=10l,ddH2O=76l。加去离子水76l于1.5mlEP管中，加入质粒pSI103 10l，KpnI 4l,buffer 10l，混匀，4000rpm，离心30s，甩至管底。37，保温酶切3h。之后放置于65的水浴锅中20min让限制性内切酶失活终止酶切。24 线性化质粒提纯 具体操作为：1.将完成酶切的体系跑0.8%的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收线性化的质粒于2.0的EP管中。2.在EP管中加入300L灭菌双蒸水，然后加入相同体积的酚氯仿（11），混匀放于室温下5min；12000rpm，离心6min，将上清液吸到另一个新的离心管里；3.加入1/51/10的3mol/L的乙酸钠（pH=5.2），然后加进22.5倍体积的无水乙醇，混匀放于室温等待30min后；12000rpm离心10min，使线性化的质粒沉淀；4.撇去上清，加入1mL70%的乙醇，室温里作用12h后灭菌；12000rpm，离心5min，于超净台内丢弃上清，干燥后，加入TE或灭菌双蒸水溶解。5.用紫外分光光度计测定其OD260和OD280，计算其含量与纯度。24 电转化 在标准条件下，将200g/ ml质粒pSI103（Kpn线性化，含巴龙霉素抗性基因）和野生型21gr细胞悬液混合。将250l的细胞悬浮液置于具有4mm间隙的一次性电穿孔试管中，然后将其浸入水浴中保持特定的温度。使用电穿孔装置将样品的指数电脉冲（通常在1900和2400V / cm之间）应用于样品。除非另有说明，电容设置为10F，不使用分流电阻。值得注意的是，在收集细胞和施加电场之间经过不到1小时。第3节 结果分析 图1.TAP+巴龙霉素+正常电转化 转化结果正常，莱茵衣藻细胞菌落在光照培养条件下长势良好。第2章 转化子筛选及表型筛选第1节 相关材料11 模板及试剂 野生型莱茵衣藻：21gr（由清华大学潘俊敏教授馈赠）；电转化完成的细胞悬液；抗生素：巴龙霉素；培养基：添加了巴龙霉素的TAP，TAP。12 实验仪器 超净工作台，恒温水浴锅，摇床，高压灭菌锅，琼脂糖电泳仪，高速离心机，冰箱，搅拌器，旋涡混合仪，96孔板等。第2节 实验方法21 技术路线电转化涂板转化子筛选表型筛选观察记录与储存。22 电转化涂板电穿孔后，从电穿孔装置中取出试管，并在25水浴中孵育至少5分钟（不超过60分钟），并通过淀粉包埋法（如下所述）将细胞悬浮液的等分试样铺在固体培养基（TAP-0.5琼脂糖，10g/ml巴龙霉素）上，用涂布器涂抹均匀。每电转化一次涂6个小板（70mm）。23 转化子筛选 设置空白对照即涂电转化的莱茵衣藻细胞悬液于不含巴龙霉素的固体培养基上。同时设置负对照即将没加外源DNA的电转化细胞悬液涂于添加了巴龙霉素的TAP培养基上。将4和2的转化混合物重复铺板以确定转化频率。控温于25-29之间并用 80mol光子m-2sec-1的荧光管照射板照射。淀粉包埋法：用蒸馏水和乙醇依次洗涤玉米淀粉。将洗涤的淀粉储存在75乙醇中以防止细菌污染。在每次实验之前，通过重复离心和再悬浮，用TAP-蔗糖培养基代替乙醇。将淀粉最终在TAP-蔗糖培养基中再悬浮至20（w / v），加入聚乙二醇8000至0.4（w / v）;后者促进淀粉在平板上平滑均匀地分布。将1ml的淀粉悬浮液用合适体积的电穿孔细胞悬浮液（0.5-50l）铺展在9cm直径的培养皿中的固体培养基的顶部。恒温培养箱中光照培养一段时间，能在含巴龙霉素的TAP固体培养基上生长的莱茵衣藻细胞为转化成功。24 96孔板中表型筛选 从EP管中挑取微量的含巴龙霉素的TAP固体培养基上生长的单个莱茵衣藻细胞菌落加入新的含1ml蒸馏水的1.5mlEP管中，充分稀释混合均匀制成浓度一定的的细胞悬液。在倒置显微镜下观察，得到浓度适中的莱茵衣藻细胞悬液即可。吸取一定量新鲜TAP液体培养基pH6.0到干净的加样槽中，用排枪向调0孔和边缘孔每孔加100l培养基，再吸取配好的细胞液到加样槽中，每个实验孔加100l细胞液。在实验记录本上记录下具体的突变株编号，并将96孔板用封口膜密封后放在摇床上慢摇并光照培养，培养四天时间。25 观察并确定对酸敏感并响应的莱茵衣藻突变株 将培养了一段时间的96孔板放置于荧光倒置显微镜下观察，找出能够生长运动的突变株，标号并记录。将96孔板中的每个孔中吸取20l于1.5ml的EP管中，加双蒸水稀释50倍，吸取微量加入洗净的血球计数板中观察并记录。26 莱茵衣藻突变株的储存 制备TAP固体培养基，灭菌后超净工作台中分装于2mlEP管中。将对酸敏感并响应的莱茵衣藻突变株接种到2mlEP管中，密封并标号。将小管放置于光照下恒温培养。第3节 结果分析 图2.TAP+正常电转化(空白对照) 图3.TAP+巴龙霉素+无外源DNA的电转化（负对照）以上为电转化结果，图1为正常结果，可挑取衣藻生长菌落进行接下来的实验，图2和图3为对照，证明图1的的准确性。 图5 图6 以上为表型筛选结果，绿色深的为成功转化的酸敏感突变株。第3章 确定突变株生长适宜的酸浓度及变体株表型观察第1节 相关材料11 模板及试剂 野生型莱茵衣藻：21gr（由清华大学潘俊敏教授馈赠）；突变株：5、7、44、78、88、90新、110、123、150、181、284、298、2-37、3-41、12-44；培养基：TAP；冰醋酸。12 实验仪器 超净工作台，恒温水浴锅，摇床，高压灭菌锅，三角瓶，玻璃棒，高速离心机，冰箱，搅拌器，pH计，分析天平，96孔板，容量瓶等。第2节 实验方法21 制备TAP固体培养基 1、TAP salts组分用量（g/L）NH4ClMgSO47H2OMgSO47H2O15.04.02.0 2、 phosphate solution组分用量（g/100ml）K2HPO4KH2PO428.814.43、 Hutners trace elements 组分用量（/L）Nitrilotriaceticacid(NTA)MgSO4 7H2OCaCl2 2H2O(NH4)6Mo7O24 4H2OFeSO47H2OMetals 44 ddH2O 10.0g29.7g3.335g9.25mg99.0mg50.0ml950.0ml培养基(1L)：2.42g Tris25ml solution #1 (salts)0.375ml solution #2(phosphate)1.0ml solution #3 (trace elements)1.0ml glacial acetic acid15g agar(solid medium) 制备母液1,2,3各500ml，放置于容量瓶中，高压灭菌冰箱储存。取一个500ml锥形瓶，加入约100ml蒸馏水，加入转子，将锥形瓶放在磁力搅拌器上缓慢搅拌。用分析天平称取0.726g Tris倒入锥形瓶中，加入7.5ml母液1,0.1125ml母液2,0.3ml母液3，0.3ml冰醋酸，琼脂4.5g。加蒸馏水至300ml，搅拌均匀后取出转子，关闭磁力搅拌器。取6个100ml锥形瓶，将刚配好的300ml培养基均分，每个锥形瓶50mlTAP培养基，标号16，用冰醋酸调节pH分别为6.0,6.2,6.4，6.6,6.8,7.0。封口膜密封后高压灭菌。 其中pH计使用前需要进行校准，具体步骤为：1.校整：将开关调节到pH位置；打开电源,预热大约30分钟；预备一个放蒸馏水的小烧杯,用滤纸轻柔吸走玻璃电极上的残留水珠。在小烧杯内放进选择好的,已经知道pH的标准缓冲液.使电极完全没入。要千万注意将玻璃电极端部小球和甘汞电极的毛细孔完全浸在溶液里。慢慢地摇小烧杯让电极碰到的周围溶液呈均匀状态；以标准缓冲液的pH为准,把机器的量程控制在0-7或7-14之间；调控温按钮,让仪器显示出来的温度和室温一样；调节零点,将它调节在pH=7；轻缓地按下或慢慢的转动读数开关让开关适当卡住。调动定位钮,让指针正正好指在标准缓冲液的pH数值的地方。放开读数开关,不断地重复去操作,一直到数字稳定了为止；校整后,千万不要再动定位旋钮,否则就会要重新校整。拿走盛标准液的小烧杯,之后用蒸馏水不断地冲洗电极。2.测量：把电极上多出来的水吸干或者用想要测pH的溶液冲洗几次,然后把电极完全放在想要测量的溶液中,要千万注意将玻璃电极端部小球和甘汞电极的毛细孔完全浸在溶液里。慢慢地摇小烧杯让电极碰到的周围溶液呈均匀状态；想要测量的溶液的温度应该是和标准缓冲液的温度相同；校准零位,按开读数的开关,指针所指的数值就是待测液的pH.如果量程显示pH=0-7而指针读数超过了刻度,就应该吧量程开关重新调节设置到pH=7-14，然后再进行测量；量完了之后,放开读数开关,指针必须回到pH7,否则就需要重新调整；如果能正常回到pH7，就可以关闭电源,把电极冲洗干净,用前面所说的一样的办法去浸洗。我们实验室用的电极是复合电极,优点是使用的时候很方便,不受氧化性或者是还原性物质的影响,测量的时候速度算是比较快的。使用的时候,要把电极加液口上套着的橡胶套和橡皮套拿下来,这样可以更好地保持电极里氯化钾溶液所形成的液压差。需要注意的是：复合电极不用的时候,可一直放在3M的氯化钾溶液里。一定不可以用洗涤液或者其他吸水性的试剂清洗；使用之前,要检查玻璃电极前面顶端的球泡。正常情况下,电极是通透的而且不会出现裂痕；球泡里应该要充满了溶液,不可以有气泡的存在.22 莱茵衣藻的接种灭菌完毕后待冷却，将锥形瓶和培养皿放于超净工作台中无菌操作。打开酒精灯，双手喷上95%的酒精，将配置好的固体TAP培养基倒入底部已经划线标好突变株和野生型编号的30mm培养皿中，每个pH梯度的培养基倒3个平板，每个平板约15ml，共得到18个平板。pH分别为6.0的3个,6.2的3个,6.4的3个，6.6的3个,6.8的3个,7.0的3个。待培养基凝固后，将接种环用酒精灯外焰高温灭菌后，接种相应型号莱茵衣藻于培养基中，分别为5、7、44、78、88、90新、110、123、150、181、284、298、2-37、3-41、12-44这十五个突变株和21gr着一个野生型。用parafilm封口膜将培养基密封后光照培养一周。23 制备TAP液体培养基 取两个500ml三角瓶，每个加入约100ml蒸馏水，加入转子，将锥形瓶放在磁力搅拌器上缓慢搅拌。用分析天平称取0.726g Tris倒入三角瓶中，加入7.5ml母液1,0.1125ml母液2,0.3ml母液3，0.3ml冰醋酸，琼脂4.5g。加蒸馏水至300ml，搅拌均匀后取出转子，关闭磁力搅拌器。标号1和2，用冰醋酸调节pH分别为6.0和7.0。过滤灭菌后存放于500ml容量瓶中。24 96孔板接种衣藻细胞2.4.1 配细胞液 从EP管中挑取微量的莱茵衣藻细胞加入新的含1ml蒸馏水的1.5mlEP管中，充分稀释混合均匀制成浓度一定的的细胞悬液。在倒置显微镜下观察，得到浓度适中的莱茵衣藻细胞悬液即可。2.4.2 种板 吸取一定量新鲜TAP液体培养基到干净的加样槽中，用排枪向调0孔和边缘孔每孔加100l培养基，再吸取配好的细胞液到加样槽中，每个实验孔加100l细胞液。其中pH=6.0的TAP培养基加了42个，pH=7.0的TAP培养基加了42个。在实验记录本上记录下具体的突变株编号，并将96孔板用封口膜密封后放于光下培养。2.4.3 培养 将种好的细胞板放在摇床上慢摇并光照培养，培养四天时间。25 观察并记录突变株的运动和鞭毛情况 将96孔板置于倒置显微镜下，观察并记录对酸敏感并响应的莱茵衣藻突变株的运动情况和鞭毛长短。第3节 结果分析 图6.pH=7.0 图7.pH=6.8 图8.pH=6.6 图9.pH=6.4 图10.pH=6.2 图11.pH=6.0图12.96孔板从图6-图11可以看出，莱茵衣藻可以在pH6.0以上生长，但当pH降低至6.0时，无论是突变株还是野生型都难以生长。将图12中的96孔板在倒置显微镜下对比野生型21gr观察发现，随着pH值得下降，衣藻细胞的运动速度逐渐变缓，鞭毛长度减短。 统计结果为：结 论通过对莱茵衣藻野生型21gr的电转化和验证得到了对酸敏感并响应的突变株，并由此建库。通过优化莱茵衣藻的电击转化条件，获得5000个转化子，筛选获得90多个酸化敏感突变体，建立了一个小的酸化敏感突变体库。可以得出以下结论：1.大部分经过初筛的突变体在pH=6.0及以下难以生长。2.随着pH降低，尤其是当降低至pH=6.0及以下时，突变体运动逐渐变缓。3.可能是由于样本数量较小，虽然可以确定酸浓度对衣藻鞭毛长短有影响，但不能得出其具体关系。4.在选中的15个经过初筛的突变体中，编号44,2-37,3-41对酸十分敏感，7,90新，12-44对酸不敏感，其余对酸较为敏感。致 谢 本论文是在飞机楼610病毒寄主分子互作实验室李桂华老师的亲切关怀和悉心指导下完成的，他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。李老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向李老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。我还要感谢在一起愉快的度过毕业论文小组的同学们，正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个一个的困难和疑惑，直至本文的顺利完成。同时感谢实验室的秦老师为我提供了这样一个好的实验平台，让我能够在这里完成自己的毕业实验，同时秦老师您那平易近人的性格，也为我们做了一个很好的榜样。还有实验室众多的师兄师姐不仅在实验上对我帮助颇多，而且在科研态度和方法上给予我众多启示。还有许多人，也许他们只是我生命中匆匆的过客，但他们对我的支持和帮助依然在我记忆中留底了深刻的印象。在此无法一一罗列，但对他们，我始终心怀感激。四年大学生活，所收获的不仅仅是愈加丰厚的知识，更重要的是在阅读、实践中所培养的思维方式、表达能力和广阔视野。很庆幸这些年来我遇到了许多恩师益友，无论在学习上、生活上还是工作上都给予了我无私的帮助和热心的照顾，让我在诸多方面都有所成长。感恩之情难以用语言量度，谨以最朴实的话语致以最崇高的敬意。参考文献1ZhangfengHu,YinwenLiang,WeiHe,潘俊敏.纤毛解聚的双步调控机制J.科学新闻.2016(01)2刘盖,黄开耀.磷酸化调控纤毛的解聚J.中国科学:生命科学.2015(07)3曹木青,潘俊敏.纤毛及纤毛相关疾病研究进展J.中国细胞生物学学报.2012(09)4秦琅,朱毅.莱氏衣藻鞭毛研究进展J.首都师范大学学报(自然科学版).2012(01)5李建成,彭世清,胡章立. 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