细胞分选技术.ppt

StemCellTechnologiesInc 细胞分选产品 细胞分选和基本原理 细胞分选是把一种细胞从多细胞样品中分离出来用抗体标记细胞 同时被用的抗体被萤光标记或连接免疫磁珠或其它利用萤光和免疫磁珠的特性来分离细胞 细胞分选常用方法 密度梯度离心 Ficoll 离心抗体标记分离免疫密度离心免疫磁珠流式 正选和负选 正选只需要一种抗体分离出的细胞纯度高对于比例小的细胞群 正选容易得到高纯度 正选和负选的比较 优点 负选需要的细胞没有被抗体等标记对需要的细胞 不需要特异性的细胞标记 缺点 需要多种抗体标记不需要的细胞 需要特异性的靶细胞标记可能引起细胞活化 细胞分选产品 StemCellTechnologiesInc 的细胞分选原理 利用抗体四聚体 TetramericAntibodyComplex TAC 来分选细胞 适用于人的全血细胞样品是一种负选方法基本原理 抗体标记和免疫密度离心法需要的仪器 离心机 DirectLabelingofHumanCells 不需要的细胞 离心 把细胞样品置于密度分离液上 分选的过程 收集 的密度分离液DM L 为了最大限度回收淋巴细胞 StemCell专门研制了一种适合RosetteSep 的密度分离液 DM LDM L的密度 1 081g mLDM L的渗透压与人外周血的渗透压相同 iso osmolar 适用于以下的淋巴细胞分选 CD3 Tcells CD8 TcellsCD4 Tcells Bcells DensityofFreshLeukocytes From CentrifugationTechniquesIII NycomedAmersham MonocytesLymphocytesBasophilsNeutrophilsEosinophilsErythrocytes 1 0601 0701 0801 0901 100Densitying mL DM L 1 081g mLFicoll 1 077g mL 低温冷藏的外周血单个核细胞 人和小鼠 脾细胞 负选 只需要离心机可以同时分选多份样品取决于离心机的容量分选的细胞量在106cellsinEppendorf 109cellsin50mLtube适用于低温冷藏的人外周血单个核细胞 PBMC 和小鼠脾细胞 的特点Sep 直接标记人的细胞 Anti cellAnti particle TetramericAntibodyComplex TAC DenseParticle 1mm UnwantedCell 间接标记小鼠的细胞 TetramericAntibodyComplex TAC BiotinylatedAntibodyAnti Anti BiotinParticle DenseParticle 1mm UnwantedCell SpinSep的分选过程 LabelLayer SpinCollect AntibodyCocktailAnti BiotinTAC mouseonly DenseParticles 4 LayeroverSpinSep DensityMediumSpin10 20minat1200 xg Collectalmostentirevolume7 WashtoremoveDensityMedium 的细胞分选资料 人的外周血细胞 PBMC 小鼠的脾细胞 Valuesarethemean SD 新型 高效 易行的免疫磁珠分选技术新 不用柱子 只需用磁极 所用的磁珠很小高效 效率 分选过程不用洗细胞 省时省力 效果 分选的细胞纯度高易 操作过程简单易行广 可做正选和负选适应性强 在理论上可以分选任何一种细胞 Anti Anti CellParticle TetramericAntibodyComplex TAC MagneticNanoparticle 160nm 直接标记人的细胞 Cell MagneticNanoparticle 160nm TetramericAntibodyComplex TAC Biotin FluoAntibodyAnti Anti biotin FluoParticle 间接标记小鼠细胞 Cell RelativeSizesofMagneticParticlesusedinCellSeparation Cell 的细胞分选过程 正选资料 人的外周血细胞 PBMC 小鼠脾或骨髓细胞 负选资料 人的外周血细胞 PBMC 小鼠脾细胞 可正选或去除任何一种细胞 PE标记的抗体分选KitFITC标记的抗体分选KitBiotin标记的抗体分选Kit Cell 细胞分选常见的问题 分选方法的选择样品种类样品数量每次需要分选的细胞数 常见问题 样品的前处理Ficoll离心机全血和单采的细胞细胞计数稀释液细胞数 常见问题 分选过程中细胞浓度缓冲液细胞混匀动作要点 CalculatingPurityandRecovery Purity desiredcellsinenrichedfractionx100 totalnucleatedcellsinenrichedfraction oftotaleventsinthedesiredcellgate FACSprofile Recovery desiredcellsinenrichedfractionx100 desiredcellsinstart purityinenriched x totalnucleatedcellsinenriched x100 purityinstart x totalnucleatedcellsinstart FACSGate panNK SelectedfromMoSpleen Start NK Selected Dataanalysis 的技术要领 细胞稀释后 用吸管混匀细胞 不要倒置试管 倒出未标记的细胞时 让液体连续流淌 试管停留