微生物发酵法生产腺苷的研究进展.docx

2013中国生物发酵产业年会微生物发酵法生产腺苷的研究进展刘碉何菊华徐庆阳张成林谢希贤陈宁天津科技大学生物工程学院天津300457幸通讯作者Email：ningchtL塔teducn；电话：0226060125 1【摘要】腺苷(Adeno渤e)属于重要的核苷酸衍生物，是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物。 作为一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能 量代谢。在美国，腺苷是FDA批准的治疗阵发性室上性心动过速(ParoxySnul supnven仃iculartachycardja，PsVT)的一线药物，已成为急诊处理快速性心律失常和药物负荷试验的常规 用药。本文简单综述了腺苷的基本性质，生产方法和发酵过程优化的研究进展。【关键词】腺苷发酵法菌种选育发酵过程控制AdVance in ProductiOn Of adenosine by MicIobial FermentationLiu Y-ue，He Ju-hua，Xu Qing-yang，ZhaIlg Cheng-1in，Xie Xixian，Chen Ning(College ofBiothcllllolog)，Ti砌in UniVers时ofScience锄d Tecllllology，Ti觚jin 300457)枣Co玎esponding author E-nlail：ningchtusteducn； Tel： 0226060 1 25 l【Abstract】Adenosille is柚inlponant nucleoside d嘶vative and a breal(down product of AMPAdenosine as an endogenous nucleoside，directly into the1yocardimn generated through phospho巧lation and inVolved iIllyocardial energy me切bolismIn America，adenosine is an FDA印proVed仃ea缸Ilent for paroXysmal supra【ventricular tachyc踟rdia(Paroxysmal supraVen仃icular tachycardia，PSVT)first-1ine dmgs and has become theeme唱ency仃e釉ent of tachyarrh灿ia and dmg load test routine medicationThis p印erbrieny reViewed me basic nature， production methods andtlle跃IVance in optimization offementation process【Keywords】AdenosiIle；fementation memod；breeding of producing s乜ain；engineering；fementation process optimization腺苷(Adenosine，简称AR)是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物，临床上腺苷作为一 种血管舒张剂被有效地用于治疗，也可以作为抗心律不齐的药物，其最大的优点是具有 较短的血浆半衰期【11。第一部分氨基酸篇日本早在70年代就开始了发酵法生产腺苷的研究，并取得了一系列成果，迄今已 进入大规模工业生产阶段。国内发酵法生产腺苷的起步较晚，目前只有少数几家研究单 位进行研刭2_】，随着腺苷的应用越来越广泛，有必要对其进行更深入的研究。 1腺苷的的基本性质及生产应用现状11腺苷的基本理化性质 腺苷(Adenosine)，又名腺嘌呤核苷，化学名为9pD呋喃核糖基腺嘌呤，相对分子量26724，分子式为CloHl3N504。腺苷是一种白色或类白色结晶性粉末，无臭，味苦。 熔点23抛35。易溶于水，几乎不溶于乙醚、氯仿、乙醇【4】。pH l2时最大吸收波 长为九maX=257衄(01mo儿HCl)，260砌=146103；最小吸收波长为入埘n=230衄。吸光度比值A250A260_084，A280A260=022，A290A260-003【5J。 12腺苷的主要用途腺苷是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物，是重要的核苷酸衍生物，普遍存在于生物体 中，在生理生化过程中起着重要的调控作用，具有广泛的药用价值。早在1929年，Dm巧 和SzentGy6哂就描述了腺苷类物质在心脏和血管中的潜在应用【6】。腺苷是经FDA批准的转复阵发性室上性心动过速(PSVT)的一线药物，也是经FDA批准的用于心脏药物 负荷试验的两种药物之一，已成为急诊处理快速性心律失常和药物负荷试验的常规用药。 腺苷除了可以用作治疗心脏的特效药物之外，还是多种药用核苷类物质合成的前 体，例如治疗心脏功能不全、脑动脉硬化及肌肉萎缩等症的三磷酸腺苷(ATP)，治疗恶 性肿瘤药物的8一氮腺苷，对眩晕，高血压，肢麻，耳鸣，特别是对基底动脉供血不足引 起的一些临床症状有明显的疗效的环菌素。此外，腺苷的6位取代衍生物将来可能发展 成为新类型的抗病毒、抗艾滋病药，如6氯腺苷是合成许多嘌呤类核苷的重要中间体。13腺苷的生产概况 腺苷作为药物，也首先由日本于1989年投入美国市场，随后又在法国、比利时、英国等多个国家获得批准。目前我国发酵法生产肌苷和鸟苷已达工业化规模，年产量分别在千吨 以上和数百吨左右。但腺苷的生产依然主要依靠化学法和酶法，成本高，污染重，不易大规 模推广。发酵法生产腺苷起步较晚，仅有几家公司可以利用直接发酵法生产腺苷并达到工业 化规模，比如江苏诚意药业有限公司，与国外相比，腺苷的生产效率明显不高，所以当前亟 待解决的问题是通过菌种的改造以及发酵工艺的优化提高腺苷生产菌的生产能力。 2腺苷的生产方法现今，腺苷的生产方法主要有三种，RNA水解法、化学合成法和发酵法。随着发 酵法直接生产腺苷条件的不断成熟，其成本优势越发凸显，因此将会是今后腺苷生产的452013中国生物发酵产业年会发展方向。21 RNA水解法IA水解法是用糖类原料培养出酵母菌体，由菌体分离RNA后，水解IA得到 肌苷酸(IMP)，再通过IMP合成腺苷。但是IA的降解过程中会产生4种核苷酸的混 合物，给后面的分离提取过程带来了非常大的难度，而且增加了成本。22化学合成法 化学合成法7】是以不同化学物质为底物进行化学合成腺苷，例如以次黄嘌呤为起始原料，经与三氯氧磷反应制得6氯嘌呤。6一氯嘌呤再与四乙酰核糖在特制的催化剂作用 下发生缩合反应，缩合物在OoC饱和的氨甲醇作用下氨解制得腺苷。然而化学法合成腺 苷溶剂损耗量大，成本高，收率低，产量低等缺点，并且对环境的污染较为严重，不适 合大规模的产业化。23微生物发酵法 微生物发酵法生产腺苷具有生产成本低，反应条件温和，原料来源广泛等优点。日本早在70年代就开始了发酵法生产腺苷的研究，并取得了一系列成果，迄今已进入大 规模工业生产阶段。1968年Konishi等【81使用枯草杆菌K株的异亮氨酸缺陷型(Bsubtilis K，Ile一)在含有O39L异亮氨酸的培养基中可以积累腺苷1269L。1993年，西山撤等 利用亚硝基胍为诱变剂诱变枯草芽孢杆菌，选育出具有鸟嘌呤缺陷、硫代腺苷抗性的腺 苷产生菌，在摇瓶发酵条件下产腺苷10 gL【91。选育出的菌株比其他菌株更具有工业意 义。国内进行发酵法生产腺苷的研究主要偏重于菌种选育，以肌苷生产菌种为出发菌株， 诱变筛选具有黄嘌呤缺陷型，鸟苷酸合成酶缺失，核苷结构类似物(8氮鸟嘌呤、8氮 黄嘌呤、6巯基嘌呤等)抗性和腺苷酸脱氨酶缺失等标记的菌株【1011。3菌种选育目前，腺苷生产菌种的选育除了采用传统的随机诱变结合定向筛选的方法外，随着 分子生物学和生物信息学发展，基因工程手段越来越多的应用腺苷生产菌株的选育。Jollll等121通过大肠杆菌用腺嘌呤和肌苷为底物发酵，用游离细胞法得到腺苷。Haneda等人由芽孢杆菌B口cf跏spNo1043诱变育得一株肌苷产生菌Ad1，再以Ad1菌株为出发菌株，用亚硝基胍处理，逐步诱变得到缺损腺苷脱氨酶的黄嘌呤缺 陷型腺苷产生菌P5318突变株，可以积累腺苷达16279L。华东理工大学王小茹、乔宾福等【141用一株黄嘌呤缺陷型、脱氨酶阳性枯草芽孢杆菌 为出发菌株经过60Co、5氟尿嘧啶和硫酸二乙酯选育出抗8氮鸟嘌呤的突变株(遗传标记Xan。+Gua一+De锄+8AG。，产苷329L)。46第一部分氨基酸篇华东理工大学汪泽、乔宾福等15】人从摇瓶发酵条件的优化、菌种的诱变、改善细胞 的通透性三方面进行研究。在利用60Co诱变中，得到突变菌株s101(腺苷产率是33 gL) 和s102(腺苷产率3O gL)；在细胞通透性实验中发现，十六烷基三甲基溴化胺能较好 地改变细胞的通透性，能将菌株s102的腺苷产率从30 gL提高到36 gL。通过三方面 的研究，将原菌种的产腺苷率从21 gL提高到了41 gL。以K猢awa等为代表的味之素株式会社171 81。他们以肌苷产生菌作为出发菌株，先后通过诱变筛选得到了一株具有腺嘌呤缺陷，8氮鸟嘌呤抗性，磺胺胍抗性，以及抗 高浓度腺嘌呤类似物2硫腺嘌呤硫酸盐、8氮腺嘌呤、6一甲氨基嘌呤的突变株，腺苷产 量可达到24 gL。江苏省微生物研究所柏建新等【19】以肌苷产生菌为出发菌株，利用物理、化学诱变剂 经多次诱变，诱变出黄嘌呤营养缺陷并对8氮鸟嘌呤具有抗性的突变株(遗传标记： Xan-+His+Thi。+8AGr+Deam。+GMPred-；产苷124 gL)。天津科技大学张洋、杜姗姗等【20】利用分子生物学技术，在腺苷生产菌种中过表达腺苷生物合成途径中的关键酶腺苷酸琥珀酸合成酶(ADSS)基因p材鲋，构建出一株腺苷 工程菌，其在相同发酵周期内腺苷的产量提高了108，这为腺苷工程菌的进一步改造 奠定了基础。4腺苷发酵工艺的研究 优良的生产菌株选育是腺苷发酵的关键，但是任何菌株最终都必须落实到反应器水平的发酵控制才能应用于实际生产，除了优秀的生产菌株之外，发酵条件的控制对腺苷 的生产亦至关重要，甚至成为生产上影响产苷的主要因素。腺苷发酵过程控制的报道并不多见。发酵法是生产腺苷主要的方法，常用的菌种是 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌属于好氧微生物，对氧的需求量较高，但其在不同溶氧条件 下仍具有不同的生理特性，因此溶氧浓度作为有氧控制的一个关键因素，直接影响腺苷 的生产水平【211。一般来说，核苷类物质发酵需要较高通风，控制发酵液中存在较高的溶 解氧并保证发酵环境中较低的C02的分布，但是过高的或者过低的溶氧水平都可能对代 谢产物的生成和菌体的生长带来不利的影响。刘剑，徐达22】根据张嗣良教授的多尺度微生物过程优化理论的发酵过程参数相关分 析原理，对腺苷发酵过程中不同溶解氧浓度进行研究，通过对发酵终点丙酮酸的检测， 发现枯草芽孢杆菌在低溶氧状态下比高溶氧状态下积累更多的丙酮酸在此基础上，提出 两阶段控制策略，最终腺苷积累量达到2019L，为腺苷工业生产提供理论参考。华东理工大学高淑红等【23】通过对腺苷生产过程中高浓度溶氧和低浓度溶氧的对比，472013中国生物发酵产业年会对腺苷生产菌中4106个基因进行分析，剖析了溶氧水平和菌体中碳、氮源代谢，氨基 酸代谢，核酸代谢等的关系，对低溶氧条件下更有利于腺苷合成的现象在分子水平上进 行分析，为腺苷生产过程中对溶氧控制提供了理论依据。此外，除了发酵过程中溶氧这一关键因素外，pH值的控制也是一个尤其重要的方 面，对于枯草芽孢杆菌来说，中性偏碱性的环境尤其适合其生长，但是适宜菌体生长的pH不一定是适合产物的生成，对于核苷类代谢产物来说，偏酸性的环境更适合于其积 累。天津科技大学陈宁、刘珥、徐庆阳等【231，对腺苷发酵过程的控制条件进行优化，利 用两阶段pH控制技术，进行发酵过程研究，腺苷产量达到1829L。5总结与展望随着腺苷的价值被重视，广泛应用医药和保健行业，市场需求逐渐扩大，国内各大 研究所、高校也对腺苷开始进行研究，但是与其他发达国家而言，无论是发酵规模还是 生产技术都相对落后。国内对腺苷的研究从菌种选育，培养基优化开始转向发酵过程控 制，为大规模的工业生产创造了条件。近些年来，基因工程手段越来越多的用于生产菌 的改造，进一步提高腺苷产量。参考文献：【l】张彦，朱文玲，郭丽琳，等腺苷超声心动图负荷试验诊断冠心病的应用价值【J】中国超声医学杂志200l，17(5)：340343【2】柏建新，张一平，朱晓宏，等微生物发酵生产腺苷的研究J】食品与发酵工业，2001，27(3)： 1621【3】江元翔，高淑红，陈长华响应面设计法优化腺苷发酵培养基华东理工大学学报，2005，31(3)： 309313【4】欧阳平凯化工产品手册：生物化工产品北京：化学工业出版社，1999，185186【5】中国商品大辞典编辑委员会中国商品大辞典：化学试剂分册北京中国商业出版社，1994，678679【6】Dm巧AN，Szent-Gy6玛yi AThe physiological actiV时of adenine compollIlds wim especial reference to their action upon m姗ali跹heanJ】Physiol， 1929， 68(3)： 213-237【7】杨西宁，董春红，渠桂荣腺苷的合成新工艺研究J】精细化工，2001，18(6)：317-318【8】Konishi S，Kubota K，Aoki R，甜口，studies on也e produc缸on of p谢ne肌cleosidesPanAccumlllation of adenosine by Lisoleucine-陀qlli】曲g舢衄吣of B口cf，如s“6枷叠刀mnino aCid and Nucleic Acid，1968，18(4)：1520【9】汪泽，乔宾福，袁勤生十六烷基三甲基溴化铵对枯草杆菌(Bsubtilis)黄嘌呤缺陷型菌株4R第一部分氨基酸篇产生腺苷的影响工业微生物，200l，30(1)：343610】陈宁，黄金，刘淑云枯草芽孢杆菌突变株、选育方法和该菌在发酵法生产腺苷中的应用cNl 724646A，200611】柏建新，邓崇亮，朱晓宏腺苷产生菌以及发酵生产腺苷的方法CN 1657608A，200512】Jolln OFo册ation of Adenosine by Cell-舶e Ex缸acts of西c办洲fc妇CD川n Arch Bioch锄Biophys，1954，48：483484【13】H姐eda K，H证mo A，Kodaim R，甜甜Accumulatiof nucleic aCid_rel砷ed substances bynlicr00rg锄isInsIIP砌uction of adenos硫by硼l_tants deriVed劬m觑甜如spA鲥c Biol Chem，1 97 1，35(12)： 1906一1912【14】王小茹，乔宾福，袁勤生抗8-氮鸟嘌呤腺苷产生菌的选育J】中国生化药物杂志2003，24(5)：224226【15】汪泽利用枯草芽孢杆菌黄嘌呤缺陷型产生腺苷的研究田】上海：华东理工大学，200116】Karasawa M，IchiuIIli T，Nal【锄atSu W-M柚ufactI鹏ofadenosine谢t11曰口cf，船P】Jap强ese，04030797 A23，1 99202【1 7】Nishiy卸舱T，Nakamatsu T，Shimta TIIldlIstrial production of adenosilleIIAdenosiIle production by a mlnant of配f，淞s“6ff胁resistant to adcnosine觚alogsJNippon Nogei Kagal(u Kaishi， 1994， 6