细胞凋亡及其相关进展-2011-4--28.ppt

细胞凋亡及其相关进展 昆明医学院神经科学研究所殷露玮 1 细胞凋亡的概述2 细胞凋亡的信号转导途径3 重要的凋亡调控基因4 常见细胞凋亡检测方法 内容 细胞凋亡的概述 一 细胞凋亡的概念1 凋亡概念的形成1972年 Kerr发现 结扎鼠门静脉后 电镜观察到肝实质组织中有一些细胞体积收缩 染色质凝集 这些细胞从其周围的组织中脱落并被吞噬且机体无炎症反应 1972年Kerr等首次提出了细胞凋亡 Apoptosis 的概念 Apoptosis一词来源于希腊 原意指秋天树叶的凋落以及花瓣的散落 其语源是apo off 离去之意 ptosis falling 凋落之意 英国人悉尼 布雷内 美国人罗伯特 霍维茨和英国人约翰 苏尔斯顿 2002年 fortheirdiscoveriesconceringgeneticregulationoforganofdevelopmentandprogrammedcelldeath 英国科学家悉尼 布雷内 1951年在南非威特沃特斯兰大学完成了他的硕士学业 1954年取得英国牛津大学博士学位 现任职于美国加利福尼亚州伯克利的分子科学研究所 他选择线虫作为新颖的实验生物模型 这种独特的方法使得基因分析能够和细胞的分裂 分化 以及器官的发育联系起来 并且能够通过显微镜追踪这一系列过程 布雷内在英国剑桥完成的这些发现为他获得诺贝尔奖奠定了基础 秀丽隐杆线虫1090 131 959 cells 属无脊椎动物线形动物门线虫纲个头小1mm最大特点 体细胞数恒定发现线虫ced349基因直接与细胞凋亡相关 而且这些基因在高等哺乳类动物也有普遍意义 2 细胞凋亡的概念细胞凋亡是指为维持内环境稳定 由基因严格控制的细胞自主的有序死亡 也常常被称为细胞程序死亡 programmedcelldeath 凋亡细胞被吞噬细胞吞噬 4 细胞凋亡与细胞程序性死亡的区别细胞凋亡一词出现之前的1965年 Lockshin等在研究蛾的变态发育过程中已发现存在着细胞程序性死亡 Programmedcelldeath PCD 现象 PCD是个功能性的概念 描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中 一个预定的并受到严格程序控制的正常组成部分 细胞凋亡则是一个形态学的概念 描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式 3 细胞凋亡的生理意义组织分化 器官发育免疫系统的动态平衡 损伤修复和衰老细胞的清除 抵御外界各种因素干扰举例 1 胸腺2 哺乳期乳腺发育 凋亡时细胞的形态学改变 空泡化 固缩 出芽 边集 凋亡小体 DAPI即4 6 二脒基 2 苯基吲哚 4 6 diamidino 2 phenylindole 是一种能够与DNA中大部分A T碱基相互结合的荧光染料 常用与荧光显微镜观测 因为DAPI可以透过完整的细胞膜 它可以用于活细胞和固定细胞的染色 荧光染料标记 Hoechst33342 PI 的凋亡细胞 染色质凝聚 流式细胞仪鉴别 正常细胞 低蓝 hocehest 低红 PI 凋亡细胞 高蓝 hocehest 低红 PI 坏死细胞 低蓝 hocehest 高红 PI 二 细胞凋亡的形态学及生化特征 1 细胞凋亡的形态学特征往往涉及单个细胞 凋亡细胞连接消失 与周围的细胞脱落 细胞体积变小 皱缩 细胞质浓缩 胞膜结构完整 有泡状突起 细胞核染色质浓缩 聚集核膜周围 在胞浆中出现由降解的胞浆和胞核成分包裹于膜性成分中形成的凋亡小体 Apoptoticbodies 无内容物外溢 因而不引起周围的炎症反应 生化特征 细胞色素C诱导细胞凋亡不同时间DNA电泳图 生化特征 1胞浆内Ca2 浓度升高 继而激活核酸内切酶发生最早 2细胞内活性氧增多 3RNA 蛋白质合成 说明凋亡是主动耗能过程与某些基因表达变化有关 4DNA内切酶活性被激活升高 双链DNA在核小体之间切断形成185bp为基数的有序片段 5 型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶 Calpain 活性升高 注 型谷氨酰胺转移酶是Ca2 依赖酶 可促进蛋白质谷氨酰胺与赖氨酸残基之间的交联 使细胞膜出现凹陷 皱缩 促进凋亡小体的形成 另外丝氨酸蛋白酶 如粒酶B 一氧化氮合酶 NOS PARP calpain 等也参与细胞的凋亡过程 细胞凋亡的生化改变 和凋亡有关的两个酶DNase作用 切割染色质DNA特点 Ca2 Mg2 增强活性 Zn2 抑制其活Casepases作用 灭活凋亡抑制物水解蛋白质结构 形成凋亡小体水解凋亡相关活性蛋白特点 一类特异的在天冬氨酸之后切割靶蛋白的半胱氨酸蛋白酶家族 cysteine containingaspartate specificprotease 细胞坏死的概述 一般过程 因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜 或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞 从而导致细胞吸水膨胀 最终破膜而死 特征 线粒体膨胀 细胞骨架降解 溶酶体释放 细胞核内染色质沉淀靠近核膜边 蛋白质合成下降 由于膜破裂 出现炎症反应 3 细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞坏死细胞凋亡细胞形态肿胀皱缩胞浆肿胀浓缩胞膜受损完整 泡状核染色质染色质不规则 移位浓缩聚集核膜周DNA断裂方式不规则在核小体间整倍性断裂结局崩溃凋亡小体诱导原因病理生理或病理基因调控 炎症反应有无 坏死细胞凋亡细胞 细胞凋亡的过程 大致分为如下四个阶段 凋亡信号转导凋亡基因激活凋亡的执行凋亡细胞的清除 诱导细胞凋亡的因子 物理性因子 射线 紫外线X射线等 较温和的温度刺激 如热激冷激 等化学及生物因子 活性氧基团和分子 DNA和蛋白质合成的抑制剂 激素 细胞生长因子缺失 肿瘤坏死因子 TNF 细胞凋亡的分子调控机理 线虫 C clengans 凋亡研究发现ced3 ced4基因促进细胞凋亡 ced9基因阻止ced3 ced4的激活 抑制细胞凋亡 Ced3哺乳类同源物是ICE interleukin 1 converingenzyme 即Caspase 1Ced4哺乳类同源物97年被证实为Apaf 1 apoptosisproteaseactivtingfactor 一种细胞凋亡蛋白酶活化因子 Ced 9哺乳类对应物较早证实为Bcl 2总结 ced3杀手基因ced4即使杀手基因又是存活基因且为两者的联系因子ced9存活基因 细胞凋亡的信号转导途径 细胞凋亡的过程 接受凋亡信号凋亡调控子间的相互作用Caspase激活和级联反应死亡底物的活化细胞凋亡细胞凋亡信号转导的两大途径 由死亡受体 Fas TNFR 介导的外源途径 在这条途径中 caspase 8首先被激活 线粒体介导的内源途径 在这条途径中 caspase 9首先被激活 细胞凋亡后期的共同途径 Caspase的激活 凋亡过程如何发生 Caspase致细胞凋亡变化机制 1 凋亡抑制物正常活细胞核酸酶和抑制物结合CAD ICAD Caspase激活的脱氧核糖核酸酶 caspase activateddeoxyribonuleaseCAD 2 破坏细胞结构核纤层蛋白 核膜的骨架结构 作为底物被Caspase裂解染色质的固缩3 调节蛋白丧失功能作用于几种与细胞骨架调节有关的酶或蛋白 改变细胞结构DNA修复有关的酶 mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白 胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径 一 死亡受体介导的凋亡途经 外源途径 死亡受体均属于肿瘤坏死因子受体 TNFR 超家族 它们与相应的配体 Ligand 结合后信号分子相互聚集并于细胞内衔接蛋白 adapotorprotein 结合 这些衔接蛋白又募集在受体部Procaspase相互活化产生级联反应 使细胞凋亡 下游Caspase活化后 作用于底物 核纤层蛋白 导致细胞核形成凋亡小体 裂解Dnase结合蛋白 使Dnase释放 降解DNA形成DNAladder 裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白 使凋亡细胞皱缩 脱落 便于细胞吞噬 导致膜质PS重排 便于吞噬细胞识别并吞噬 TNFR超家族成员及其配体分子主要包括Fas 又称CD95 FasL TNFR TNF DR3及TRAILR TRAIL 死亡受体介导的凋亡途经示意图 二 线粒体介导的凋亡途经 线粒体不仅是细胞能量代谢的中心 而且在起源于细胞内部的死亡信号所诱导的细胞凋亡中处于中心位置 这些细胞内部的死亡信号源自各种因素 如DNA损伤 氧化压力 X 射线 化疗药物 营养缺乏等等 因而 线粒体所介导的凋亡途径又称为细胞凋亡的内源途径 其过程大致如下 1 线粒体渗透转运孔 PTP 的开放和线粒体跨膜电位 的消失 Bcl 2家族蛋白对于PT孔的开放和关闭起关键的调节作用2 细胞色素c从线粒体中的释放和Caspase 9的激活 凋亡信号转导途径 2004年4月21日 美国科学院宣布 王晓东被选为该院院士 这是美国科学界的最高荣誉 在目前的美国科学院院士中 42岁的王晓东是最年轻的一位 主要研究领域 细胞凋亡的生化途径 凋亡的调控 细胞凋亡是多基因严格控制的过程 这些基因在种属之间非常保守 如Caspase家族 Bcl 2家族 抑癌基因P53 IAP家族等 抑制凋亡基因 Bcl 2 IAP 凋亡抑制蛋白 促进凋亡基因 wtP53 Bax ICE caspases亚型 双向调控基因 c myc Bcl x 一 Caspase是凋亡的执行者Caspase Cysteineaspartaticacicspecificprotease 在特异的天冬氨酸之后切割靶蛋白的一类进化上保守的半胱氨酸蛋白酶 又称半胱天冬酶 胱冬蛋白酶 1 Caspase家族特征Caspase通常以酶原 Procaspase 的形式存在 相对分子质量为29 49kD N末端具有一个原结构域 Prodomain C端同源区存在半胱氨酸激活位点 此激活位点结构域为QACX G Q或R G 2 Caspases的分类根据在细胞凋亡中起的作用 Caspases分为两大类 启始Caspase Initiator 和效应Caspase Effector 1 启始Caspases包括 2 8 9 10等 对细胞凋亡的刺激信号作出反应 启动细胞的凋亡过程 2 效应Caspases包括 3 6 7等 是在细胞凋亡过程中的具体执行者 完成对特定蛋白底物的水解 Caspase活化基本有两种机制 即同源活化和异源活化 这两种活化方式密切相关 一般来说后者是前者的结果 发生同源活化的Caspase又被称为启动caspase 通常caspase 8 10 2介导死亡受体通路的细胞凋亡 分别被募集到Fas和TNFR1死亡受体复合物 而Caspase 9参与线粒体通路的细胞凋亡 则被募集到Cytc dATP Apaf 1组成的凋亡体 apoptosome 异源活化 hetero activation 即由一种caspase活化另一种caspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的经典途径 被异源活化的Caspase又称为执行caspase 执行Caspase不象启动Caspase 不能被募集到或结合起始活化复合体 它们必须依赖启动Caspase才能活化 图 ICE家族成员A 3类caspase 蓝色参与炎症反应 红色为执行者 绿色为启动者 B caspase 3的结构模型 C caspase 3的活化过程引自KatjaC Zimmermann等2001 3 Caspase激活的机制非活化的Procaspase 前体 存在 其激活依赖于以其他的caspase在他的天冬位点裂解 释放一个大亚基和一个小亚基 形成四聚体 活化或自身活化 当Caspase 8活化后 他一方面作用于Procaspase 3 另一方面使Bid裂解成两个片段 其中含BH3结构域的C 端被运送到线粒体 域Bcl 2 Bax的BH3结构域形成复合物 导致细胞色素C释放 Cytc与胞质中ced 4同原物Apaf 1结合并活化Apaf 1 再活化procaspase 9 最后引起凋亡 Caspase以一种有序的的方式对细胞进行 破坏 通过切断细胞与周围的联系 拆散细胞骨架 阻断细胞DNA复制和修复 干扰mRNA剪切 损伤DNA与核结构 从而使细胞降解为凋亡小体 因此 可以说Caspase在细胞凋亡过程中的作用处于中心地位 Bcl 2家族 线粒体与细胞凋亡 Bcl 2是一种原癌基因 是ced 9在哺乳动物中的同原物 能诱导细胞凋亡 与线粒体及内质网膜相结合 Bcl 2蛋白羧基末端有一穿膜的结构域 Bcl 2家族成员的基因中 常常含有三个保守的Bcl 2同源区 及BH1 BH2 BH3 二 Bcl 2基因家族 根据它们对细胞凋亡作用结果的不同 可将Bcl 2家族成员分为两类 一类能抗细胞凋亡 如Bcl 2 Bcl xL Al Bcl w Mcl 1 在这类分子中 都含有Bcl 2同源区1 4 Bcl 2homologydomains BH1 BH4 的结构 另一类能促进细胞凋亡 有Bax Bak Bcl xS Bik Bad Bid Hrk 在这类分子中 根据它们的结构特点 又分为两个亚族 Bax亚族 如Bax Bak Bok 都有BH1 BH2和BH3的结构 BH3 only亚族 只有BH3的结构 如Bik Bad Bid Hrk 图Bcl 2家族引自KatjaC Zimmermann等2001 Bcl 2基因家族的结构特征 抑制细胞凋亡所必需 促进细胞凋亡所必需 summaryBcl 2家族各成员可以形成二聚体 二聚体中的某一单体对另一单体的功能具有促进或抑制作用 因此某一细胞中抑制因子与激活因子的比例决定了细胞是否发生凋亡 IAP inhibitorofapoptosisprotein 为一组具有抑制凋亡作用的蛋白质 首先是从杆状病毒基因组克隆到 在人类中 已发现IAP至少有五种 c IAP1 c IAP2 NIAP XIAP和Survivin 1 IAP的特征 IAP家族是哺乳动物体内唯一被发现的Caspase抑制剂 所有的IAP都含有对抗凋亡作用非常重要 三 IAP家族 IAP的拮抗蛋白果蝇中对IAP有拮抗作用的蛋白 Reaper HidandGrim 在哺乳类中 2000年Wang和Vaux领导的两个实验室同时分别发现了Smac和DIABLO 结果证明为同一蛋白 故称此蛋白为Smac DIABLO Smac DIABLO在凋亡中的两个功能 i 结合在IAP上 拮抗IAP的作用 促进凋亡 ii 促使procaspase3从无活性形式切割成成熟形式 研究发现Smac DIABLO的N端的7个氨基酸 对其激活caspase3的能力是必须的 此7个氨基酸序列与Reaper Hid与Grim中的14个氨基酸的序列是保守的 四 P53基因家族 1 P53基因 分子警察 p53并非为所有细胞的凋亡过程所必需 但对DNA损伤而诱发的细胞凋亡却是必不可少的 1 p53的两大功能 使细胞在G1期停滞 当DNA由于各种原因损伤后 p53首先诱导细胞进入G1期 抑制细胞增殖 直至损伤的DNA修复 一旦DNA不能被修复 p53就会活化那些诱导细胞凋亡的基因转录 使细胞发生凋亡 野生型P53还可逆转变异细胞为正常细胞 例如caspase 8切割胞质促凋亡蛋白Bid Bid是Bcl 2家族中只包含BH3domain的亚家族中的一员 Bid经切割后转移至线粒体膜 和Bad结合 诱导细胞色素c cytochromec 从线粒体中释放出来 Cytochromec再依次使Apaf 1激活casepase 9 在多数情况下这种交叉是少见的 两条通路一般独立发挥作用 线粒体和死亡受体凋亡通路紧密结合 细胞凋亡检测 一 AnnexinV FITC 结合膜表PS实验 二 细胞培养液LDH活性检测三 核DNA片段检测1 DNALadder2 Tunel法 优点 原位标记 定量分析 四 形态学鉴定镜检 DNA特异性染料Hochest33342 33258 DAPI 五 细胞凋亡反应核心因子检测六 流式细胞分析 Heochst33342 PI双染色法 注 AnnexinV FITC是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白 与磷脂酰丝氨酸有很高的亲和力 可特异性的与磷脂酰丝氨酸结合 流式细胞术分析细胞周期时相实验原理 流式细胞仪 FlowCytometryFCM 的工作原理是将待测细胞放入样品管中 在气体的压力下进入充满鞘液的流动室 在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出 形成细胞柱 通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测 得到该细胞的光散射和荧光指标 分析出其体积 内部结构 DNA RNA 蛋白质 抗原等物理及化学特征 细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化 如G0 G1期的DNA含量为2C 而G2期的DNA含量是4C 利用PI标记的方法 通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定 可分析细胞周期各时相的百分比 神经细胞凋亡 体外培养 的研究模型与应用 1神经营养因子的撤除与神经细胞凋亡的诱导神经生长因子 NGF 脑源性神经生长因子 BDNF 在神经系统发育中重要作用 维持神经元存活和功能 可用无生长因子 无血清培养基 或加入生长因子抗体制作诱导凋亡模型 2低钾引起的细胞凋亡 培养小脑粒细胞KCl浓度小于5mmol l 3一氧化氮与细胞凋亡神经元 内生型皮细胞 胶质细胞和巨噬细胞损伤后均可产生iNOS 诱生型一氧化氮合酶 缺血性损伤可激活NO合酶 加入NO供体 如硝普纳 可诱导细胞凋亡 4氧化损伤与神经细胞凋亡原理同前 过量活性氧 reactiveoxygensppeciesROS 包括氧自由基和过氧化氢 引起氧化应急损伤 脑组织对氧化损伤尤为敏感 神经细胞凋亡被证实是缺血再灌注死亡经神主要形式 氧化损伤参与急慢性神经退行性疾病发生发展过程 AD中A beta 淀粉样蛋白 沉积诱导氧自由基形成和氧化损伤 暴露于过量过氧化氢或凋亡 提供NO供体诱导5蛋白磷酸酶和蛋白激酶抑制剂与细胞凋亡蛋白磷酸酶抑制剂抑制蛋白磷酸化 破坏蛋白功能 细胞死亡 神经细胞中 藻毒素 OA 可使tau蛋白磷酸化 突触结构改变 6DNA损伤制剂与核苷 阿糖胞苷 7钙离子的神经毒作用线粒体内钙超负荷 引起线粒体膜通透性改变 细胞色素C释放 激活Caspase 8兴奋型神经递质的神经毒作用谷氨酸浓度过高 神经毒作用 机制可能与钙离子浓度升高 自由基形成 半胱氨酸蛋白酶 caspase 激活等有关 9beta 淀粉样蛋白与神经细胞凋亡10脂类与细胞凋亡11紫外线照射与细胞凋亡 神经细胞凋亡形态学检测 1台盼兰排斥实验测定细胞膜完整性台盼蓝 TrypanBlue 是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂 健康的正常细胞能够排斥台盼蓝 而死亡的细胞 膜的完整性丧失 通透性增加 细胞可被台盼蓝染成蓝色 依据此原理 细胞经台盼蓝染色后 可通过显微镜 直接镜下计数或拍照后计数 实现对细胞存活率比较精确的定量分析 2细胞Hoechst染色Hoechst33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料 对细胞的毒性较低 正常细胞膜 Hoechst33342能少许进入染上低蓝色 凋亡细胞的膜通透性增强 进入凋亡细胞中的Hoechst33342较正常细胞多 荧光强度较高 此外 细胞凋亡后DNA的结构改变使染料更有效地结合DNA 并且凋亡细胞膜上的p 糖蛋白泵损伤不能染料排出都使凋亡细胞的蓝色荧光增强 而PI染料是不能进入细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞中 即活细胞对PI染料拒染 而坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损 可被PI染料染色 根据这些特性 用Hoechst33342结合PI染料对凋亡细胞进行双染色 就可在流式细胞仪上将正常细胞 凋亡细胞和坏死细胞区别开来 在双变量流式细胞仪的散点图上 这三群细胞表现分别为 正常细胞为低蓝色 低红色 Hoechst33342 PI 凋亡细胞为高蓝色 低红色 Hoechst33342 PI 坏死细胞为低蓝色 高红色 Hoechst33342 PI 荧光染料标记 Hocest PI 的凋亡细胞 染色质凝聚 3细胞质和细胞核的分化染色细胞核用酸性染料染色 细胞质这用碱性染料着色 可同时观察细胞质和细胞核的形态学变化 4细胞膜磷脂酰丝氨酸暴露由于AnnexinV FITC fluuoresceinisothiocyanate 也可标记坏死细胞 不特异 结合PI区分坏死及凋亡细胞 AnnexinV FITC阳性且PI着色提示为坏死细胞 AnnexinV FITC隐性且PI未染色提示为正常细胞 AnnexinV FITC阳性且PI无染色提示为凋亡早期细胞 AnnexinV FITC阳性呈细胞表面绿色荧光 PI染色呈胞浆红色 5扫描电子显微镜观察方法6透射电镜观察方法 原位末端标记 TUNEL法 实验原理 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是分阶段 渐进的过程 染色体DNA首先在内源性核酸水解酶的作用下降解为50 300kb的大片段 然后在Ca2 和Mg2 依赖的核酸内切酶作用下 大约30 的染色体DNA在核小体单位之间被随机切断 形成180 200bp核小体DNA多聚体 DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口即可产生一系列DNA的3 OH末端 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶 TdT 的作用下 脱氧核糖核苷酸和荧光素 过氧化物酶 碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物可标记到DNA的3 OH末端 通过酶显色反应来进行凋亡细胞的识别和检测称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 TUNELTdT mediateddUTPnickendlabeling 原位细胞凋亡检测 TUNEL法 原理 原位细胞凋亡检测 TUNEL法 实验程序 实验试剂 1 TUNEL POD试剂盒 Roch公司 批号 11684817910 试剂1 末端脱氧核糖核酸转移酶 TdT酶 试剂2 含有核苷酸混合液的反应液试剂3 酶标记抗荧光素抗体2 DAB试剂盒 北京中山金桥公司 试剂 Tris HCl缓冲液试剂B DAB溶液试剂C 过氧化氢溶液3 脱氧核糖核酸酶I 15000USigma公司 主要试剂的配制 1 0 2MA液和0 2MB液A液 称取NaH2PO4 2H2O 分子量136 08 27 6g 双蒸水溶解后倒入1000ml容量瓶中 加双蒸水至终刻度 B液 称取Na2HPO4 12H2O 分子量358 14 71 628g 双蒸水溶解后倒入1000ml容量瓶中 加双蒸水至终刻度 2 0 2mol LPB液取A液19ml B液81ml 充分混合 室温保存 3 0 01mol LPBS缓冲液取NaCl8 5 9g及0 2mol LPB50ml加入1000ml容量瓶中 加双蒸水至1000ml充分摇匀 室温保存 4 0 1mol LHCl溶液取0 84ml浓盐酸 HCl比重1 19 含量37 加蒸馏水至100ml 充分混合 室温保存 5 100mmol LTris HCl取Tris3 025g Tris三羟甲基氨基甲烷 分子量为121 14 溶于200ml双蒸水中充分搅拌溶解 用浓盐酸约3ml调节pH值至6 4 最后加双蒸水定容至250ml 棕色瓶装 室温保存 7 0 1 DEPC水1mlDEPC 二乙基焦碳酸酯 原液加入1000ml单蒸水中 间歇剧烈振荡 避光室温静置12h以上 8 20 g ml蛋白酶K1mg ml储备液 取蛋白酶K1mg加入10mMTris HCl pH7 4 8 0 1ml充分混合后 分装成40份 20 储存 用时再冻融 20ug ml工作液 临用前配制 取蛋白酶K储备液5 l加入10mMTris HCl245 l再次稀释 混合均匀 9 3 H2O2 甲醇取3 H2O240 l 加入2 0ml甲醇中 按1 50 混合均匀 现用现配 实验步骤 1 染色前处理 1 玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理 包被目的以防止染色中切片脱落 2 组织固定 常规4 多聚甲醛 0 01MPBS pH7 0 7 6 或10 中性甲醛固定4h以上 石蜡包埋 目的最大限度保持组织细胞原有形态结构 3 石蜡切片常规脱蜡入水二甲苯 脱蜡各5 10min 脱蜡务必干净 然后放入100 95 90 80 70 等各级酒精溶液中各3 5min 再放入蒸馏水中3min 10 TUNEL反应液1液1 l 2液9 l 混匀 置于冰上备用 11 二氨基联苯 DAB 溶液1ml单蒸水中加入A液 B液 C液各一滴 约50 l 混合均匀 避光保存 30min内使用完 12 5 牛血清白蛋白 BSA 0 5mg牛血白蛋白加入10ml单蒸水中溶解 注意应先加牛血清白蛋白 再加入单蒸水混匀时避免漩涡混匀 4 保存 13 脱氧核糖核酸酶I DnaseI 将15000UDnaseI溶解于0 15M氯化钠溶液 5mg ml 1ml中 分装成50份 80 保存 每份20 l 每次取20 l加入0 15M氯化钠溶液中180 l再次稀释 现用现配 2 每张切片加一滴或50 l新鲜稀释至20 g ml的蛋白酶K 10mMTris HCl147 l加入1mg ml蛋白酶K3 l 37 消化30min 0 01MPBS洗5min 3次 细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10 60s 新鲜石蜡切片消化5 10min 陈旧石蜡切片消化10 30min 阳性对固定过程中照加入DnaseI室温孵育10min0 01MPBS洗5min 3次 目的暴露固定过程中因交联作用被遮蔽的蛋白抗原 同时部分消化细胞膜利于后续试剂的进入 3 0 1 DEPC水浸泡 室温30min 0 01MPBS洗5min 3次 目的减少消除外源性核酸内切酶造成的假阳性 4 标记甩去切片上多余液体 标本片擦干组织及周边水分 按每张切片滴加凋亡试剂盒1液和2液 按照1 9比例 在一次性PE手套