小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验ppt课件

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验 武汉大学基础医学院免疫学教研室熊洁 原理 体外法 巨噬细胞具有吞噬异物的功能 将巨噬细胞与被吞噬物 鸡红细胞 白色念珠菌 白色葡萄球菌等 共同温育 染色 在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数 以此判断巨噬细胞的吞噬功能 从而评价机体的免疫状态 本实验拟检测小鼠腹腔巨噬细胞对白色念珠菌的吞噬功能 材料 1 小白鼠2 白色念珠菌液 美兰染液着色 3 6 可溶性淀粉肉汤肉汤培养液100m1 加入可溶性淀粉6g 混匀后煮沸灭菌4 小鼠解剖器械 显微镜 离心机 温箱等5 试管 吸管 微量加样器 计数板 方法 1 小鼠巨噬细胞制备实验前三天每只小鼠腹腔注射1 可溶性淀粉1ml 实验时眼球放血 断椎处死小鼠 新洁尔灭浸泡5分钟 剪开腹部皮肤 暴露腹膜 用镊子夹起腹膜剪开一小口 注意避开血管 用1640灌注腹腔 收集腹腔液于试管中 约4ml 1500r min 离心10min 去上清 沉积细胞用1640离洗一次 最后沉积细胞用含10 小牛血清1640配成适当浓度备用 1 2 106 ml 2 白色念珠菌制备将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中 培养48小时 收集菌 用适量生理盐水配成悬液 100 煮沸30min灭活 离心去掉上清 再用1 美兰染色30min 用生理盐水洗涤二次 用生理盐水配成1 108 ml菌悬液 4 冰箱保存备用 3 吞噬细胞与菌混合培养取巨噬细胞0 5ml加白色念珠菌悬液0 5ml 置37 温育30min 取1滴混合液置玻片上加盖玻片 在高倍镜下观察计数 高倍镜下观察计算 吞噬率 吞噬白色念珠菌的巨噬细胞数 100个巨噬细胞 100 吞噬指数 100个巨噬细胞中吞噬白色念珠菌总数 100个巨噬细胞 吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞 注意事项 1 菌与细胞混合后充分混匀非常重要 对于此实验 菌与吞噬细胞之比10 1时吞噬作用容易观察和计数 但是吞噬效果好 能真正反映实际情况又可被检测的比例为1 1 2 菌和细胞在摇床中作用的时间不超过30min 如果在37 C条件下作用时间过长 被吞噬的菌很快会被裂解 也就不能计数为吞噬了菌的细胞 3 滴片时加入的细胞数依细胞的大小而定 如果使用的吞噬细胞是细胞系 细胞体积较大 那么加入的细胞数就相应的少一点 血球计数板计数法 血球计数板是由一块厚玻片特制而成 其中央有两个计数室 每个计数室划分出9个大方格 见下图 每格面积1mm2 加盖玻片后的深度为0 1mm 因此 每大方格容积为0 1mm3 四角的大方格 又分为16个中方格 适用于白细胞计数 中央大方格以双线等分为25个中方格 每个中方格又分16个小方格 通常我们取四角的4个中方格和中间的1个中方格来计数红细胞 首先用吸管吸取少许稀释后的单细胞悬液 从盖片端滴一小滴 不宜过多 液体自行向内渗入 静置数分钟后 再放在微镜下观察计数 计数时 若细胞位于小方格的线上 应遵循 数上线不数下线 数左线不数右线 的原则 以减少误差 计数应重复3次 取其平均值 数完毕后 依下式计算 每1mL白细胞悬液细胞数 4个中方格细胞总数 4 104 稀释倍数每1mL红细胞悬液细胞数