双特异性抗体与抗体融合蛋白

双特异性抗体 2 双特异性抗体 概述构建策略应用 3 概述 双特异性抗体 抗体两个结合点表现为不同的特异性 即分别结合不同表位 如 一个结合靶细胞 如肿瘤细胞 另一结合药物或免疫效应细胞 如蓖麻毒素 抗癌药物 细胞毒性细胞 4 双特异性抗体 5 6 双特异性抗体的功用 提高疗效 减少副作用 主要用于靶向治疗 7 构建策略 双特异性抗体的靶标一个结合治疗靶标 另一个指向体内效应细胞T细胞TCRCD3CD2 8 构建策略 双特异性抗体的靶标一个结合治疗靶标 另一个指向体内效应细胞吞噬细胞 APCFc R CR 9 构建策略 双特异性抗体的靶标一个结合治疗靶标 另一个指向体内效应细胞NK细胞Fc R CD56 10 双特异性抗体的效应靶 11 构建策略 双特异性抗体的构建方法杂化杂交瘤技术将具有某种特异性 如抗瘤细胞 的McAb细胞株与具有抗第二抗原 如蓖麻毒蛋白 的小鼠脾细胞进行融合 即产生出杂化杂交瘤细胞株的二价瘤体 12 杂化杂交瘤技术产生的双特异性抗体 13 杂化杂交瘤分泌的抗体形式保持原特异性抗体分子 L1H1 H1L1 L2H2 H2L2重链特异性相同的配对抗体分子 L1H1 H1L2 L1H2 H2L1L2H1 H1L2 L1H2 H2L2重链 轻链特异性不同的配对抗体分子 L1H1 H2L2 L1H2 H1L2L1H1 H2L1 L2H2 H1L2 14 只有L1H1 H2L2才是所需的双特异性抗体 15 杂化杂交瘤方法的不足产量低 仅占10 产物需筛选 费时费力瘤株不稳定 16 构建策略 双特异性抗体的构建方法化学交联法Nisonoff和Rivers最早开始研究化学交联无需经过细胞融合 比较简便易行 通常利用重链与轻链这间的二硫链经还原和再氧化 将两种不同特异性抗体的半分子结合在一起 或用双功能交联剂 如邻苯酸酯等 把两个抗体半分子交联在一起 17 化学交联的双特异性抗体 18 构建策略 双特异性抗体的构建方法化学交联法用于制备双功能抗体的McAb可以是完整分子 也可是经胃酶水解获得F ab 2片段 后者在减少鼠源免疫原性方面 效果较好 19 构建策略 双特异性抗体的构建方法基因工程技术利用分子生物学技术设计产生双功能抗体常见有四种构建形式 多为小分子抗体 20 末端半胱氨酸残基 Cys 共价交联在两种scFv分子C末端分别带上自由的Cys 通过常规二硫键共价交联 形成双特异性抗体 21 单链双特异性抗体将两种scFv分子基因用linker连接在一起 然后表达形成双特异性抗体 22 微型双特异性抗体利用专门二聚化结构将两种scFv分子连接在一起 形成双特异性抗体如利用fos和jun基因的亮氨酸拉链序列 23 双体型双特异性抗体将两种不同抗体的VH和VL用较短的linker连接形成两种不同单链 当它们共表达时 其相互间连接在一起 形成双特异性抗体1993 Holliger 24 双特异性抗体的应用 免疫诊断肿瘤放射显影肿瘤药物杀伤肿瘤的免疫杀伤乳腺癌 淋巴母细胞白血病 神经胶质瘤 25 抗体免疫偶联物 26 抗体免疫偶联物 概述小分子药物与抗体偶联物毒素及大分子多肽药物与抗体偶联物应用 27 概述 抗体免疫偶联物将单抗与 弹头 药物偶联在一起 以提高药物作用的特异性 主要用于肿瘤治疗 如 Mylotarg 抗CD33单抗偶联加里奇霉素 治疗老年人急性髓细胞性白血病 2000年上市 28 与单抗偶联的常用 弹头 药物 29 小分子药物与抗体偶联物 一个单抗可偶联一个至数十个小分子药物 抗体分子中的多个基团可以用于连接 如巯基 氨基 羟基 胍基 羧基 糖基等 30 小分子药物与抗体偶联物 直接偶联物将药物与单抗直接连接在一起不同的小分子药物往往需选择不同的交联剂 2 亚胺四氢噻吩 2 IT 可在具氨基的化合物上引入巯基 31 小分子药物与抗体偶联物 直接偶联物将药物与单抗直接连接在一起不同的小分子药物往往需选择不同的交联剂 SPDP N 琥珀酰亚胺 3 2 吡啶二硫基 丙酸酯 可将巯基引入抗体如 阿霉素与抗子宫内膜腺癌单抗偶联 效果提高57倍 32 小分子药物与抗体偶联物 直接偶联物将药物与单抗直接连接在一起不同的小分子药物往往需选择不同的交联剂 PDPH 3 2 吡啶二硫基 丙酰肼 可将巯基引入抗体 33 小分子药物与抗体偶联物 直接偶联物将药物与单抗直接连接在一起不同的小分子药物往往需选择不同的交联剂 戊二醛可将药物与单抗的伯氨基侨联如 柔红霉素与单抗偶联 34 小分子药物与抗体偶联物 直接偶联物将药物与单抗直接连接在一起不同的小分子药物往往需选择不同的交联剂 活泼酯可将含羧基药物与抗体的氨基相偶联 35 小分子药物与抗体偶联物 间接偶联物将药物先与大分子载体相连 然后大分子载体再偶联到单抗 Poly Lys可将含羧基的小分子药物偶联到载体 36 小分子药物与抗体偶联物 间接偶联物将药物先与大分子载体相连 然后大分子载体再偶联到单抗 Poly Glu可将含氨基的小分子药物偶联到载体 37 小分子药物与抗体偶联物 间接偶联物将药物先与大分子载体相连 然后大分子载体再偶联到单抗 Dextran可将含氨基的小分子药物偶联到载体 如 将平阳霉素与抗乳腺癌 肝癌单抗偶联 38 小分子药物与抗体偶联物 间接偶联物将药物先与大分子载体相连 然后大分子载体再偶联到单抗 脂质体脂质体与药物融合 再与抗体连接成免疫脂质体如 阿霉素 39 小分子药物与抗体偶联物 偶联要点与存在问题小分子药物与单抗偶联应有一定空间距离需提高偶联产率偶联基团应避开药物活性基团保留单抗靶向性多个药物分子偶联简单 易重复不形成抗体 药物或偶联物聚合物 40 毒素及大分子多肽药物与抗体偶联物 毒素和多肽类抗肿瘤药物分子量较大 具有较强的肿瘤杀伤活性 但选择性差 同型双功能偶联剂具有两个相同反应功能基团 双功能异氰酸酯亲脂性偶联剂如 将白喉毒素与抗瘤单抗偶联 41 毒素及大分子多肽药物与抗体偶联物 毒素和多肽类抗肿瘤药物分子量较大 具有较强的肿瘤杀伤活性 但选择性差 同型双功能偶联剂具有两个相同反应功能基团 脂肪二醛通过其醛基与药物 单抗的氨基偶联 42 毒素及大分子多肽药物与抗体偶联物 毒素和多肽类抗肿瘤药物分子量较大 具有较强的肿瘤杀伤活性 但选择性差 同型双功能偶联剂具有两个相同反应功能基团 二马来酰亚胺衍生物巯基偶联剂 43 毒素及大分子多肽药物与抗体偶联物 毒素和多肽类抗肿瘤药物分子量较大 具有较强的肿瘤杀伤活性 但选择性差 同型双功能偶联剂具有两个相同反应功能基团 特点与不足步骤简单 流程短 副反应产物多 均一性差 产率低 44 毒素及大分子多肽药物与抗体偶联物 毒素和多肽类抗肿瘤药物分子量较大 具有较强的肿瘤杀伤活性 但选择性差 异型双功能偶联剂具有两个不同反应功能基团 SPDP先与抗体 药物 氨基反应形成化合物 再与药物 抗体 巯基反应形成偶联物 如 相思豆毒素 蓖麻毒素 力达霉素与抗瘤单抗偶联 45 毒素及大分子多肽药物与抗体偶联物 毒素和多肽类抗肿瘤药物分子量较大 具有较强的肿瘤杀伤活性 但选择性差 异型双功能偶联剂具有两个不同反应功能基团 苯丁酸氮芥衍生物先与抗体氨基反应形成化合物 再与药物氨基反应形成偶联物 46 毒素及大分子多肽药物与抗体偶联物 毒素和多肽类抗肿瘤药物分子量较大 具有较强的肿瘤杀伤活性 但选择性差 异型双功能偶联剂具有两个不同反应功能基团 马来酰亚胺活泼酯先与药物氨基反应形成化合物 再与抗体巯基反应形成偶联物 47 毒素及大分子多肽药物与抗体偶联物 毒素和多肽类抗肿瘤药物分子量较大 具有较强的肿瘤杀伤活性 但选择性差 异型双功能偶联剂具有两个不同反应功能基团 特点反应温和 易控制 产物均一性好 产率高 48 毒素及大分子多肽药物与抗体偶联物 毒素和多肽类抗肿瘤药物分子量较大 具有较强的肿瘤杀伤活性 但选择性差 免疫偶联物的纯化由于反应产物是混合物 故需进行分离纯化常用方法有 凝胶过滤 亲和层析 离子交换层析 高效液相色谱 49 毒素及大分子多肽药物与抗体偶联物 研究趋势连接可控性 高产率 高产物均一性 选择性连接抗体和药物某一特定基团偶联物在体内稳定循环 并能在肿瘤部位激活或释放 50 抗体偶联药物的研究与应用 单抗 药物的临床试验研究亦有20多年历史存在诸多问题 51 单抗 药物的临床肿瘤治疗试验 52 抗体偶联药物的研究与应用 单抗 毒素的临床试验研究广泛 具一定效果 但与期望尚有距离 53 单抗 毒素的临床肿瘤治疗试验 54 抗体融合蛋白 55 抗体融合蛋白 概述重组免疫毒素基因工程抗体 酶基因工程抗体 细胞因子抗体 超抗原免疫粘连素 56 概述 抗体融合蛋白将抗体 片段 与其它效应蛋白基因融合 构建融合表达载体 然后在合适的表达系统生产融合蛋白 融合蛋白具均一性 易生产 57 重组免疫毒素 将单抗分子与毒素蛋白融合表达重组免疫毒素的构建常用毒素白喉毒素及其衍生物白喉杆菌所产生 修饰延长因子 阻断蛋白合成毒性极强 1 2个分子即可杀死1个细胞 肿瘤细胞敏感体内水解为A B两片段 A为毒性部分 B为结合部分 58 重组免疫毒素 将单抗分子与毒素蛋白融合表达重组免疫毒素的构建常用毒素假单胞杆菌外毒素及其衍生物不可逆修饰延长因子 阻断蛋白合成毒性很强单链 分结合部与毒性部位 59 重组免疫毒素 将单抗分子与毒素蛋白融合表达重组免疫毒素的构建常用毒素蓖麻毒素及其衍生物灭活核糖体 抑制蛋白合成体内水解为A B两链 A为毒性部分 B为结合部分 60 重组免疫毒素 将单抗分子与毒素蛋白融合表达重组免疫毒素的构建构建重组免疫毒素常用抗体片段的C端与毒素融合 61 重组免疫毒素 将单抗分子与毒素蛋白融合表达临床试验与研究血液恶性肿瘤靶向IL 2受体的免疫毒素多数T B细胞型白血病与淋巴瘤都过度表达IL 2受体亚基CD25如 抗CD25单抗 假单胞杆菌外毒素衍生物 临床 62 重组免疫毒素 将单抗分子与毒素蛋白融合表达临床试验与研究血液恶性肿瘤靶向CD22的免疫毒素约70 B细胞型淋巴瘤和白血病为CD22阳性如 抗CD22单抗 假单胞杆菌外毒素衍生物 临床前 63 重组免疫毒素 将单抗分子与毒素蛋白融合表达临床试验与研究血液恶性肿瘤其他靶向血液抗原的免疫毒素CD19 CD6 CD30 CD33 CD46 64 重组免疫毒素 将单抗分子与毒素蛋白融合表达临床试验与研究实体瘤抗LewisY重组疫毒素LewisY存在于结肠癌 乳腺癌 胃癌 肺癌 膀胱癌表面 如 抗LewisY单抗 假单胞杆菌外毒素衍生物 对结肠癌和乳腺癌有确切疗效 65 重组免疫毒素 将单抗分子与毒素蛋白融合表达临床试验与研究实体瘤抗Her2 neu重组疫毒素Her2 neu在乳腺癌 肝癌 卵巢癌 胃癌 有高表达 抗Her2单抗 假单胞杆菌外毒素衍生物 临床 66 重组免疫毒素 将单抗分子与毒素蛋白融合表达存在问题特异性非特异性毒性血管渗漏 内皮细胞损伤免疫原性实体瘤渗透 67 基因工程抗体 酶 把单抗分子与酶融合表达 使特定的催化效应靶向特定的部位 抗体介导的酶 前药疗法酶集中于靶标部位 催化无或低活性的抗癌前药转化为胞毒性药物 从而发挥药物特异性释放 活化 提高疗效 抗CEA抗体 葡萄苷酸酶前药 doxorubicin葡萄苷酸衍生物疗效显著提高 68 基因工程抗体 酶 把单抗分子与酶融合表达 使特定的催化效应靶向特定的部位 抗体介导的酶 前药疗法抗p97抗体 内酰胺酶P97 黑瘤抗原前药 7 4 羧基丁酰胺 头孢菌素氮芥疗效较化学偶联物显著提高 69 基因工程抗体 酶 把单抗分子与酶融合表达 使特定的催化效应靶向特定的部位 基于核酸酶的融合蛋白核酸酶与单抗融合 靶向肿瘤细胞核糖核酸酶免疫毒素多种核糖核酸酶具抗瘤活性如 牛胰 牛精核糖核酸酶 70 基因工程抗体 酶 把单抗分子与酶融合表达 使特定的催化效应靶向特定的部位 靶向溶栓剂血纤溶酶原激活剂与单抗融合 靶向凝血块如 尿激酶血纤溶酶原激活剂 组织血纤溶酶原激活剂与血块单抗融合 71 基因工程抗体 细胞因子 把单抗分子与细胞因子融合表达 发挥抗肿瘤作用 抗体 IL 2抗黑瘤抗体 IL 2临床前试验效果显著 已进入临床试验 72 基因工程抗体 细胞因子 把单抗分子与细胞因子融合表达 发挥抗肿瘤作用 抗体 GM SCF强化肿瘤特异性免疫 73 基因工程抗体 细胞因子 把单抗分子与细胞因子融合表达 发挥抗肿瘤作用 抗体 IL 12增强CD8 T细胞和NK细胞活性 74 基因工程抗体 细胞因子 把单抗分子与细胞因子融合表达 发挥抗肿瘤作用 抗体 B7增强肿瘤特异性免疫 75 基因工程抗体 超抗原 常用超抗原SEA葡萄球菌肠毒素 可激活大量T细胞 产生极强免疫应答 76 基因工程