试验一组织室设备参观及器皿的洗涤和灭菌.doc

植物组织培养技术实验指导实验一 组培室设备参观及器皿的洗涤和灭菌一、目的要求1通过参观，了解组织培养室的几个主要组成部分和各部分应有的基本设备以及有关仪器的用途与功能。2通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。二、材料用具高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、双筒解剖镜、酸度测定仪、空调机、控温仪、百分之一与万分之一天平、电炉、玻璃器皿（试管、三角瓶、移液管、漏斗、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒酒精灯），以及镊子、解剖刀、解剖针、手术剪，肥皂、洗衣粉、重铬酸钾、浓硫酸等。三、说明在进行各类具体的组培实验前，首先了解组培室的结构及主要设备的用途和性能是十分必要的，总体上的了解有利于以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。植物组织培养是一项十分细致的工作，为了保证植物外植体不受污染，第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒，使它们保持无菌状态，做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧，因此每个学生必须学好这套基本功。四、方法和步骤首先在老师带领下参观组培室，并听取讲解，然后配制洗液，称取工业用重铬酸钾40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制浓硫酸（或废硫酸）配好的溶液呈红色，铬酸洗液是一种强氧化剂，去污能力强，但玻璃器皿上沾有油脂、凡士林、石蜡等则用此液无效，铬酸洗液可反复使用，直到溶液呈青褐色为止。此溶液腐蚀性强，洗涤时需注意。每人清洗部分玻璃器皿，方法：清水洗净泡入洗衣粉水溶液中进行洗刷清水反复冲洗蒸馏水淋一遍烘干备用 。然后清洗部分较脏的玻璃器皿，方法：采用先碱后酸，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净晾干侵入酪酸洗液，浸泡时间视器皿的肮脏程度而定清水反复冲洗干净蒸馏水淋洗一遍烘干备用。带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。对器皿和用具进行高压灭菌，即用手提式高压灭菌锅，在1.2个大气压下保持1520分钟。解剖刀、手术剪、解剖针、镊子等用具 在接种前还要用百分之七十的酒精棉球擦一下，再用酒精灯的火焰灭菌，冷却后即可应用。五、作业试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？ 实验二 MS培养基母液的制备及培养基的配制、灭菌一、 目的要求通过掌握培养基对母液制备及常用培养基的配制和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件。二、 材料用具高压灭菌锅、冰箱、普通及精密天平、电炉、铝锅、玻璃器皿（烧杯、量微、容量瓶、移液管、试剂瓶、三角瓶、漏斗），化学试剂(CaCl22H2O，KNO3，MgSO47H2O，NH4NO3，KH2PO4，Na2EDTA，FeSO47H2O，MgSO44H2O，Zn SO47H2O，H3BO3，KI，NaMoO42H2O，CuSO45H2O，CoCl26H2O，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，肌醇，蔗糖，琼脂，若干种生长调节物质及天然复合物，HCL，NaOH，酒精)，以及称量纸、药匙、玻璃棒、精密度纸，瓶盖用纸，线绳或橡皮筋、铅笔、标签纸。三、 说明植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的组成成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基，因此，在进行大量工作之前，对不同培养基应进行分析、比较、试验，选择或发展出一个符合试验材料需要的适宜培养基。大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成。四、 方法和步骤1 培养基母液的制备母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素、微量元素、维生素和铁盐等。配制母液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如Ca2+和SO2-4,Ca2+,Mg2+和PO3-4一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。表2.1 MS培养基母液的成份及配制成分1升培养基母液浓度（mg）1升培养基工作液浓度（mg）每升培养基取用量（ml）母液（大量元素）NH4NO3KNO3KH2PO4CaCl2.2H2OMgSO4.7H2O3300038000340088007400浓缩20倍1650190017044037050母液（微量元素）KIH3BO3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O1661240446017205055浓缩200倍0.836.222.38.60.250.0250.0255母液（铁盐）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O55607460浓缩200倍27.837.35母液（有机成分）肌醇烟酸（VB5）盐酸吡哆醇（VB6）盐酸硫胺素（VB1）甘氨酸2000010010020400浓缩200倍1000.50.50.125配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应采用化学纯或分析纯级，药品的称量及定容都要准确，各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解，然后按培养基上的排列顺序混合。现以Murashige和Skoog(1962)培养基为例叙述如下：根据各种药品的特点，母液可配成4种（见表2.1）。其中铁盐母液的配制方法是：将称好的FeSO47H2O和Na2-EDTA2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。2植物激素的配制 一般将植物激素配制成0.11mg/ml的溶液，由于多数植物激素难溶于水，可采用以下方法配制： IAA、IBA：先溶于少量95%乙醇中，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。 NAA：可溶于热水中或用少量95%乙醇或少量1mol/L的NaOH溶解后，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。 2，4-D:不溶于水，可用95%的乙醇溶解或用少量1mol/L的NaOH溶解后后，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。 KT及BA：先溶于少量的1mol/L HCl中，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。 GA3：赤霉素的水溶液稳定性差，一般用95%的乙醇配制成510mg/ml的母液低温保存，使用时再稀释。以上配好的母液需贮存于24摄氏度的冰箱中，定期检查有无沉淀或微生物的污染，如出现霉菌，浑浊或沉淀，则不可再用。以上各种混合液(母液)或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，随称随用。3培养基的配制根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量，以配制1000ml为例，按每升培养基要求含量/每ml母液含量=母液吸取量公式，分别吸取母液、母液、母液、母液各50ml、5ml、5ml、5ml及一定量的各种植物激素混合后，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。将中称好的琼脂加蒸馏水300400毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。将中所取的各种物质(包括蔗糖)，加入煮好的琼脂中，再加水至1000毫升，搅拌均匀，配成培养基。用1mol/L的氢氧化钠或盐酸，滴入中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用pH试纸测其pH值，直到将培养基的pH值调到5.8。将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶(或试管)中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5，然后加棉塞，扎紧后灭菌。 培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉，可以准备一份配制培养基的成分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。配制时，按表列内容顺序，按项按量称取，就不会出现差错。 4培养基灭菌培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，即将分装好的培养基放在高压灭菌锅中，加热，待压力上升到0.5kg/cm2时，打开放气阀排净冷空气，关闭放气阀继续加热使压力稳定在1.11.2kg/cm2，温度为121摄氏度的条件下，维持1520分钟，培养基灭菌时间不宜过长，以防引起培养基成分的变化，也可采用间歇灭菌法进行灭菌，即将培养基煮沸10分钟，24小时后再煮沸20分钟，如此连续灭菌三次，即可达到完全灭菌的目的。经过灭菌的培养基应置于10下保存，特别是含有生长调节物质的培养基，在45低温下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培养基，要在配制后的一周内使用完，其它培养基最多也不应超过一个月。在多数情况下，应在消毒后两周内用完。5.几种常用培养基的配方MS培养基 MS培养基是目前普遍使用的培养基。它有较高的无机盐浓度，对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响离子间的平衡。MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养，它的液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显成功。这种培养基中的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，无须再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。与其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的明显特点。其配方见表2.1。N6培养基（1974）N6培养基特别适合于禾谷类植物的花药和花粉培养，在国内外得到广泛应用。在组织培养中，经常采用的还有怀特（While，1963）培养基、尼许（Nitsch，1951）培养基等。它们在基本成分上大同小异。怀特培养基由于无机盐的数量比较低，更适合木本植物的组织培养。其配方如下（单位均为mg/l）：KNO3 2830(NH4)2SO4 463MgSO4*7H2O 185KH2PO4 400CaCL2*2H2O 166MnSO4*4H2O 4.4ZnSO4*7H2O 1.5H3BO3 1.6KI 0.8甘氨酸 2.0盐酸硫胺素 1.0盐酸吡哆素 0.5烟酸 0.5肌醇 100蔗糖 50000琼脂 10000PH 5.8B5培养基（Gamborg等，1968）B5培养基的主要特点是含有较低的铵，这是因为铵可能对不少培养物的生长有抑制作用。经过试验发现，有些植物的愈伤组织和悬浮培养物在MS培养基上生长得比B5培养基上要好，而另一些植物，在B5培养基上更适宜。其配方如下（单位均为mg/l）：NaH2PO4.H2O 150KNO3 3000(NH4)2SO4 134MgSO4.7H2O 500CaCL2.2H2O 150MnSO4. H2O 10H3BO3 3ZnSO4.7H2O 2Na2MOO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCL2.6H2O 0.025KI 0.75盐酸硫胺素 10盐酸吡哆素 1烟素 1肌醇 100蔗糖 20000琼脂 10000PH 5.5五、 作业1 按上述方法配制MS培养基，先配母液，再配培养基，备用。2 制备母液时应注意哪些问题？为什么？实验三 愈伤组织的诱导、继代及分化一、 实验目的1. 方面让学生掌握组织培养相关的实验操作以及科学实验常用的正交实验设计方法，了解植物组织培养的原理2. 另一方面也让学生真实地感受现代生物技术与生产生活的联系，体验现代生物技术给人类生活带来的变化。二、 实验原理 植物体的根、茎、叶细胞一般都具有全能性，即每个细胞都有发育成完整植株的全部遗传信息。在一定的营养和激素下，可以脱分化形成愈伤组织。三、 材料与方法 1. 植物材料 树型金银花2. 实验设计 实验技术路线外植体选取 外植体表面灭菌 诱导愈伤组织 筛选出最佳愈伤组织诱导配方 愈伤组织的增殖 为后备实验打基础 愈伤组织芽的分化 筛选出最佳丛生芽分化培养基 生根培养 筛选出最佳生根培养基图3.1 树型金银花快速繁殖技术路线图试验条件根据树型金银花的自然生态习性状况，无特别说明，设定培养条件为温度 251，16h光照/8h黑暗的光暗交替培养，光照强度1600Lx2000Lx。3. 试验方案一（树型金银花） 植物的最佳繁殖方法，首先是由其遗传特性所决定的，单就组织培养而言，它还受植物基因型、外植体种类、年龄、部位及培养基种类、激素类型及浓度和培养条件等诸因素的影响。本试验在参考已有资料的基础上，采用正交试验设计和随机区组试验设计，注重培养基配方的研究(包括愈伤组织诱导培养、丛生芽诱导培养及生根培养的培养基类型、激素种类及浓度、激素代用物等)，各阶段设计方案如下:3.1 叶/芽/茎段愈伤组织的诱导本试验以MS培养基为基本培养基，MS培养基配方见表3.1。采用正交试验设计探索生长调节因子6-BA、NAA对树型金银花幼嫩叶片诱导愈伤组织的适用量，每个处理重复5次，每重复接种20个外植体。 在超净工作台上将将顶芽接种到诱导培养基（MS+1.0mg / L6-BA+0.02 mg/L NAA+ 30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂+pH 5. 8，121条件下灭菌30 min）上，先暗培养24 h，然后置于25 、光照1 000-1 500 lx条件下培养20天。表3.1 试验采用2因素水平正交设计：不同激素种类及浓度对愈伤组织诱导的影响处理6-BA mg/LNAA mg/L接种数量/个愈伤组织出现天数愈伤组织的形态、生长状况产生愈伤组织数量/个愈伤组织诱导率/%1002020.50.012030.50.022040.50.052050.50.12061.00.012071.00.022081.00.052091.00.1203.2 愈伤组织丛生芽的诱导本试验以MS培养基为基本培养基，采用随机区组试验设计探索生长调节因子6-BA，NAA对树型金银花愈伤组织丛生芽诱导的适用量，6-BA、NAA均采用四种水平（表3.2）。每个处理重复5次，每重复接种10块愈伤组织。 在超净工作台上将诱导出的愈伤组织转接到继代成芽培养基上（MS +0. 5 mg/L 6-BA+1. 0mg / L NAA + 30 g / L蔗糖+ 8 g/L琼脂，pH 5. 8 ，121条件下灭菌30 min） ，25天后继续用成芽培养基继代培养。表3.2不同激素种类及浓度对愈伤组织产生不定芽的影响处理6-BA /mg/LNAA /mg/L接种愈伤组织块数/个不定芽产生时间/天不定芽产生数量/个10.50.011021.00.021032.00.051044.01.0103.3 生根培养本试验以1/2MS培养基为基本培养基，1/2MS培养基即将大量元素减半其它物质配比不变的MS培养基。采用单因素试验设计探索生长调节因子NAA对树型金银花丛生芽诱导根分化的适用量，每培养皿接种10个外植体，每处理重复5次，实验方案见表3.3。 将分化出来的长到2-3cm芽接种到生根培养基（1 /2MS+1.0mg / L NAA+200 mg/L活性炭+ 15 g/L蔗糖+8 g/L琼脂+pH 5. 8，21条件下灭菌30 min）表3.3 不同浓度的NAA对组培苗成活率的影响浓度/mg/L生根数/株根长/cm成活率/%00.51.01.52.04实验方法4.1 培养基的选择 查阅的中文文献和外文文献中绝大多数金银花的组培都选用MS（Murashige and Skoog,1962）培养基.它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其它培养基为高，广泛用于植物器官、花药、细胞和原生质体培养。故选取MS培养基为树型金银花愈伤组织诱导的基本培养基，以节约时间和减少浪费。但金银花组培苗生根培养绝大多数采用1/2MS培养基 ,也有用1/4MS。本实验采用1/2MS培养基。本试验培养基中，30g/升 蔗糖， 8g/升 琼脂，pH 5.8。4.2培养基的灭菌本实验采用的培养基均为固体培养基，培养基配制好后进行认真严格的高压灭菌，灭菌条件为121C，约110Pa下灭菌20分钟，灭菌完成后取出后适当摇荡使培养基里面的琼脂充分混匀，以防培养基凝固不好。待其冷却凝固后使用。4.3 激素的选取根据外植体的不同分别选取了不同的激素，这些激素分别是:6-BA、NAA、2，4-D 、ZT、KT。4.4 外植体的选取 叶片 选取幼嫩叶片。 茎尖 采取新鲜的带顶芽的茎段。4.5 外植体灭菌灭菌试剂的选取75%酒精，0.1%升汞，吐温。将取回的金银花枝条置于水槽中，用软毛刷刷洗表面，自来水冲洗洗净表面尘土，吸干外植体表面的水分,再将其剪成2 cm左右的带腋芽的茎段,放入清洗液或洗衣粉溶液中浸泡15 min，自来水冲洗1 h，再用无菌水浸泡5 min，备用。 先用75%酒精浸泡20s，然后用无菌水清洗一次，倒去无菌水后，再用0.1%升汞+1-2滴吐温灭菌，灭菌过程中不断摇动广口瓶使外植体充分接触灭菌剂，然后，倒出灭菌剂，用无菌水清洗外植体5-6次，直到外植体上没有泡沫即可。4.6 外植体的接种4.6.1 叶片的接种叶片接种前应先对叶片进行预处理，首先将灭菌好的叶片放入已灭菌的带滤纸的培养皿中，在滤纸上吸干叶片表面水分后，用解剖刀将叶片边缘去掉，形成矩形，再将叶片切成约0.5cm0.5cm的小片，准备接种。4.6.2 茎尖的接种茎尖全部采取斜插入培养基的接种方法进行接种。接种前先将灭菌好的茎尖放入已灭菌的带滤纸的培养皿中，将其表面的水吸干，再用镊子小心将芽最外层的因灭菌而褐化死亡的叶片剥去，然后用解剖刀切去芽基部茎段的一部分制造伤口后，将芽小心些插入培养基中即可将其放在培养室中培养架培养。5 实验方案二（叶子花）5.1 不同激素处理对叶子花外植体愈伤组织诱导与增殖的影响处理6-BA mg/LNAA mg/L接种数量/个愈伤组织出现天数愈伤组织的形态、生长状况产生愈伤组织数量/个愈伤组织诱导率/%1002020.202030.502040.50.12050.50.22060.50.5205.2 不同IBA浓度对叶子花生根的影响浓度/mg/L生根数/株根长/cm成活率/%00.51.02.06结果观察与数据统计 材料接种后，在固定周期内（20-30d)对材料的污染率、褐化率、死亡率、愈伤启动率以及愈伤组织诱导率等情况做观察记载及必要的统计，并根据需要调整试验步骤。 启动率未污染外植体启动数/未污染外植体总数100 污染率接种污染数/接种总数100% 死亡率未污染死亡数/未污染总数100 褐化率未污染褐化数/未污染总数100 愈伤组织诱导率产生愈伤组织的块数/接种的总块数100 出芽率产生芽的愈伤组织块数/愈伤组织总块数100 平均芽数出芽总数/产生芽的愈伤组织块数 生根率生根苗数/培养总苗数100 平均根长所有根长之和/总根数 平均根数所有根数之和/生根苗 其中，有部分外植体并未完全褐化，也长出部分愈伤组织，对于此种外植体，记录数据时，既将其当成褐化外植体同时也当成产生愈伤的外植体。 调查的数据采用SPSS13.0统计分析软件进行数据的方差分析。四、结果观察与分析对观察的结果进行分析五、写出课程论文实验四 园艺植物茎尖脱毒培养一、 目的要求：练习对茎尖外植体的剥离、灭菌和接种等无菌的操作方法，熟悉快速繁殖和获得无病毒植株的全过程。二、 材料用具：超净工作台、双筒解剖镜、剪刀、镊子、解剖针、解剖刀、广口瓶、烧杯、培养皿、酒精灯、升汞、酒精、吐温20、无菌水、培养基、记号笔、纱布、酒精棉球、温室盆栽葡萄、菊花的侧芽、不结球白菜的侧芽等材料。三、 说明：植物茎尖处于比较幼嫩的部位，其细胞具有旺盛的生能力，易于培养而获得成功。茎尖培养根据其目的不同，取材的大小有较大的差异，较小的仅为十至几十微米的茎尖分生组织，较大的可利用几十毫米的茎尖甚至更大的芽，但一般讲茎尖愈小（小到50100微米的生度点）培养难度就越大，有的需要一年或更长的时间才能成苗，茎尖越大培养越易获得成功。如果进行植物快速繁殖，则采用较大的茎尖，以带有叶原基的生长为宜，这样既能提高成活率，又能加快繁殖速度，如以脱毒为目的，则采用较小的茎尖，因为病毒在植株上的分布是不均匀，一般幼嫩的组织器官中病毒含量极低，以生长点含病毒最少，甚至不含病毒，所以进行脱毒种苗培养，应尽量采用极小的茎尖生长点进行培养，以获得脱毒苗。四、 方法和步骤（以葡萄为例）：（1）选择品种性状典型的，生长健壮无病虫的葡萄植株，取其已萌动的顶芽或腋芽，或剪下35cm生长的茎顶端，剥去大叶片，先在流水中冲流23小时，吸干水分，再在70%乙醇中浸半分钟，然后放入0.1%升汞滴加12滴吐温20的溶液中灭菌5分钟，用无菌水冲洗35次。（2）在超净工作台上把灭菌的茎尖放在双筒解剖镜下剥去较小的叶片，根据不同目的，可取只带23个叶原基的生长点甚至不带叶原基的生长点，或带23片幼叶的茎尖。生长点剥离方法：在解剖镜下，一手用镊子夹住无菌的茎尖，一手用较细的解剖针剥掉生长点外围的叶片，直至达到晶莹发亮的光滑顶为止，然后用解剖刀仔细切取所需茎尖，随即接种在预先配制好的培养基上。（3）培养基：茎尖分化培养基：MS+BA1mg/L+NAA0.01mg/L+LH100mg/L,生根培养基：MS+IAA0.4mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.1mg/L.茎尖培养对培养容器无特殊要求，一般以15cm20cm的试管，或50ml三角瓶为宜，每支试管装10ml培养基，每只三角瓶装25ml培养基，每管或每瓶接种一个茎尖。（4）培养：接种的茎尖置于培养室内培养，温度25摄氏度2摄氏度，光照2000Lux,以日光灯为光源，每天照光10小时。五、 作业：1、 每人接种茎尖4个，要求二个剥至带23个叶原基的生长点。2、 定时观察记录：幼苗分化和生根情况。3、 试述利用茎尖培养为什么能够脱除病毒。 实验五 园艺植物的花药培养一、 目的要求 学习园艺植物花药的采集、灭菌、接种、培养等一整套花药培养的具体方法。二、 材料用具三、 树型金银花花药、苹果花药、批杷花药、不结球白菜花药、番茄花药、四季海棠花药、天竺葵花药等，纱布、塑料袋、三角瓶、70%酒精、冰箱、显微镜、醋酸洋红、载玻片、盖玻片、MS培养基的各种化学药品。各种灭菌、接种、培养用具和器皿。四、 说明花药培养是植物育种的一种有效方法，即用离体花药培养的方法，使其中的花粉发育成一个完整的植株，这种花粉植株的染色体数目为体细胞的一半，称为单倍体植物，据统治到1983年止，通过花药培养已从250多种植物中得到了单倍体植株。利用花药组织进行单倍体育种对多年生果树和观赏树木而言比一、二年生植物具有特殊的意义，因为多年生木本植物的品种几乎都是杂合体，加之又多为异花授粉，难以纯化，通过这一途径获得得单倍体后再使之加倍，就能得到纯合二倍体，从而为准确研究性状遗传规律和杂种优势的利用打下基础。四、方法和步骤a) 镜检确定花粉发育期：园艺植物花药培养是以采集花粉处于单核期的花药进行培养易获得成功。本实验在培养前先采集处于该时期的花蕾利用醋酸洋红压片法进行镜检，选取适宜的花粉发育时期。选择卡诺固定液淹没浸泡，固定花蕾 24 h，然后用 70%酒精保存。制片前测量花的长度和直径，再剥取花药于一洁净的载玻片上，分别用醋酸洋红和美蓝染液染色。用镊子挤出花粉，夹出药壁，盖上盖玻片，用吸水纸吸取多余的染液，在目镜为 10 倍、物镜为 40 倍的光学显微镜下观察，并拍照。每 1 张片随机选择 67个视野 （没有重叠部分）观察统计处于各发育时期的花粉细胞数。花药发育的时期和花蕾外观形态之间的对应关系为：花蕾长度 0.480.71 cm 处于单核早期，达到 71.0%；长度在 0.720.89 cm处于单核中期，达到 65.0%；长度在 0.901.02 cm 处于单核晚期，达到 67.3%；长度在 1.021.19 cm 处于有丝分裂前期，达到 60.8%；长度在 1.192.32 cm 处于二核期，达到59.8%。通过观察树型金银花花蕾外观形态，可以直观确定花药发育时期，为花药单倍体培养奠定基础b) 预处理：采集花蕾，用湿纱布包好放入塑料袋，置于35摄氏度冰箱中处理7天左右。培养基准备：采用MS+6-BA 2mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖4%+pH 5.8-6.0或者MS +2，4-D0.4mg/L+KIN0.2mg/L+IAA4mg/L+蔗糖38%。c) 花药灭菌及接种：接种前花蕾经70%酒精中浸10秒，无菌水冲洗3遍，0.1%升汞灭菌68分钟，然后用无菌水冲洗35次，在无菌条件下取出花药进行接种，注意不要破坏花药，每瓶接种2030个花药。d) 诱导培养：将培养瓶置于温度2530%，光强15002000Lux,每天光照相馆0小时的培养室中，诱导形成体胚或愈伤组织。e) 分化及再生：将胚状体或愈伤组织及时转入分化培养基，即在MS培养基中加入6BA。五、作业定时观察：胚状体和愈伤组织的分化情况。实验六 植物体细胞胚胎的发生和悬浮体系的建立一、 目的要求 1.学习植物体细胞胚胎的发生及悬浮细胞的培养。2.培养学生创新能力和实践动手能力。3.培养学生综合分析能力。二、 材料用具 香果树幼嫩果实等，纱布、塑料袋、三角瓶、70%酒精、冰箱、显微镜、醋酸洋红、载玻片、盖玻片、MS培养基的各种化学药品。各种灭菌、接种、培养用具和器皿。三、 说明植物组织培养的形态建成是细胞全能性表达的组成部分，它包含器官发生和体细胞胚胎(简称体胚)发生两种基本途径。体细胞胚胎发生是指在离体条件下植物的体细胞通过与合子胚发生相类似的途径发育成新个体的过程(Haccis1978)。体胚发生现象最早由Steward等(1958)在胡萝卜根细胞离体培养时发现，后来又陆续在单细胞悬浮培养、原生质体培养、花粉培养中观察到。体胚发生具有单细胞起源的特点(Politoetal1989)，为基因工程、细胞工程等生物技术改良品种提供了良好的实验体系。因此，70年代以来，这方面的研究与日俱增，已在43科79属114种植物中有体胚发生的报道(周俊彦1982;汤浩茹等1999)。然而这些研究大部分局限于器官水平，即发生的形态学，生理学(酶代谢、蛋白代谢、核酸代谢以及激素、糖、多胺、金属离子、微量元素、活性氧与体胚发生关系)的研究。随着植物分子生物学研究技术的发展，植物体细胞胚胎发生的研究深入到分子水平，如体胚发生相关基因的分离、基因的表达调控、细胞的信号传导等，目前已从胡萝卜、拟南芥、烟草等模式植物体胚中克隆到大批基因，这些都为探讨植物体胚发生的机理奠定了基础。四、 方法和步骤1 材料与方法取幼嫩果实（果龄30d左右）在洗洁净液中用软刷洗，然后用洗洁净液浸泡30min，自来水冲洗2h，在超净工作台上用75%酒精灭1min，0.1%HgCl2消毒15min，无菌水清洗5次。用手术刀纵向切开果皮，挑出未成熟种子备用。1.1胚性愈伤组织的诱导将未成熟种子接种到附加2.0 mg .L-1 6-BA的MS（Murashige and Skoog 1962）固体培养基中培养，6d后产生浅绿色致密愈伤组织，继续培养4d后，将浅绿色愈伤组织转到MS附加0.1 mg/L 6-BA、0.5 mg/LNAA的培养基上培养 30d，浅绿色愈伤组织逐渐变为黑色，继代培养40d，从黑色的愈伤组织表面生长出浅黄色疏松的胚性愈伤组织。培养基中添加蔗糖浓度为3%（w/v），琼脂0.8%（w/v）。用0.1molL-1HCl或0.1molL-1NaOH调节pH值，在灭菌前各培养基pH值为6.0，121灭菌20 min。培养温度(252），光照强度2000umol/m2/s，光照时间16hd-1。1.2悬浮体系的建立1.2.1 球形胚聚合体的获得将浅黄色胚性愈伤接种到含0.5 mg .L-16-BA和0.5 mg .L-1NAA的MS液体培养基中，添加3%的蔗糖，100ml三角瓶中加50ml液体培养基。置摇床上培养，转速为120转/分，培养温度(252），光照强度1000 umol/m2/s，光照时间16hd-1。每14d继代1次，继代时用60目的尼龙网过筛处理，使其大小均一。继代2次后，显微观察，悬浮培养物主要是由球形胚聚合体组成。将获得的大小均一的球形胚聚合体作为初始材料用于筛选基本培养基，接种量，糖浓度和植物生长调节剂等对体细胞胚胎发生的影响。1.2.2不同接种量对球形胚聚合体生长的影响分别以0.4%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%（w/v）接种量（鲜重）将球形胚聚合体接种到含0.5 mg .L-16-BA和0.5 mg .L-1NAA的MS液体培养基中，添加3%的蔗糖，每处理4个重复，培养14d后，观察球形胚聚合体的生长情况和统计其生长量。选取较优的接种量2%处理组测定悬浮培养物生长过程中pH和生长量的变化，该处理进行4个重复，每隔2d取其充分摇匀的悬浮培养物5mL，离心(8000g，10min)，将沉淀称重，同时测上清液pH值，共测定10次。1.2.3基本培养基对球形胚聚合体生长的