第章蛋白质和氨基酸的测定.ppt

蛋白质是生命的物质基础 蛋白质是食品的重要营养成分 蛋白质在食品加工中的意义Theimportanceofproteininfoodprocessing蛋白质是食品中三大营养素之一蛋白质对食品的色 香 味及组织结构等具有重要意义一些蛋白质具有生物活功能 是开发功能性食品原料之一 蛋白质的元素组成TheelementsofproteinC 50 55 H 6 8 O 20 23 S 0 4 N 15 18 微量元素 P Fe Zn Cu I等 食品中蛋白质来源Thesourceofproteininfood动物中蛋白质 如猪肉 鱼肉 鸡肉 乳植物中蛋白质 如大豆 谷物微生物中蛋白质 酵母 哪种食物中蛋白质含量最高 蛋白质系数测定方法一 利用蛋白质的共性 即含氮量 肽键和折射率等测定 定氮法 双缩脲法 物理法 二 利用蛋白质中特定氨基酸残基 酸性和碱性基因以及芳香基团等测定 染料结合法等 最常用的是凯氏定氮法 测得粗蛋白质含量 第二节凯氏定氮法 KjedahlMethod 1833 GB 一 常量凯氏定氮法 丹麦化学家凯道尔 JohanKjedahl 首创 1 原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化 digest 使蛋白质分解 其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出 而样品中的有机氮 organicnitrogen 转化为氨与硫酸结合成硫酸铵 然后加碱蒸馏 使氨蒸出 用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定 样品消化 sampledigestion 消化方程式2NH2 CH2 2COOH 13H2SO4 NH4 2SO4 6CO2 12SO2 16H2O浓硫酸 脱水性 氧化性脱水炭化氧化有机物C H NCO2 SO2 N SO2NH3 SO3 加速蛋白质的分解 缩短消化时间1 硫酸钾提高溶液的沸点而加快有机物分解 与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度纯硫酸 沸点 340 左右 加硫酸钾 提高至400 以上 原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解 水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大 故沸点升高 硫酸钾加入量不能太大 否则消化体系温度过高 铵盐分解 也可以加入硫酸钠 氯化钾等盐类来提高沸点 但效果不如硫酸钾 2 硫酸铜CuSO4催化剂凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多 还有氧化汞 汞 硒粉 二氧化钛等 效果 价格 环境污染 应用最广泛的是硫酸铜使用时常加入少量过氧化氢 次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化 作用机理还可指示消化终点的到达 蒸馏时作为碱性反应的指示剂 蒸馏 neutralizationanddistillation 消化完全的样品溶液 浓氢氧化钠使呈碱性 加热蒸馏 即可释放出氨气 2NaOH NH4 2SO4 2NH3 Na2SO4 2H2O 吸收与滴定 titration 吸收 加热蒸馏所放出的氨 硼酸溶液滴定 盐酸标准溶液 硼酸呈微弱酸性 Ka1 5 8 10 10 用酸滴定不影响指示剂的变色反应 它有吸收氨的作用 也可采用硫酸或盐酸标准溶液吸收 然后再用氢氧化钠标准溶液反滴定吸收液中过剩的硫酸或盐酸 从而计算总氮量 2 适用范围 application 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定 3 主要仪器凯氏烧瓶定氮装置4 试剂5 操作方法 样品 硫酸铜 硫酸钾 浓硫酸 45度角 先小火炭化 无泡沫后 加大火力 液体变蓝绿透明 继续加热微沸30分钟 NaOH 水 硼酸 指示剂 玻璃珠 6 结果计算 7 说明及注意事项 试剂溶液应用无氨蒸馏水配制 11 蒸馏完毕后 应先将冷凝管下端提离液面清洗管口 再蒸1分钟后关掉热源 否则可能造成吸收液倒吸 12 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色 在中性溶液中呈灰色 在酸性溶液中呈红色 甲基红 红 橙 黄 pH4 4 6 1 溴甲酚绿 黄 青蓝 蓝 pH3 8 5 4 二 微量凯氏定氮法1 原理及适用范围同常量凯氏定氮法2 主要仪器凯氏烧瓶 100ml 微量凯氏定氮装置 p222 3 试剂0 01000mol L盐酸标准溶液其他同常量凯氏定氮法4 操作方法稀释消化液 定容馏出液用0 01000mol L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点 同时作一空白试验5 结果计算 蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时继续蒸馏10分钟后 将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏 三 自动凯氏定氮法1 原理及适用范围同常量凯氏定氮法2 主要仪器自动凯氏定氮仪消化装置3 试剂硫酸铜和硫酸钾制成片剂 全自动凯氏定氮仪 第三节蛋白质的快速测定法 双缩脲法紫外分光光度法染料结合法水杨酸比色法 一 双缩脲法 1 原理当脲小心地加热至150 160 时 可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲 也叫双缩脲 反应式如下 双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物 此反应称为双缩脲反应 蛋白质分子含有肽键 与双缩脲结构相似 故也能呈现此反应而生成紫红色配合物在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比 据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量 该配合物的最大吸收波长为560nm 2 方法特点及应用范围本法灵敏度低 但操作简单快速 故在生化领域中测定蛋白质含量时常用此法 本法亦适用于豆类油料 米 谷等作物种子及肉类等样品测定 3 主要仪器4 试剂 1 碱性硫酸铜溶液 以甘油为稳定剂 以酒石酸钾钠作稳定剂配制试剂加入硫酸铜溶液时 必须剧烈搅拌 否则将生成氢氧化铜沉淀 2 四氯化碳 5 操作方法 标准曲线的绘制凯氏定氮法测出的标准蛋白质样显色 加入试剂静置1小时 比色 取上清离心 样品的测定显色比色查标准曲线 6 结果计算蛋白质 mg 100g 式中 c 由标准曲线上查得的蛋白质mg数 m 样品质量 g 二 紫外分光光度法 1 原理蛋白质及其降解物 眎 胨 肽和氨基酸 的芳香环残基在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用 在此波长 280nm 下 光吸收程度与蛋白质浓度 3 8mg ml 成线性关系 2 适用范围本法操作简便迅速 常用于生物化学研究工作 许多非蛋白质成分在紫外区也有吸收作用 光散射作用的干扰 在食品分析领域中的应用并不广泛 最早测定牛乳的蛋白质含量 也可测小麦面粉 糕点 豆类 蛋黄及肉制品中的蛋白质含量 3 主要仪器紫外分光光度计离心机4 试剂1mol L柠檬酸水溶液8mol L尿素的2mol L氢氧化钠溶液95 乙醇无水乙醚 5 操作方法 标准曲线的绘制准确称取试样2 00g 0 1mol L柠檬酸 四层纱布过滤 离心上清液 脲的氢氧化钠溶液 至透明比色 8mol L脲的氢氧化钠溶液作参比 样品的测定 6 结果计算蛋白质 mg 100g 中c 由标准曲线上查得的蛋白质mg数 m 样品质量 g 三 染料结合法 1 原理凡是来源相同的蛋白质 碱性 或酸性 氨基酸的含量 大体上是相同的 利用这个特点 加入过量的酸性 或碱性 染料 使其和蛋白质形成不溶性盐而沉淀析出 用分光光度计测定未反应的染料量 然后根据算出来的结合染料量求出蛋白质含量 2 适用范围本法适用于牛乳 冰淇淋 酪乳 巧克力饮料 脱脂乳粉等食品 3 主要仪器分光光度计组织捣碎机离心机 4 试剂5 操作方法 1 样品处理 2 染料结合 3 过滤离心 4 比色 5 标准曲线的绘制 6 测样 四 水杨酸比色法 1 原理样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后 在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成蓝色的化合物 可以在波长660nm处比色测定 求出样品含氮量 进而可计算出蛋白质含量 2 主要仪器分光光度计恒温水浴锅 3 试剂 氮标准溶液 空白酸溶液 磷酸盐缓冲溶液 水杨酸钠溶液 次氯酸钠溶液4 操作方法标准曲线的绘制样品处理 消化样品测定 稀释 取样测定 标准曲线的绘制 标准溶液于25ml容量瓶 比色管2ml空白酸工作液 5ml磷酸盐缓冲液 水至15ml 5ml水杨酸鈉 36 370C恒温水浴15分钟加入次氯酸钠2 5ml 恒温水浴15分 加水至标线660nm比色 5 结果计算 6 说明 样品消化完全后当天进行测定结果的重现性好 但样液放至第二天比色即有变化 温度对显色影响极大 故应严格控制反应温度 对谷物及饲料等样品的测定证明 此法结果与凯氏法基本一致 蛋白质氮和非蛋白质氮的测定 利用蛋白质能与重金属离子 如Cu2 Hg2 Pb2 等 结合形成蛋白质盐而变性沉淀的特性 在一定的条件下 将蛋白质氮和非蛋白质氮分离 然后用凯氏定氮法分别进行定量 蛋白质沉淀剂 常用的有氢氧化铜 醋酸铅 三氯乙酸 单宁等 第五节氨基酸总量的测定 双指示剂甲醛滴定法电位滴定法茚三酮比色法 ninhydrinmethod 双指示剂甲醛滴定法 1 原理氨基酸具有酸性的 COOH基和碱性的 NH2基 它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐 当加入甲醛溶液时 NH2基与甲醛结合 从而使其碱性消失 这样就可以用强碱标准溶液来滴定 COOH基 并用间接的方法测定氨基酸总量 2 方法特点及应用 此法简单易行 快速方便在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化 以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况 并以此作为控制发酵生产的指标之一 脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物 使结果偏低 酪氨酸含有酚羧基 滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高 溶液中若有铵存在也可与甲醛反应 往往使结果偏高 3 试剂 40 中性甲醛溶液 以百里酚酞作指示剂 用氢氧化钠将40 甲醛中和至淡蓝色 0 1 百里酚酞乙醇溶液 9 3 10 6 0 1 中性红50 乙醇溶液 6 8 8 0 0 1mol L氢氧化钠标准溶液 4 操作方法 样品溶液 氨基酸约20 30mg 2份 50ml蒸馏水1份 3滴中性红指示剂 用0 1mol L氢氧化钠标准溶液滴定 红色 琥珀色 终点 1份 3滴百里酚酞指示剂 中性甲醛20ml 摇匀 静置1分钟 0 1mol L氢氧化钠标准溶液滴定 淡兰色 终点 分别记录两次所消耗的碱液ml数 5 结果计算 6 说明及注意事项 此法适用于测定食品中的游离氨基酸固体样品应先进行粉碎 准确称样后用水萃取 然后测定萃取液 液体试样如酱油 饮料等可直接吸取试样进行测定 萃取可在500C水浴中进行0 5小时即可 与本法类似的还有单指示剂 百里酚酞 甲醛滴定法 此法用标准碱完全中和 COOH基时的pH为8 5 9 5 但分析结果稍偏低 双指示剂法的结果更准确 若样品颜色较深 可加适量活性炭脱色后再测定 或用电位滴定法进行测定 二 电位滴定法 1 原理根据氨基酸的两性作用 加入甲醛以固定氨基的碱性 使羧基显示出酸性 将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池 用氢氧化钠标准溶液滴定 依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点 2 仪器酸度计磁力搅拌器微量滴定管3 试剂20 中性甲醛溶液 参考甲醛滴定法试剂0 05mol L氢氧化钠标准溶液 磁力搅拌器 操作方法 pH8 2 计算总酸含量用 pH9 2 记录碱液体积试剂空白试验 记录空白消耗碱液体积 5 结果计算 6 说