第一章蛋白质

第一章蛋白质化学 protein来源于protos 意为 first or foremost 第一节蛋白质通论 一 蛋白质的化学组成 碳50 氢7 氧23 氮16 硫0 3 其他微量如 磷 铁 碘 钼 锌和铜 蛋白系数 6 25其中 在不同蛋白质样品中 N元素的含量相对稳定 约为16 故每克氮相当于6 25 100 16 克蛋白质因此食物与饲料中蛋白质的含量可以通过凯氏定N Kjeldahl法 进行大致估计举例 三聚氰胺事件皮革奶事件 凯氏定氮法的原理 共热 有机物 浓硫酸 氨 硫酸 硫酸铵 强碱 氨 用硼酸吸收 标准盐酸溶液滴定 根据酸的消耗量计算含氮量 计算蛋白质的含量 二 蛋白质的生物学功能1 结构蛋白是生物体的组成成分如 人的皮肤 肌肉 内脏 毛发 韧带 骨骼和血液2 催化作用如 酶 核酶 几种小分子RNA 3 运输功能如 HB血红蛋白 MB肌红蛋白 铁结合球蛋白 Cytc细胞色素C等 膜转运蛋白4 肌肉运动肌动蛋白和肌球蛋白 鞭毛5 调节作用如 胰岛素 促肾上腺皮质激素 生长激素等 基因调控因子6 免疫作用如 免疫球蛋白 抗冰冻蛋白 丝心蛋白7 支架作用 接头蛋白起传递信号的作用8 贮存功能 乳 蛋 谷蛋白 此外 蛋白质还在遗传信息的表达 生物膜的功能以及高等动物的记忆 识别 细胞的生长和分化等方面起重要的作用 三 蛋白质的分类1 从外形分纤维蛋白 多为结构蛋白球蛋白 具有广泛的生物学功能 如酶 蛋白类激素等 2 从组成分 简单蛋白simpleprotein单纯蛋白 完全由氨基酸组成结合蛋白conjugatedprotein多肽链 辅助因子由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成 简单蛋白 清蛋白和球蛋白广泛存在于动物组织谷蛋白和醇溶谷蛋白植物蛋白 不溶于水 易溶于稀酸 碱精蛋白和组蛋白碱性蛋白存在于细胞核硬蛋白 执行保护机体的功能蛋白 主要有角蛋白 胶原蛋白 网硬蛋白和弹性蛋白 结合蛋白 核蛋白 简单蛋白 核酸脂蛋白 简单蛋白 脂类结合糖蛋白 简单蛋白 糖类物质色蛋白 简单蛋白 色素物质如 叶绿体中含有叶绿素和类胡萝卜素的蛋白质 血红蛋白含有血红素 第二节蛋白质的基本结构单位 氨基酸 AminoAcids 氨基酸是蛋白质的基本组成单位 氨基酸是具有氨基 NH3 或亚氨基和羧基 COOH 的有机分子 氨基酸种类多 但构成蛋白质具有遗传密码的氨基酸只有20种 氨基酸的结构通式为 氨基酸的结构特点 1 与羧基相邻的 碳原子上都有一个氨基 因而称为 氨基酸 2 除甘氨酸外 其它所有氨基酸分子中的 碳原子连接的四个基团各不相同称为不对称碳原子或手性碳 特点 A 氨基酸都具有旋光性 实物与镜像互为旋光异构体B 每一种氨基酸都具有D 型和L 型两种立体异构体 目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L 型 氨基酸的立体异构体 一 手性 当时认为规定右旋的甘油醛 构型标准物 即当醛基 CHO排在上面时 OH在右边 并且用符号 D 标记它的构型 dextro 即右旋 OH在左边的为左旋的甘油醛 用符号L标记它的构型 levo 即左旋 右旋甘油醛就称为D 甘油醛 左旋甘油醛称为L 甘油醛 在这里 表示旋光方向 D L表示构型 注意AA各C原子的编号 H COOH NH C 2 2 HN 氨基 二 氨基酸的分类 一 根据R基团的化学结构可把氨基酸分为四类 1 脂肪族氨基酸 脂肪族是指结构简单 饱和度不定的直链有机化合物 一氨基一羧基氨基酸 Gly Ala Val Leu Ile Met Cys Ser Thr一氨基二羧基氨基酸及其酰胺 Glu Gln Asp Asn二氨基一羧基氨基酸 Lys Arg2 芳香族氨基酸 Phe Tyr Trp3 杂环氨基酸 His Pro氨基酸的结构 二 从营养学角度分类 必需氨基酸 人类不能自行合成 依赖食物供给 谐音记忆 笨蛋来宿舍 晾一晾鞋 笨 苯丙氨酸 蛋 蛋氨酸 来 赖氨酸 宿 苏氨酸 舍 色氨酸 晾 亮氨酸 一晾 异亮氨酸 鞋 缬氨酸 半必须氨基酸 半斤组 精 斤 氨酸 组氨酸 非必需氨基酸 人类能自行合成 三 根据R基团极性分类 非极性氨基酸 Ala Val Leu Ile Pro Phe Trp Met极性不带电荷 Gly Ser Thr Cys Tyr Gln Asn极性带正电荷 Lys Arg His极性带负电荷 Glu Asp 侧链为脂肪烃 丙氨酸 Ala 缬氨酸 Val 亮氨酸 Leu 异亮氨酸 Ile 侧链为含硫氨基酸 甲硫氨酸 Met 侧链含芳香环 色氨酸 Trp 苯丙氨酸 Phe 侧链为杂环 脯氨酸 Pro 非极性氨基酸8种 Ala 丙氨酸 Leu 亮氨酸 Ile 异亮氨酸 Met 蛋氨酸 Phe 苯丙氨酸 Trp 色氨酸 Pro 脯氨酸 Val 缬氨酸 特点 不易溶于水 疏水性氨基酸 R基疏水性大小Ala Met Pro Val Leu Ile Phe Trp这类氨基酸R基的疏水性 在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用 Pro是唯一的一种 亚氨基酸 它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用 一般出现在两段 螺旋之间的拐角处 侧链为羟基 丝氨酸 Ser 苏氨酸 Thr 酪氨酸 Tyr 酰胺基 天冬酰胺 Asn 谷氨酰胺 Gln 巯基 半胱氨酸 Cys 氢 甘氨酸 Gly 极性不带电荷R基团氨基酸 7种 Gly 甘氨酸 Ser 丝氨酸 Thr 苏氨酸 Cys 半胱氨酸 Asn天冬酰胺 Gln谷氨酰胺 Tyr 酪氨酸 特点 侧链含极性基团 在生理条件下不解离 易溶于水 天冬氨酸 Asp 谷氨酸 Glu Asp Glu 在生理条件下 侧链羧基完全解离 带负电荷 R基团带负电荷氨基酸 为酸性氨基酸 味精即为谷氨酸的钠盐 R基团带正电荷氨基酸 赖氨酸 Lys 精氨酸 Arg 组氨酸 His 为碱性氨基酸 在生理条件 PH 7 下 带正电荷 胍基 H 咪唑基 胍基 咪唑基在pH为6时 组氨酸分子50 以上质子化 既可以接受质子又可以放出质子 具有很强的缓冲能力 芳香族氨基酸 苯丙氨酸 Phe F 酪氨酸 Tyr Y 色氨酸 Trg W 酚羟基 吲哚基 苯甲基 常见20种蛋白质氨基酸都有对应的遗传密码 近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸 有证据表明此氨基酸由终止密码UGA编码 可能是第21种蛋白质氨基酸 HSe CH2 CH COOH NH2 硒代半胱氨酸 记忆技巧 按字母顺序记忆 AlaArgAspAsn丙精天天酰CysGluGlnGly半谷谷酰甘HisIleLeuLys组异亮亮赖MetPhePro甲硫苯丙脯SerThrTrpTyrVal丝苏色酪缬 三 不常见的蛋白质氨基酸 四 非蛋白质氨基酸 约180种不参与蛋白质的合成 1 作为细菌细胞壁中肽聚糖的组分 D GluD Ala2 作为一些重要代谢物的前体或中间体 丙氨酸 VB3 鸟氨酸 Orn 胍氨酸 Cit 尿素 绝大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚 请注意 三 氨基酸的理化性质 一 氨基酸的一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶 其形状因构型而异溶解性 各种氨基酸在水中的溶解度差别很大 并能溶解于稀酸或稀碱中 但不能溶解于有机溶剂 通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出 2 熔点 氨基酸的熔点极高 一般在200 以上 3 味感 其味随不同氨基酸有所不同 有的无味 有的为甜 有的味苦 谷氨酸的单钠盐有鲜味 是味精的主要成分 旋光性 除甘氨酸外 氨基酸都具有旋光性 能使偏振光平面向左或向右旋转 左旋者通常用 表示 右旋者用 表示 5 光吸收 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收 但在远紫外区 220nm 均有光吸收 在近紫外区 220 300nm 只有酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力 Tyr Trp Phe在近紫外光区的最大吸收峰 max 和摩尔消光系数 酪氨酸的 max 275nm 275 1 4x103 苯丙氨酸的 max 257nm 257 2 0 x102 色氨酸的 max 280nm 280 5 6x103 二 氨基酸的两性解离和等电点 氨基酸的解离性质氨基酸在结晶形态或在水溶液中 并不是以不解离的中性分子存在 而是离解成两性离子 在两性离子中 氨基是以质子化 NH3 形式存在 羧基是以离解状态 COO 存在 兼性离子在酸性溶液中可接受质子形成阳离子 在碱性溶液中则释放质子形成阴离子 也就是说究竟是酸解离还是碱解离与溶液的PH有关 在反应中它可以释放质子 起酸的作用 N H3NH2RCCOO RCCOO H2OHH也可以接受质子 起碱的作用 N H3N H3RCCOO H RCCOOHHH因此氨基酸是两性电解质 OH 阳离子 A 兼性离子 A0 兼性离子 A0 阴离子 A 以甘氨酸的解离为例 Gly的滴定曲线 二元酸 一元酸 亨德森 哈塞尔巴尔赫方程得出 pH pK Log 质子受体 质子供体 A0 A A0 A 氨基酸的等电点 如果在某一pH值下 氨基酸所带正电荷的数目与负电荷的数目正好相等 即净电荷为零 则称该pH值为该氨基酸的等电点 pI 各种氨基酸都有其特定的等电点 中性氨基酸的pI在微酸性 碱性氨基酸的pI在碱性pH范围 酸性氨基酸的pI在酸性pH范围 氨基酸在等电点时溶解度最小 易发生沉淀 工业上利用这一性质提取氨基酸 pHpI 样品带负电荷 样品点向阳极移动pH pI 样品不带电荷 样品点不移动 解离常数 指电解质达到解离平衡时 已解离的分子数与原有的分子数之比 当甘氨酸在酸性溶液中 它是以带净的正电荷的形式存在的 可以看作是一个二元弱酸 具有两个可解离的H 即 COOH和 NH3 上的H 根据上述甘氨酸的解离方程可得到 K1 K2为解离常数 当达到等电点时 Gly Gly 即 则 K1K2 H 2 方程两边取负对数 pH 1 2 PK1 PK2 1 举例介绍氨基酸的PI值计算 中性氨基酸 侧链不含离解基团的中性氨基酸 其等电点是它的pK 1和pK 2的算术平均值 pI pK 1 pK 2 2 对多氨基和多羧基氨基酸的解离解离原则 先解离a COOH 随后其他 COOH 然后解离a NH3 随后其他NH3 一般氨基酸的等电点pI等于氨基酸两性离子状态两侧的基团pK之和的一半 酸 碱性氨基酸 在溶液中氨基酸随pH升高而逐级解离时 总是pK 值小的基团先解离 pK 值大者后解离 因此 对于具有三个解离基团的氨基酸 只有靠近等电离子的两个pK 值影响等电离子的浓度 所以 只要正确写出解离反应式 皆可根据等电离子两边的pK 计算其pI值 酸性氨基酸 pI pK 1 pK R COO 2硷性氨基酸 pI pK 2 pK R NH2 2 小结 1 当外液pH为某一pH值时 氨基酸分子中所含的 NH3 和 COO 数目正好相等 净电荷为0 这一pH值即为氨基酸的等电点 简称pI 2 某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子两边的pK值和的一半 3 在氨基酸等电点以上任何pH AA带净的负电荷 在电场中向阳极移动 在氨基酸等电点以下任何pH AA带净的正电荷 在电场中向阴极移动 4 在一定pH范围中 溶液的pH离AA等电点愈远 AA带净电荷愈多 四 氨基酸的化学反应 1 与甲醛的反应 能测定氨基酸的含量 OH 中和滴定 羟甲基氨基酸 二羟甲基氨基酸 PK 9 6 9 6 7 反应特点A 为 NH2的反应B 在常温 中性条件 甲醛与 NH2很快反应 生成羟甲基衍生物 释放氢离子 应用 氨基酸定量分析 甲醛滴定法 间接滴定 A 直接滴定 终点pH过高 12 没有适当指示剂 B 与甲醛反应 滴定终点在9左右 可用酚酞作指示剂 C 释放一个氢离子 相当于一个氨基 摩尔比1 1 2 与亚硝酸反应 反应特点 1 脯氨酸不发生该反应 2 只有 氨基氮可发生此反应 R上的氮几乎不参与反应 3 通过测定N2的体积 摩尔数 可测定游离氨基氮 测定N2的体积测aa的含量 3 氨基酸与茚三酮反应 氨基和 羧基共同参与的反应 用途 常用于氨基酸的定性或定量分析 4 成肽反应 一个氨基酸的 氨基和另一个氨基酸 羧基脱水缩合 生成的酰胺叫做肽 这种酰胺键叫做肽键 5 氨基酸与2 4一二硝基氟苯 DNFB 的反应 sanger反应 DNFB dinitrofiuorobenzene DNP AA 黄色 HF 氨基酸 用途 可以用来测定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸 DNFB 多肽蛋白 弱碱 DNP 多肽DNP 蛋白 HF 酸解 DNP AA 有机相 游离AA 水相 6MHCL 105 16h 反应特点A 为 NH2的反应B 氨基酸 NH2的一个H原子可被烃基取代 卤代烃 C 在弱碱性条件下 与DNFB发生芳环取代 生成二硝基苯氨基酸应用 鉴定多肽或蛋白质的N 末端氨基酸 6 与5 二甲基氨基萘磺酰氯 Dansyl cl 的反应 在碱性条件下 丹磺酰氯 二甲氨基萘磺酰氯 可以与N 端氨基酸的游离氨基作用 得到丹磺酰 氨基酸 此法的优点是丹磺酰 氨基酸有很强的荧光性质 检测灵敏度可以达到1 10 9mol 用途 可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸 DNS AA多肽蛋白 弱碱 DNS AA多肽蛋白 6mol L的HCL DNS AA 游离AA 直接用纸层析和薄层层析加以鉴定 苯异硫氰酸酯 PITC 在弱碱性条件下 与氨基酸反应生成苯乙内酰硫脲 PTH 衍生物 即PTH 氨基酸 图1 8c 此反应又称为Edman反应 该反应是蛋白质或多肽氨基酸序列测定常用的反应 7 苯异硫氰酸酯 PITC 法 PITC 弱碱 PITC 多肽蛋白 PTC 多肽蛋白 无水甲酸或HF PTH AA 少一个AA的多肽或蛋白 乙酸乙酯 Edman反应鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸 苯异硫氰酸酯 PITC 法 此法经反应后的多肽少一个氨基酸的多肽链 多肽链未断裂 所以可用此反应连续降解氨基酸 重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序 设计出 多肽顺序自动分析仪 可测末端的氨基酸可测短肽的氨基酸 应用 多肽顺序自动分析仪 基本要求 熟悉蛋白质的组成 分类和生理功能熟练掌握20种氨基酸的分类 符号 熟悉氨基酸的结构特点 了解氨基酸的物理性质 重点掌握氨基酸的两性解离性质掌握氨基酸的等电点定义 特点 及应用 熟悉氨基酸等电点的计算方法 熟悉氨基酸的化学反应 重点掌握其应用 第三节肽 Peptides 一 肽的命名 由两个AA组成的肽称为二肽 10寡肽由 10个AA组成的肽则称为多肽 组成多肽的AA单元称为氨基酸残基 共价主链 肽链的骨干是由 N C C 序列重复排列而成 称为共价主链 Ser Gly Tyr Ala Leu读为 丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸从肽链的N 末端开始 残基用酰称呼 书写时 通常把NH2末端AA残基放在左边 COOH末端AA残基放在右边 多肽链中AA残基按一定顺序排列 氨基酸顺序肽链短的叫肽 长肽链叫蛋白质含游离 氨基的一端 氨基端或N 端含游离 羧基的一端 羧基端或C 端AA顺序是从N 端开始以C 端氨基酸残基为终点 一 肽和肽键的结构 肽键的C O和N原子间的共振相互作用 sp2 sp2 sp2 sp3 共振杂化体 结构1 结构2不稳定 结构3 共振产生的重要结果 限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺平面 6个原子处于同一平面 产生键的平均化 肽键呈反式构型 键虽是单键却有双键性质 不能自由旋转周边六个原子被约束在同一平面上前后两个C 在对角 trans 1 肽平面 C N0 149nm C N0 127nm 肽平面 肽键 CONH 中的 个原子和 个 碳原子 C 构成一个刚性平面 即肽平面 或肽单元 Ca C和Ca N之间是s键 可以自由旋转 两个相邻肽平面绕Ca的旋转 1 肽平面 肽键中的 和 均不能自由旋转 肽平面与 碳原子的二面角 和 二面角两相邻肽平面之间 能以共同的C 为定点而旋转 绕C N键旋转的角度称 角 绕C C 键旋转的角度称 角 和 称作二面角 亦称构象角 肽键中C N键介于单键和双键之间 有部分双键性质 不能自由旋转 组成肽键原子处于同一平面 肽平面 键长及键角一定 大多数情况以反式结构存在 三 肽的重要理化性质 1 每种肽也有其晶体 晶体的熔点都很高 2 在pH0 14范围内 肽的酸碱性质主要来自游离末端 NH2和游离末端 COOH以及侧链上可解离的基团 3 每一种肽都有其相应的等电点 计算方法与AA一致且复杂 4 肽的化学反应 也能发生茚三酮反应 Sanger反应 DNS反应和Edman反应 5 具有双缩脲反应 肽和Pr特有的反应 双缩脲反应 含有两个以上肽键的多肽 具有与双缩脲相似的结构特点 也能发生双缩脲反应 生成紫红色或蓝紫色络合物 这是多肽定量测定的重要反应 双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物 肽和蛋白质所特有而氨基酸所没有的颜色反应 双缩脲 四 天然存在的重要多肽 在生物体中 多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位 但是 也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在 这类多肽通常都具有特殊的生理功能 常称为活性肽 activepeptide 如 脑啡肽 激素类多肽 抗生素类多肽 谷胱甘肽 蛇毒多肽等 H3N Tyr Gly Gly Phe Met COO H3N Tyr Gly Gly Phe Leu COO Met 脑啡肽Leu 脑啡肽 均为九肽 分子中含有二硫键 有两个氨基酸不同 两者结构类似 前者第七位为Ile 后者为Phe 前者可刺激子宫的收缩 促进分娩有可能减退记忆 后者可促进小动脉收缩 使血压升高 促进记忆 也有抗尿作用 参与水 盐代谢的调节 谷胱甘肽 glutathione GSH 谷胱甘肽是一种称为 谷氨酰半胱氨酰甘氨酸的三肽化合物 谷胱甘肽分子中半胱氨酸的巯基可氧化或还原 故有还原型 GSH 与氧化型 GSSG 两种存在形式 H2O2 2H2O 解毒作用 与毒物或药物结合 消除其毒性作用 GSH对丙烯腈 氟化物 一氧化碳 重金属及有机溶剂等的中毒均有解毒作用 能够清除掉人体内的自由基 做为体内一种重要的抗氧化剂 保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基参与氧化还原反应 作为重要的还原剂 参与体内多种氧化还原反应 保护巯基酶的活性 使巯基酶的活性基团 SH维持还原状态 维持红细胞膜结构的稳定 保护红细胞膜上蛋白质的巯基处于还原状态 消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用 GSH的生理作用 高级神经系统活动的物质基础可能与形成RNA和短肽有关 如 人的记忆肽和RNA的合成和分解人的情绪 第四节蛋白质的结构 化学结构和空间结构1 化学结构 主要强调的是蛋白质的化学组成 它包括蛋白质中多肽链的数目 多肽链中氨基酸的种类 数目和排列顺序 每条多肽链的末端氨基酸组成以及链内及链间二硫键的数目和位置 2 空间结构 是指分子中每一个原子在三维空间中特有的排布和走向 空间结构也叫蛋白质的构象 三维结构 立体结构 高级结构 任何一种蛋白质在其自然状态或活性形式时 都有其独特而稳定的空间结构 而且这种空间结构的轻微变化都能影响蛋白质的正常的生理功能 蛋白质的一级结构 二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 四级结构 蛋白质的一级结构仅指蛋白质多肽链中各种氨基酸的排列顺序 蛋白质二级结构指的是其多肽链主链本身折叠形成的有规则的空间结构 不包括侧链基团的构象 二级结构的稳定靠氢键维系 蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上借助次级键进一步盘旋 折叠 从而生成相对独立的完整空间结构 包括主链和侧链的所有原子的空间排布 蛋白质由两个或两个以上独立的三级结构通过非共价键结合成的多聚体 称为寡聚蛋白 寡聚蛋白中的每个独立三级结构单元称为亚基 亚基之间的组合方式 一 蛋白质的一级结构 primarystructure 定义 1969年 国际纯化学与应用化学委员会 IUPAC 规定 蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序 包括二硫键的位置 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序 它是蛋白质生物功能的基础 1953年F Sanger第一个测定了牛胰岛素的一级结构 现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定 胰岛素 肾上腺髓质分泌的激素胰岛素由51个氨基酸组成 A链含有21个氨基酸 B链含有30个氨基酸 两条链由两个二硫键连接 另外在A链还存在一个链内二硫健 2 蛋白质一级结构的测定 片段重叠法和氨基酸组分分析法 1 样品必需纯 97 以上 2 知道蛋白质的分子量3 知道蛋白质由几个亚基组成4 测定蛋白质的AA组成并根据分子量计算每种AA的个数5 测定水解液中的氨量计算酰胺的含量 前提 蛋白质一级结构测定基本步骤 1 测定多肽链的数目 2 拆分多肽链 3 分析每一条多肽链的氨基酸组成 4 鉴定多肽链的N 末端和C 末端氨基酸残基 5 用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段 6 测定各肽段的氨基酸序列 7 用偏心轴拼接各肽段成完整的多肽链 8 确定二硫键的位置 1 测定多肽链的数目 1 测定Pr分子量 化学成分分析法 SDS PAGE 凝胶过滤法 沉降系数法等 算出蛋白质的摩尔数 2 测N端氨基酸的摩尔数 3 根据分子量和N末端数的关系确定多肽链数目 如果蛋白质分子只含一条多肽链 蛋白质的摩尔数与末端基的摩尔数相等 如果后者是前者的倍数 蛋白质分子则含一条以上的多肽链 盐酸胍 尿素解离多肽链间的非共价力 应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间和链内的二硫键 2 拆分多肽链 并分别分离纯化 二硫键的断裂 断裂二硫键的方法有很多 但主要是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法 过甲酸 二硫苏糖醇 碘乙酸 二硫苏糖醇 CH2O3 两类多肽链末端氨基酸残基 N 端氨基酸C 端氨基酸在肽链氨基酸顺序分析中 最重要的是N 端氨基酸分析法 3 末端氨基酸残基测定 1 N端分析 DNS cl法 最常用 黄色荧光 灵敏度极高 DNS 多肽水解后的DNS 氨基酸不需要提取 DNFB法 Sanger试剂 DNP 多肽 酸水解 黄色DNP 氨基酸 有机溶剂 乙酸乙酯 抽提分离 纸层析 薄层层析 液相等 PITC法 Edman法 逐步切下 无色PTH 氨基酸 有机溶剂抽提 层析 此法还可用来测肽段的氨基酸序列 氨肽酶法 一类肽链外切酶 2 C 端氨基酸的测定方法 羧肽酶法 肼解法 肼解法 它是目前测定C 末端aa残基最重要的化学法 多肽链与无水肼加热发生肼解 反应中除C 末端aa以游离形式存在外 其他的aa都转变为相应的氨基酸酰肼化合物 反应中生成的氨基酸酰肼可与苯甲醛作用形成水不溶性的化合物而沉淀 上清液中的游离的C 末端aa可用DNFB法或DNS法进行鉴定 无水肼 羧肽酶法 目前测定C 末端残基的各种方法中以羧肽酶法最为有效 也最常用 目前最常用的羧肽酶有四种 分别是羧肽酶A B C Y 羧肽酶是肽链外切酶 专一地从肽链的C端开时逐个降解 释放出游离氨基酸 如图 C末端的顺序 Val Ser Gly 酸水解辅以碱水解 常用6mol L的盐酸在105 110 条件下进行水解 反应时间约20小时 缺点是色氨酸被沸酸完全破坏 含有羟基的氨基酸丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸有一小部分被分解 天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基 酰氨基总量可由水解液中的氨量算出 需要辅以碱水解 5mol LNaOH 虽然很多种氨基酸遭到破坏 但Trp能定量回收 近年来用甲基磺酸代替盐酸水解蛋白质 它最大的特点是Trp不被破坏 已被广泛使用 4 氨基酸组成的分析 5 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化1 化学裂解法溴化氰是常用的一种化学试剂 1 只裂解蛋氨酸Met残基参与的肽键 Met X 产率85 2 Met在蛋白质中含量适中 一般为1 2 所以裂解后产生的片段不多 且为大片段 BrCN的特异裂解作用 高丝氨酸内酯 2 酶法裂解胰蛋白酶糜蛋白酶胃蛋白酶嗜热菌蛋白酶 R1 Lys K 和Arg R 专一性较强 水解速度快 羧基端R2 Pro 抑制 肽链 水解位点 胰蛋白酶trypsin R1 Lys或Arg R1 Phe F Trp W Tyr Y 等疏水性AA羧基端R2 Pro 抑制 pH8 9 肽链 水解位点 糜蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 chymotrypsin R2 Phe F Trp W Tyr Y Leu L Ile I Met M Val V 及其它疏水性强的AA水解速度较快氨基端的肽键R2 Pro或Gly 不水解R1或R3 Pro 抑制水解 肽链 水解位点 嗜热菌蛋白酶 thermolysin R1和 或R2 Phe F Trp W Tyr Y Leu L 及其它疏水性AA水解速度较快氨基端或羧基端R1 Pro 抑制 最适pH为2二硫键在酸性条件下稳定 因此 胃蛋白酶常用于确定二硫键的位置 肽链 水解位点 胃蛋白酶Pepsin 6 肽段氨基酸序列的测定Edman化学降解法 Edman化学降解法是Edman于1950年提出的 实际上就是利用苯异硫氰酸酯法 PITC法 重复测定多肽链的N 末端氨基酸残基 实际分析时 常把肽链的羧基端与不溶性树脂相偶连 这样每轮反应后 只要通过过滤即可回收剩余的肽链 以利反应循环进行 Edman降解法测定氨基酸序列 7 重建完整多肽链的顺序 肽氨基酸顺序A1Ala PheB1Ala Phe Gly LysA2Gly Lys Asn TyrB2Asn Tyr ArgA3Arg TyrB3Tyr His ValA4His Val十肽Ala Phe Gly Lys Asn Tyr Arg Tyr His Val 8 二硫键位置的确定 1 胃蛋白酶处理水解未断开二硫键的多肽链2 经对角线电泳分离各肽段 找出迁移率发生变化的肽段 分析其肽段的组成及顺序 用过甲酸断开二硫键 含有 S S 的肽段变成一对含磺基丙氨酸的肽 带电性质发生变化 转向90 二次电泳 曾含二硫键的肽段迁移率发生变化3 然后与完整多肽链进行比较分析 确定二硫键的位置 蛋白质顺序测定基本战略 氨基酸组分分析 测定多肽链数目 确定二硫键的位置 练习题 今有一个七肽 经分析它的氨基酸组成是 Lys pro Arg Phe Ala Tyr和Ser 此肽未经糜蛋白酶时 与DNFB反应不产生 DNP 氨基酸 经糜蛋白酶作用后 此肽断裂成两个肽段 其氨基酸组成分别为 Ala Tyr Ser和Pro Phe Lys Arg 这两个肽段分别与DNFB反应 可分别产生DNP Ser和DNP Lys 此肽与胰蛋白酶反应 同样能生成两个肽段 它们的氨基酸组成分别是Arg Pro和Phe Tyr Lys Ser Ala 试问此七肽的一级结构是怎样的 答案 1 与DNFB反应不产生 DNP 氨基酸不产生 推出此肽无游离的N端 是一环肽 2 糜蛋白酶专一性作用于Phe Tyr Trp的羧基端 推出 Ala Tyr Ser中Tyr是羧基端的氨基酸 Pro Phe Lys Arg中Phe是羧基端的氨基酸 3 这两个肽段分别与DNFB反应 可分别产生DNP Ser和DNP Lys 推出 Ala Tyr Ser中Ser是氨基端的氨基酸 所以此肽顺序为 Ser Ala Tyr Pro Phe Lys Arg中Lys是氨基端的氨基酸 Pro Phe Lys Arg的顺序为 Lys Pro Arg Phe 4 胰蛋白酶专一性作用于Lys Arg的羧基端 推出 Arg Pro的顺序为 Pro Arg Phe Tyr Lys Ser Ala的顺序为 Phe Ser Ala Tyr Lys 5 所以 此环肽为 Phe Ser Ala Tyr Lys Pro Arg 二 蛋白质分子内部的作用力 肽键 二硫键 一级结构氢键 疏水作用 范德华力 离子键 二硫键 三维结构 1 氢键 是弱键 生物大分子中存在数量较多氢键 hydrogenbond 的形成常见于连接在一电负性很强的原子X 如O N S 上的氢原子 与另一电负性很强的原子Y之间形成的非共价的作用力 如 N H O C 氢键的特点 X H Y1 X Y原子的电负性很强 X是质子供体 Y是质子受体 2 X H是共价键 H Y是氢键如 O H O3 具方向性 受体Y与供体X角度接近180度4 具饱和性 X H只能和一个原子结合 蛋白质分子中氢键的形成 H 2 疏水作用 维持蛋白质空间结构关键核心非极性物质在含水的极性环境中存在时 会产生一种相互聚集的力 这种作用称为疏水作用 hydrophobicinteraction 蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是非极性的 这些非极性的基团在水中也可相互聚集 形成疏水作用 如Leu Ile Val Phe Ala等的侧链基团 3 离子键 较普遍 单个来讲作用力较强离子键 又称为盐键 saltbond 是由带正电荷基团与带负电荷基团之间相互吸引而形成的化学键 在近中性环境中 蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷 而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷 二者之间可形成离子键 蛋白质分子中离子键的形成 4 范德华氏引力 vanderWaalsforce 普遍原子之间存在的相互作用力 广义包括 定向力 极性基团之间的吸引力和排斥力为定向力诱导力 极性基团与非极性基团之间的诱导力分散效应 非极性基团之间出现瞬时偶极矩的分散效应 由于组成分子的正 负微粒不断运动 电子云瞬时偏转 产生瞬间正 负电荷重心不重合 狭义只指 分散效应条件 相互作用的原子之间达到合适的距离注 蛋白质相互折叠后某些基团靠近达到原子之间合适的距离就会产生范德华引力 原子之间距离太近会产生排斥力 5 二硫键最强2个 SH基在氧化脱氢后形成的 S S键 是共价键 在生物体内有特定的酶来催化 对蛋白质的形成和稳定其重要作用 a 盐键b 氢键c 疏水键d 范徳华力e 二硫键 S S 维系蛋白质分子的一级结构 肽键 二硫键维系蛋白质分子的二级结构 氢键维系蛋白质分子的三级结构 疏水作用 氢键 范德华力 盐键维系蛋白质分子的四级结构 疏水作用 范德华力 盐键 1 构型和构象 构型 configuration 如几何异构体和光学异构体 分子中取代原子或基团在空间的取向 两种构型之间互变需断裂共价键 构象 conformation 取代基团当单键旋转时会形成不同的立体结构 这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂 那么是不是可以设想一种蛋白质可能有无限种构象呢 三 蛋白质的二级结构 secondarysturcture 2 多肽链折叠的空间限制 1 肽键的部分双键性质 2 非键合原子之间的最小接触距离 3 侧链R基团之间的空间位阻 蛋白质中非键合原子之间的最小接触距离 nm C N O H C N O H 0 320a 0 300 0 290 0 280 0 280 0 270 0 240 0 220 0 270 0 260 0 270 0 260 0 240 0 220 0 270 0 260 0 240 0 220 0 200 0 190 一个蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和pH条件下 只有一种或很少几种构象 这种天然构象保证了它的生物学活性 并且相当稳定 3 蛋白质二级结构的概念 蛋白质二级结构指的是其多肽链主链本身折叠形成局部的有规则的空间结构 不包括侧链基团的构象 二级结构的稳定靠氢键维系 3 蛋白质二级结构的基本类型 1 螺旋 the helix 2 折叠 pleatedsheet 3 转角 turns 4 无规卷曲 randomcoil 1 螺旋 the helix 螺旋是蛋白质中最常见 最典型 含量最丰富的二级结构 是由Pauling和Cory通过研究羊毛 马鬃的 角蛋白于1950年提出的 螺旋是多肽链主链围绕一个中心轴形成的规则的重复螺旋结构 其内容主要有三点 3 613 ns 1 螺旋是多肽链珠帘围绕一个中心轴形成的规则的重复螺旋结构 螺旋的每一圈 一个螺旋 由3 6个aa残基组成 每隔3 6个aa残基沿螺旋轴方向上升一圈0 54nm 螺距 即每个aa残基沿螺旋轴上升0 15nm 绕轴旋转1000 2 残基的侧链伸向外侧 二面角是 57o 47o3 相邻的螺圈之间形成氢键 氢键的取向几乎与中心轴平行 从N端出发 氢键由每一个aa残基羰基C上的O与其前面第四个aa残基酰胺N上的H之间形成 是13元环 4 螺旋有左手螺旋和右手螺旋 天然蛋白质中的 螺旋绝大多数是右手螺旋 0 15nm 0 54nm 原子模型图 球棒模型 俯视图 影响 螺旋形成的因素有 AA的侧链大小 极大的侧链基团 存在空间位阻 AA的 碳原子上有分支如 Thr Ile Val 2 特别小的侧链不易形成 螺旋如 Gly的侧链是H 无约束 形不成 57的二面角 3 R集团带电性 连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基 同种电荷的互斥效应不能形成键内氢键 如 Lys 4 AA的组成 有Pro等亚氨基酸存在 不能形成氢键 Pro上的N原子位于吡咯环的形成 无游离的H 无法形成链内氢键 2 折叠 pleatedsheet 折叠是蛋白质中第二种最常见的二级结构 也是由Pauling和Cory在1950年首先提出来的 由两 多条几乎完全伸展的肽链平行排列 通过链间的氢键交联而形成 折叠有两种类型 一种是平行式 即所有肽链的N端都处于同一端 另一种是反平行式 即所有肽链的N端一顺一倒地排列 从能量角度看 反平行结构更稳定 折叠结构特点1 肽链主链呈锯齿状折叠构象 C 总是处于折叠的角上2 AA的R基团处于折叠的棱角上 R基团与C 间的键几乎垂直于片层 3 氢键主要在多肽链间或同一肽链的不同部分形成 相邻主链间靠C O与N H形成氢键 4 几乎所有肽键都参与链内氢键的交联5 氢键的取向与肽链的长轴接近垂直 氢键NH O几乎在一条直线上 此时氢键最强 转角 turn 是多肽链180 回折部分所形成的一种二级结构 大部分是球状蛋白 3 转角 3 转角 turns 比较稳定的环状结构主要存在于球状蛋白分子中多数处在蛋白质分子的表面 特征 主链骨架本身以大约180 回折 回折部分通常由四个氨基酸残基构成 构象依靠第一残基的 CO基与第四残基的 NH基之间形成氢键来维系 4 某些氨基酸常见于 转角中 如 Pro Gly 泛指不能归入明确的二级结构如折叠片和螺旋的多肽片断 4 无规卷曲 randomcoil 特征 1 无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象 无规是相对的 不是绝对的 2 对于特定的蛋白质分子而言 其无规卷曲部分的构象则是特异的 使得蛋白质赋予柔性 和方向改变 比如 酶的活性中心 核糖核酸酶分子中的二级结构 四 超二级结构与结构域 一 超二级结构若干相邻的二级结构单元按照一定规律有规则组合在一起 相互作用 形成在空间构象上可彼此区别的二级结构组合单位 超二级结构类型 12345 52341 链 希腊钥匙拓扑结构 曲折 五 蛋白质的结构域 structuraldomain 蛋白质的结构域是指在超二级结构基础上组装而成的 多肽链折叠成近乎球状的组装体 这种相对独立的三维实体叫结构域 对于较大的蛋白质分子或亚基 多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构组成的 这种相对独立的三维实体就称结构域 结构域是球状蛋白的折叠单位 蛋白质三级结构的基本结构单位是结构域 一个蛋白质可以只包含一个结构域也可以由几个结构域组成 故结构域是能够独立折叠为稳定的三级结构的多肽链的一部分或全部 结构域也是功能单位 通常多结构域蛋白质中不同的结构域是与不同的功能相关联的 己糖激酶的结构域 卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域 螺旋 转角 折叠 二硫键 结构域1 结构域2 蛋白质的结构域的特点 结构域通常是几个超二级结构的组合 对于较小的蛋白质分子 结构域与三级结构等同 即这些蛋白为单结构域 结构域一般由100 200个氨基酸残基组成 但大小范围可达40 400个残基 氨基酸可以是连续的 也可以是不连续的 结构域之间常形成裂隙 比较松散 往往是蛋白质优先被水解的部位 结构域之间由 铰链区 相连 使分子构象有一定的柔性 通过结构域之间的相对运动 使蛋白质分子实现一定的生物功能 如 酶的活性中心 在蛋白质分子内 结构域可作为结构单位进行相对独立的运动 水解出来后仍能维持稳定的结构 甚至保留某些生物活性 免疫球蛋白G的结构域 movie 木瓜蛋白酶的裂解位点 抗原结合位点 铰链区 六 蛋白质的三级结构 tertiarystructure 1 三级结构的概念 蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋 折叠 从而生成特定的空间结构 包括主链和侧链的所有原子的空间排布 特征 一般非极性侧链埋在分子内部 形成疏水核 极性侧链在分子表面 2 维持三级结构的作用力 氢键 主链内部 侧链之间 侧链与主链 侧链与介质水 主链与介质水 范德华力疏水相互作用 疏水效应 疏水键 在水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部 这一现象称为疏水相互作用 离子键 盐键 二硫键疏水相互作用 在蛋白质三级结构中起着重要作用 它是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力 2 球状蛋白质三级结构的特征 1 球状蛋白分子含多种二级结构元件 如肌红蛋白 78 螺旋 16 折叠 6 无规卷曲溶菌酶 40 螺旋 12 折叠 19 转角和29 无规卷曲 2 球蛋白质三级结构具有明显的折叠层次从二级结构 超二级结构 结构域 3 球蛋白分子是紧密的球状体或椭球状体 4 球蛋白疏水侧链埋在分子内部 亲水侧链暴露在分子表面 因此球蛋白是水溶性的 5 球蛋白分子的表面有一个空穴 裂沟 凹槽 它是结合底物 效应物等配体并行使生物功能的活性部位 空穴周围分布着许多疏水侧链 为底物等发生化学反应营造了一个低介电区域 肌红蛋白a 一条多肽链 153个氨基酸残基 一个血红素辅基 分子量17600 b 肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构 肽链共折叠成8段较直的 螺旋体 75 A H 最长的有23个氨基酸残基 最短的有7个氨基酸残基 拐弯处多由Pro Ser Ile Thr等组成 c Mb整体分子十分结实 分子内部有一个能容纳4个H2O的空间 这个空间形成了疏水微环境 使得血红素伏击伸入其中 血红素 铁卟啉 辅基的结构及其氧合部位 93 肌红蛋白的亚基铁卟啉 肌红蛋白的氧合曲线 肌红蛋白为单体蛋白 在氧分压较低时即易于与氧结合 并随氧分压的增加逐渐达饱和 其氧合曲线为双曲线 煤气中毒的机制 一氧化碳 CO 也能与血红素Fe原子结合 由于CO与血红素的结合能力是O2的250倍 单独时是25000倍 因此 人体吸入少量的CO即可完全抑制肌红蛋白或血红蛋白与O2的结合 从而造成缺氧死亡 急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中 如新鲜空气 纯氧气或高压氧气 使与血红素结合的CO被O2置换出来 七 蛋白质的四级结构 quaternarystructure 四级结构是指由两条或两条以上的多肽链 亚基 按一定方式聚合而成的具有特定构象的蛋白质分子 四级结构中的每个独立三级结构单元称为亚基 实质 蛋白质的四级结构实际上研究亚基之间的相互作用 空间排布及亚基接触部位的空间布局 亚基单独存在时无生物学活性 由两个以上 12个以下的亚基组成的蛋白称为寡聚蛋白 oligomericprotern 寡聚蛋白中亚基可以是相同的或不相同的 亚基相同时 分子具有对称性 各亚基之间靠次级键连接 如血红蛋白 Hb 的四级结构 含四个亚基 两条 链 两条 链 链 141个残基 链 146个残基每个亚基含一个血红素辅基亲水性侧链基团在分子表面 疏水性基团在分子内部 别构蛋白 具有别构效应的蛋白质称为别构蛋白 若此蛋白质是酶 则为别构酶 A 几个概念 别构效应 蛋白质与配体结合后能改变蛋白质的构象 进而改变蛋白质分子其他部位结合配体的能力 别构蛋白的结构特点 都是寡聚蛋白质 有四级结构 分子中每个亚基上都有活性部位 或者还有别构部位 某些蛋白质的活性部位和别构部位分属不同的亚基 不同亚基各部位之间存在相互作用 部位之间的影响是通过构象变化传递的 同促效应 homotropiceffect 不同亚基之间发生作用的部位是相同的 如都是活性部位 则产生同位效应 同促效应 同位效应 蛋白质与一种配体的结合影响其它部位结合同种配体的能力包括 正 协同效应和负协同效应 同位效应一般是指活性部位之间的效应 正协同效性 一种配基的结合促进后续配基的结合 S型配体结合曲线 负协同效性 一种配基的结合抑制后续配基的结合 同促效应 homotropiceffect 正协同效应 负协同效应 S形配体结合曲线 类似双曲线 血红蛋白 异促效应 异位效应 就是别构效应 活性部位的结合行为将受到别构部位与效应物结合的影响 正效应物 促进活性部位与配基结合的别构效应物 负效应物 抑制活性部位与配基结合的别构效应物 同位效应是别构效应的基础 别构效应可以看成 是对同位效应的一种修饰 2 维持蛋白质四级结构的主要作用力 在蛋白质四级结构中 亚基之间的作用力主要包括 氢键 离子键 范德华力 疏水相互作用 即亚基之间主要通过次级键彼此缔合在一起疏水相互作用是最主要的作用力 蛋白质的一 二 三 四级结构 第五节蛋白质分子结构与功能的关系 一 蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质的一级结构决定了空间构象 空间构象决定了蛋白质的生物学功能 White和Anfinsen核糖核酸酶复性经典实验 核糖核酸酶 1 含124个氨基酸残基 含4对二硫键2 在体内含量高 结构稳定已有大量的实验结果证明 如果多肽或蛋白质一级结构相似 其折叠后的空间构象以及功能也相似 1 一级结构的种属差异与分子进化 同源蛋白质 1 定义 不同物种中氨基酸序列明显相似且行使相同或相似功能的蛋白质 2 特点 a 来源于同一祖先 在一级结构上存在种属差异性 b 它们的基因编码序列及蛋白质氨基酸组成有较大的保守性 把这些具高度保守性的氨基酸残基称为不变残基 c 同源蛋白质序列的相似性大小反映蛋白质之间的进化关系的近远 如细胞色素C的一级结构 通过分析不同物种的细胞色素C一级结构间相似程度 可反映出该物种在进化中的位置 细胞色素C是广泛存在于需氧生物细胞线粒体中的蛋白质 由一条多肽链和血红素辅基组成 在生物氧化过程中起传递电子的作用 陆上脊椎动物的Cytc有104个氨基酸残基 鱼类为107个 绿色植物为111或112个 酵母及霉菌中为107 109个 生物与人不同的AA数目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠牛 猪 羊 狗11马12鸡 火鸡13响尾蛇14海龟15金枪鱼21角饺23小蝇25蛾31小麦35粗早链孢霉43酵母44 不同生物与人的Cytc的AA差异数目 从100余种不同种属的Cytc的一级结构研究中发现 1 亲缘关系越近 AA顺序的同源性 相似性 越大 2 尽管不同生物间亲缘关系差别很大 但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序 即保守顺序不变 称为不变残基 不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基 35个不变的AA残基 是CytC的生物功能所不可缺少的 其中有的可能参加维持分子构象 有的可能参与电子传递 有的可能参与 识别 并结合细胞色素还原酶和氧化酶 教材是28个 根据细胞色素C的顺序种属差异建立起来的进化树 1 亲缘关系越远 进化上分道扬镳的时间就越早2 分叉离得越近的亲缘关系就越近3 进化树和传统分类学得到的进化系统图非常相近 因此可研究进化方面系统演化的关系 4 人和黑猩猩最近5 现在研究非常热门 用分子的手段来研究物种进化通过比较蛋白质和核苷酸的排列顺序研究 形成分子系统学 胰岛素 有24个氨基酸残基位置始终不变 A