第四章荧光光谱.ppt

第四章分子荧光光谱法 第一节概述 分子发光包括荧光 fluorescence 磷光 phosphorescence 化学发光 chemiluminescence 和散射光谱 scatteringspectrum 等 利用某些物质被紫外光照射后所产生的 能够反映出该物质特性的荧光 以进行该物质的定性分析和定量分析称为荧光分析 特点 灵敏度高 10 9 10 12数量级 选择性高吸收 发射两过程 基本原理 1 1荧光和磷光的产生1 2激发光谱和发射光谱1 3分子荧光和磷光的影响因素 1 1荧光和磷光的产生 1 单重态和三重态 多重度M 2S 1 荧光和磷光体系部分能级图 1 振动弛豫 当分子吸收能量后可能从基态的最低振动能层 0 跃迁到激发态的较高的振动能层上去 2 内转换 内转换指的是相同多重度等能态间的一种无辐射跃迁过程 3 外转换 激发态分子通过与溶剂分子或其他溶质分子间的相互作用和能量转移 而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的去活化过程称外转换或碰撞熄灭 这一现象称为 熄灭 或 猝灭 4 系间跨越 系间跨越指的是不同多重度状态间等能态间的一种无辐射跃迁过程 1 2激发光谱和发射光谱 1 激发光谱 选择荧光 磷光 的最大发射波长为测量波长 改变激发光的波长 测量荧光强度的变化 2 发射光谱简称荧 磷 光光谱 将激发光的波长固定在荧 磷 光最大发射波长处 测定不同发射波长处的荧 磷 光强度 即得到荧 磷 光发射光谱 萘的激发光谱 I 荧光光谱 II 和磷光光谱 III 蒽的乙醇溶液的荧光光谱 右 和吸收光谱 左 1 3分子荧光和磷光的影响因素 1 量子效率 分子结构对量子产率的影响 1 跃迁类型大多数荧光化合物都是由n 或 跃迁激发 且 跃迁的量子效率较高 kf值较大 2 共轭效应 含有低能量的 跃迁能级的芳香官能团化合物的荧光最强 而且也是最有用的 任何有利于提高 电子共轭程度的结构改变 都将提高荧光效率 并使荧光波长向长波方向移动 例如 在多烯结构中 ph CH CH 2ph和ph CH CH 3ph在苯中荧光效率分别为0 28和0 68 3 刚性结构 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光 因为这种结构可以减少分子的振动 使分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用减小 也就减少了碰撞去活的可能性 同时 刚性平面结构的分子减小内转换的速率 从而增加量子效率 例如 在相同条件测得 芴和联苯的荧光效率分别为1 0和0 2 4 取代基效应 芳香族化合物苯环上被不同取代基取代时 该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的差别 一般说来 如 OH OR NH2 CN NR2等给电子基团能增强荧光 而吸电子基团 如 COOH C O NO2 NO 卤素离子等 会减弱甚至会猝灭荧光 苯环取代基的影响 化学环境对荧光 或磷光 的影响 8 巯基喹啉的荧光峰的位置和荧光效率与溶剂介电常数的关系 温度对荧光强度的影响 温度对荧光强度的影响较大 温度上升使荧光强度下降 其中一个主要原因是 当温度升高时 由于分子的振动频率的增加和介质的粘度减小而使外转换去活化的几率增大 因此为了提高灵敏度 荧光分析应在较低的温度下进行 溶液pH值对荧光强度的影响 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一般都与溶液的pH有关 不同的pH值的溶液 荧光强度和荧光波长可能也不同 因此在荧光分析中要严格控制溶液的pH值 例 苯酚在酸性条件下是对分子状态存在 能产生荧光 但在碱性条件下电离成苯酚阴离子却没有荧光 但对 萘酚来说 正好相反 萘酚酸性溶液中以分子状态存在时无荧光 而在碱性溶液离子化后有荧光 荧光的猝灭 荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭 引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂 i 碰撞猝灭 ii 静态猝灭 iii 溶解氧的猝灭 iv 荧光物质的自猝灭和自吸收 荧光的强度与浓度的关系 荧光强度If正比于吸收的激发光的光强 即If K I0 I 式中I0是入射光强度 I是通过厚度为b的介质后的光的强度 常数K 取决于量子效率 又根据beer定律 I I0 10 bc式中 是荧光物质分子的摩尔吸光系数 c为荧光物质的浓度 将此式代入上式得 If K I0 1 10 bc K I0 1 e 2 303 bc 这种线性关系只有当2 303 bc 0 05 即在极稀的溶液中成立 荧光物质浓度较高时 由于自猝灭现象和自吸收等原因 使荧光强度与浓度不呈线性关系 荧光光谱仪 一般组成 激发光源 选择激发光波长和荧光波长的单色器 样品池 检测器和读出 记录 设备 光路结构图 激发单色器 发射单色器 样品室 光电倍增管 参比光电倍增管 光源 氙灯 分束器 白光反射器 吸光度补偿池 实验技术 应用 1 定量分析 1 校准曲线法荧光分析中一般多采用校准曲线法 2 比较法首先绘制已知某测定物质的荧光校准曲线 然后配一个