细胞工程知识点总结.doc

细胞工程：以生物细胞或组织为研究对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的的利用或改造生物遗传特性，以获得特定细胞、组织、产品或新型物种的一门综合性学科。1. 微繁殖：是指在离体培养条件下、将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行无菌培养，经过不断地切割和重复培养，使其增殖并再生形成完整植株，在短期内获得大量遗传性均一的个体的方法。 2. 繁殖系数：经一次增值培养或在一定时间段内由一个繁殖体所增殖获得的总繁殖体数或苗数。3. 玻璃化：也称超水化作用，是离体培养过程中试管苗发生形态、生理和代谢异常的现象。4.褐变：是指组织培养中，由于材料被切割而使多酚氧化酶活化将组织中的酚类物质氧化形成棕褐色的醌类物质，并向培养基中扩散，抑制培养物生长甚至导致其死亡的现象。5.原球茎：兰科植物的种子在萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，膨大的胚呈小圆锥状，称作原球茎。 6.茎尖分生组织：指茎尖最幼龄叶原基上方的由2或3层分生细胞组成的很小区域、一般最大直径不超过0.1mm,长度0.25mm，最小的茎尖长度仅有几十微米，有时也称顶端分生组织。7.不定芽：相对于顶芽和腋芽、由植物的其他部位或器官、组织上通过器官发生重新形成的、无固定着生位置的芽统称为不定芽。细胞细胞工程知识点绪论研究内容（根据操作对象）：1）器官组织和细胞培养2）原生质体培养3）植物胚 胎培养4）动物胚胎工程5）转基因动植物6）胚胎干细胞7）染色体工程研究内容(研究水平）；个体、器官、组织、细胞、亚细胞、分子等不同研究层次动物细胞发展经历了哪些阶段？答：细胞培养技术细胞融合技术动物胚胎移植技术体外受精技术动物克隆技术转基因动物技术胚胎干细胞技术生物工程：1）发酵工程2) 基因工程3）酶工程4）细胞工程5）蛋白质工程 （第二章没有放进来！）第三章培养原理细胞学说：1838年，主要观点：细胞是生物体的基本结构单位，由它构成整个生物个体。植物细胞的全能性：每个植物细胞都具有该物种的全部遗传信息，在适宜条件下具有发育成完整植株的能力。植物细胞全能性含义：（1）每个植物细胞都具有它母性的全部遗传特征。（2）每一个细胞都可以在特定条件下发育成为与母体一样的植株。全能性的实现：一个已分化的细胞要实现其全能性两个过程：一是脱分化，使外植体的细胞转变成胚性细胞，从而获得不断分裂的能力；二是再分化，使胚性细胞分化形成器官。条件：具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影响下解脱出来，使其处于独立发育的离体条件下；赋予离体细胞一定刺激，包括营养物质、植物激素、光周期、温度、酸碱度等。途径：1）以植物的体细胞为培养材料，可以诱导形成完整植株。2）以植物的性细胞为培养材料，可以诱导形成完整植株。3）用酶解法去除植物细胞的细胞壁，培养裸露的原生质体，原生质体发育成植物体。 4）加入促溶剂，可以诱导两个不同种的原生质体融合，继续培养可发育成杂种植株。5）将外源基因通过不同基因载体引入植物细胞，使植物细胞在分子水平上发生修饰，经离体培养后可再生成具有新性状的植物体。（转基因）植物细胞的分化：由发育起始状态的合子沿个体发育方向不断分化出形态结构、生理功能不同的细胞、组织、器官而最终形成完整植株的过程。脱分化：在某些特定条件下，分化细胞的表型也不稳定，其基因活动模式也发生可逆的变化，细胞脱离原状态而回复到分生状态。细胞脱分化的结果产生愈伤组织。成熟细胞分生细胞多细胞团形态建成完整植株外植体离体培养到再分化形成各器官三个时期：（1）诱导期（2）分裂期（3）分化期植物愈伤组织：植物受到机械、动物或微生物等伤害后，创伤部位的细胞脱分化而不断增值形成松散排列、无特定结构和功能的非器官化组织。愈伤组织的类型：胚型紧密型（胚性质地较坚实、乳白色或黄色、表面有球形颗粒）易碎型 非胚性（松散易碎、黄的或褐色、表面粗糙、生长迅速）型（乳白色或绿色、结构致密、复杂多样、生长缓慢、不宜长时间保持胚性）。型（淡黄色或黄色、结构松散、松软、呈颗粒状生长较快、能长时间保持胚性。）型（白色或灰色透明水渍状，松软无结构，形似或冰针絮状，继代易褐化而死亡。）愈伤组织的细胞组成（分生细胞、薄壁细胞、厚壁细胞和管状细胞。）分生细胞存在于分生组织和胚状体内，其细胞小，细胞核占比例大，细胞质着色深，无或少有液泡。薄壁细胞较大，细胞非圆形，核小，且被中央大液泡挤到边缘，很多薄壁细胞中不见核的存在，部分薄壁细胞已解体，胞质内无或残留少量物质，残留物着色均一。厚壁细胞存在于愈伤组织表面，其细胞质解体，细胞壁是通过木质化或栓质化加厚而形成的。管状分子是由薄壁细胞经细胞壁木质化次生加厚形成的，有环纹、网纹和孔纹三种类型。特性：异质性、嵌合性、变异性继代培养;固体培养简便易行，但有缺点：由于被培养愈伤组织仅一部分和培养基接触，在培养过程中，接触部位的营养物质很快被吸收掉，而从培养基其他区域补充较慢，造成愈伤组织生长不平衡。愈伤组织在培养过程中排出的有害物质在培养物附近积累。在静止放置情况下，受重力作用和单向受光等因素影响，愈伤组织极易出现极化和分化，产生微管分子和结节等分化细胞，最终难以获得均一的细胞群体。液体培养的优点：在液体培养基中愈伤组织一手营养均衡，易获得均一的细胞群体；愈伤组织块在液体震荡培养中会分裂成更小的细胞团或单细胞，因而产生更大的吸收表面积。在液体培养基中，体细胞胚胎发生比固体培养基更容易。被子植物对愈伤组织的诱导较敏感；双子叶植物比单子叶植物容易诱导成功；草本植物比木本植物易产生愈伤组织及进行其后的形态建成。极性：在器官、组织甚至细胞中，在不同的轴向上存在某种形态结构和生理生化上的梯度差异。造成了细胞内生活物质的定向和定位。1. 生长素：IAA NAA IBA 2-4D 2.细胞分裂素：KP ZP玉米素6-BA 促进细胞分裂调节作用发生在有丝分裂准备期，即G2期。3.脱落酸：ABA 低水平的ABA有利于胚性愈伤组织的形成。ABA的效应与外植体的发育时期有关。4.乙烯：Eth乙烯抑制剂可促进高度胚性愈伤组织的形成。培养条件的影响 P48器官发生：植物根、茎、叶、花、果实等器官的分化与形成。生长素和细胞分裂素之间的平衡控制器官发生。发生方式：直接发生途径：直接产生不定芽。间接发生途径：先产生愈伤组织生长中心形成器官原基及器官形成。影响器官发生的因素：体细胞胚胎：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。（SE）体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚。体细胞胚起源于非合子细胞，区别于由受精卵发育而成的合子胚。体细胞经过了胚胎发育过程，具有胚根、胚芽和胚轴的完整结构。与合子胚区别：无真正胚柄子叶常不规范体积明显小无明显的休眠期，心形期后可直接分化为植株。与器官发生的比较：一：体细胞胚最根本特征两极性：即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端；器官发生是单极性的。二：体细胞胚的维管组织分布是独立的“Y”字形结构，与外植体组织无结构上的联系，出现所谓的生殖隔离现象。三：由体细胞胚形成的再生植株其遗传性相对稳定，变异性远小于由器官发生途径形成的再生植株。来源1.直接从外植体上产生体细胞胚（在一定的培养条件下，许多离体培养的植物器官外植体表面已分化细胞脱分化后均可产生胚状体。）2.由愈伤组织产生（离体培养时，存在于愈伤组织内部的一些薄壁细胞开始分裂，形成一个球形的分生中心，球形胚进一步发育成心形胚至鱼雷形胚。） 3.悬浮培养中由胚性细胞复合体表面产生。4.由悬浮培养中游离的单细胞产生。 5.由单倍体细胞产生。影响体细胞胚发生因素（1）氮源（2）生长素（3）组织起源 P54人工种子技术：通过将植物组织培养中所产生的体细胞胚胎或胚芽等包埋在“人工胚乳”和“人工种皮”里，制成的具有播种功能、类似天然种子的颗粒。结构：1体细胞胚：胚状体、愈伤原球茎、不定芽、顶芽、腋芽2人工胚乳：养分 3人工种皮：防机械损伤、保护、干燥意义：1）人工种子能代替试管苗的快速繁殖，体细胞胚具有数量多、繁殖快、结构完整的特点。2）体细胞胚是由无性繁殖体系产生的。固定杂种优势。3）使自然条件下不结实或种子生产成本昂贵的植物得以繁殖。4）可以加入植物激素及有益微生物或抗虫、抗病农药，而赋予人工种子比自然种子更优越的特性。控制胚性细胞同步化的方法：1.抑制剂法促进细胞同步分裂2.低温处理促进细胞同步分裂 3.渗透压控制同步化法4.同步胚的分段收集筛选法 5.通气法问题：高频诱导 可能发生变异 人工种皮还存在缺陷储存、发芽技术不够成熟 工厂化生产配套设施成本过高2、愈伤组织的形成大致可分为几个时期？各有何特点？答：（1）启动期(诱导期)：主要是指细胞准备分裂的时期,需要采用合适的诱导剂,如NAA(萘乙酸)、IAA（吲哚乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）等或细胞分裂素。特征：距伤口较近的薄壁细胞略有增大，细胞质开始增多，相应的液泡缩小，核变大，呈球形，并由细胞边沿向中央移动；核仁明显变大，RNA含量增加，细胞恢复到具有分裂能力的状态，进入分裂的准备阶段，开始脱分化。（2）分裂期：进入分裂期就是脱分化的完成，同时也是再分化的开始。特征：被启动的细胞全面地进行活跃分裂。启动分裂的细胞体积变小，细胞内有旺盛的物质合成，并逐渐恢复到分生组织状态。如果此时经常更换培养液，愈伤组织就可以无限制地进行分裂而维持不分化状态。（3） 分化期（形成期）：细胞内部开始发生一系列形态和生理的变化，分化出形态和功能不同的细胞。特征：这一时期与分裂期没有明显界限，一方面细胞不断分裂增殖，形成愈伤组织，另一方面细胞开始再分化。3.愈伤组织有何生长特征？答：1、愈伤组织的类型：根据组织学外观特征及其再生方式分为：胚性愈伤组织（EC）：质地较坚实，颜色有乳白或黄色，表面具有球形颗粒，生长缓慢。又可分为：致密型、易碎型。非胚性愈伤组织（NEC）：松疏易碎，颜色有黄色或褐色，表面粗糙，生长迅速。一般只有胚性愈伤组织有再生能力。某些植物的非胚性愈伤组织经适当继代培养可转变为胚性愈伤组织。5、 培养条件下的器官发生有哪些方式？影响其发生的因素有哪些？（1）有直接发生与间接发生两种途径。（2）影响其发生的因素有：1、外源激素的影响2、物理因素：光照、温度3、外植体的生理状态4、培养物的年龄8、影响器官发生的主要因素有哪些？答:1、外源激素的影响2、物理因素：光照、温度3、外植体的生理状态4、 培养物的年龄9、何谓胚状体？胚状体与合子胚有何异同？答：胚状体离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，此现象无论在体细胞培养还是生殖细胞培养中均可以看到，因而统称为体细胞胚或胚状体。异同：细胞胚具有两极性，而器官发生是单极的。细胞胚维管组织分布是独立的Y字形结构，形成的再生植株遗传性比器官发生的稳定。10、离体培养条件下，胚状体的产生有几种方式？答：（1）、直接从外植体上产生体细胞胚由愈伤组织产生 （2）悬浮培养中由胚性细胞复合体表面产生 （3）有悬浮培养中游离的单细胞产生 （4）由单倍体细胞产生第4章 离体无性繁殖离体无性繁殖：是指在离体培养条件下，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行无菌培养，经过不断地切割和重复培养，使其增殖并再生形成完整植株，在短期内获得大量遗传性均一的个体的方法。意义：（1） 利用较少的植物材料，在无菌和人工控制条件下，不受季节限制在有限空间内实现规模化连续生产，繁殖周期短、速度快，节约大量的土地和人力资源。（2） 与脱病毒技术相结合，可以为生产上提供健康无病毒植株。（3） 繁殖苗体积微小、不携带病原菌，便于储运和种质材料交换。（4） 保持优良性状。类型 1.腋生枝型：指在离体条件下利用外植体上已有的顶芽和腋芽诱导其发育成枝并培养成苗的繁殖方式。 2不定芽型：指利用外植体上形成的不定芽培养成苗的繁殖方式。3.体细胞胚型：指通过离体外植体培养，诱导胚胎发生形成体细胞胚，再由体细胞胚发育成苗的繁殖方式。（1）成苗率低（2）胚状体的发生和发育情况极为复杂（3）再生植株有明显的遗传变异及返幼特性4.原球茎型：指由外植体培养形成原球茎，通过原球茎进行增殖并培养成苗的方式。离体无性繁殖的技术 P66生根培养基特点 试管苗的特点 移栽方法 取材灭菌接种诱导继代分化生根炼苗技术问题: 1.污染：指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 2.褐变：组织培养中，由于材料被切割而使多酚氧化酶活化将组织中的酚类物质氧化形成棕褐色的醌类物质，并向培养基中扩散，抑制培养物生长甚至导致其死亡的现象。 3.玻璃化：也称“超水化作用”，是离体培养过程中试管苗发生的形态、生理和代谢异常的现象。P69 玻璃化特点 防止方法 光自养培养P70茎尖和根尖分生组织病毒含量低的原因：（1） 分生细胞构成，无维束管，胞间连丝也不发达，病毒很难进入。（2） 分生细胞不断进行活跃的分裂增殖，消耗大量的能量，代谢旺盛，能抑制病毒的复制（3） 茎尖和根尖中内源激素浓度水平较高，抑制了病毒的复制（4） 可能跟RNA干扰有关二 脱病毒的方法及原理1.物理方法：不能杀死病毒。如热处理、低温处理。 2.化学方法：主要是抑制细胞分裂 3.生物学方法： 茎尖分生组织培养：（1） 茎尖分生组织;茎尖最幼龄叶原基上方的由2或3层分生细胞组成的很小区域，一般最大直径不超过0.1mm，长度约0.25mm，最小茎尖长度仅有几十微米。这一区域通常不含病毒，取这个组织进行培养可获得无病毒植株。（2） 供体选择：a：实用性和典型性 b：健康，病感程度轻的植株 c：生理状态和部位（3） 茎尖分生组织的分离：茎尖大小的选择要兼顾脱毒率和成活率两方面。三 植物病毒的检测及无病毒苗的保存和繁殖 1.指示植物检测法：指示植物指对某一种或某一类病毒非常敏感的植物。病毒的鉴定工作必须在防虫网室内进行。对于主要通过汁液传染的病毒可采用汁液感染法来检测。 2.血清学检测法：利用抗体和抗原在体外的特异性结合进行病毒检测的方法。 基本程序包括：抗原制备、抗血清制备和病毒鉴定三步。P773. 分子生物学检测法：通过检测病毒核酸来证实病毒的存在。二：植物离体无性繁殖主要适用于哪些植物？与常规无性繁殖相比有什么优势？ 植物离体无性繁殖主要适用于园艺观赏植物、农作物、药用植物及经济林木的种苗生产。1.周期短，便于控制培养条件。繁殖速度快，经济效益高。2.占用空间小，不受地区、季节限制。3.繁殖珍稀、濒临苗木和突变体，是优良品种培养的有效途径。4.利物保持原来品种的特性。三：离体无性繁殖中,培养物的增殖方式有哪几种？各有何特点？离体无性繁殖中,培养物的增殖方式有 4种。1腋生枝型 特点（1）繁殖率高（2）能保持植物遗传稳定性（3）可缩短林木繁殖周期。 2不定芽型 特点：（1）繁殖率非常高，但繁殖速度较慢； （2）遗传性稳定。3胚状体发生型 特点：（1）胚状体发生数量多，速度快，结构完整，繁殖系数高；（2）遗传性稳定。4原球茎型是兰花种子萌发时产生的呈珠 粒状、缩短的、类似嫩茎的器官，可萌发成苗 。四：离体无性繁殖一般可分为哪几个阶段？简述其操作的一般程序。离体无性繁殖一般可分为5个阶段。1、植株的准备：供体植株应生长旺盛、健壮、不病虫害，并尽可能生长在干净的环境中。2、无菌培养物的建立：获得无菌材料并诱导外植体生长和发育。包括从供体植株上采取外植体进行消毒、接种及启动外植体生长等程序。3、 培养物的增殖：通过反复培养使第一阶段获得的数量有限的嫩枝、芽苗、胚状体或原球茎等培养物的总量增加。4、 生根培养：将增殖阶段形成的无根芽苗转移到生根培养基上诱导产生不定根，获得健壮的具有根、芽、茎的完整小植株。 5、 试管苗的移栽及鉴定：移栽是将具根试管苗转移到土壤中的过程，是试管苗从离体培养逐步适应温室或田间生长环境的过程。六：离体繁殖中常见得技术问题有哪些? 如何克服或防止其发生？污染问题和褐变、玻璃化 污染问题预防措施、通风 、去湿、光照、防霉5、改进外植体消毒方法或使用抗生素等。褐变防治措施1、选择合适的外植体：一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体。2、合适的培养条件：无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度和光照、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。 3、使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等。4、使用吸附剂：使用聚乙烯基吡咯烷酮 、0.1%-0.5的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。玻璃化防治措施1、 降低细胞分裂素的浓度，调节激素配合2、增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的渗透势。3、降低氨态氮，提高硝态氮的含量 4、增加容器的气体交换，降低容器内相对湿度5、降低培养温度，增加自然光照6、在培养基中添加间苯三酚、根皮苷或生长抑制剂等物质。九、脱除植物病毒病有哪些方法？其原理是什么？物理方法 （1）、高温处理又称热疗法 原理:一些病毒对热不稳定,在高于常温的温度下(35-40 )即 钝化失活,繁殖力下降,失去侵染能力,而植物基本不受伤害. (2)、低温处理又称冷冻疗法 原理：降低温度能使病毒活力下降。 化学处理 (1).病毒抗血清预处理 ： 用齿舌兰环斑病毒（ORV）的血清处理兰属离体分生组织，提高了再生株中无ORV的植株频率。 (2).RNA抑制剂处理： 烟草愈伤组织培养基中加入2-硫脲嘧啶，可除去组织中马铃薯Y病毒（PVY）。放线菌D和放线菌酮能抑制原生质体中病毒的复制。 （3）.三氯唑核苷：病毒唑，化学名称1,2,4-3唑-3-酰胺-1-D-呋喃核苷，防治动物RNA病毒和DNA病毒病的广谱性抗病毒制剂。生物脱毒方法（原理：培养材料中通常不含病毒，可通过植物组织培养就行脱毒） （1）、茎尖分生组织培养 （2）、微体嫁接脱毒 （3）、愈伤组织培养脱毒 （4）、珠心胚培养脱毒 （5）、花药培养脱毒十：简述通过茎尖分生组织培养脱除植物病毒的一般程序选取感病程度轻的植株分离大小合适的茎尖分生组织茎尖分生组织培养病毒检验十二：无病毒植物的检测方法有哪些？（1）、直接检测法:直接观察 （2）、电镜检测法 3 ）、指示植物法 （4）、血清学检测法 （5）、分子检测技术：PCR技术、探针杂交技术第五章1. 植物细胞培养(plant cell culture):是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养并使其增殖，获得大量细胞群体的一种技术。2. 植物单细胞分离：由完整的植物器官中分离单细胞机械法：指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离；细胞产量低；细胞易破。酶解法：指用专一的水解酶(纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等）在温和条件下分解胞间层，分离细胞。 细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破由培养组织分离单细胞：从培养的未分化的且疏松易碎的愈伤组织中分离单细胞3 植物单细胞的培养技术：平板培养：植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。看护培养是指用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持 续分裂和增殖的培养方法。饲养层培养用处理过的、无活性或分裂慢的细胞来饲养所需培 养的细胞，使其分裂和生长。液体浅层静置培养法：将一定密度悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层封口静止培养。细胞悬浮培养法：细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态下培养。微室培养：在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法4. 植物细胞的大规模培养（p89-p95）悬浮培养：分批培养，连续培养，半连续培养固定化培养：包埋法，吸附法植物细胞大规模悬浮培养的优点1）可以增加培养细胞与培养液的接触面，促进营养吸收。2）可带走培养物产生的有害代谢产物，避免高浓度积聚对细胞的伤害。3）保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递效果细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期，使细胞保持相对一致的细胞学和生理学状态，便于研究细胞分裂和细胞代谢。细胞固定化:将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态，进行无菌培养的一种技术。细胞固定化意义1）细细胞生长较慢，有利于次生代谢物的积累。2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。4）有利于进行连续培养和生物转化。5. 影响次生代谢产物的因素1）生物因素：细胞株，细胞凋亡，细胞团，生物合成机制2）化学因素：营养盐，前体，诱导子，反馈抑制3）物理因素：光照，温度，PH4）工程技术问题：培养液的流变特性，气体传递，搅拌与剪切力，泡沫与器壁表面粘附性 P92 细胞生长量的计算提高次生代谢产物产量的途径1）培养设备：选择或设计合适的生物反应器。2）培养工艺：诱导子添加、前体喂养、添加竞争途径代谢产物抑制剂、培养条件（培养基、环境条件）优化与控制、流加培养、起始材料的选择。3）培养技术：固定化培养技术、两相培养技术、两步法培养（第1 步细胞生长；第2 步产物积累）、毛状根培养技术、冠瘿培养技术、反义技术）。6、 植物细胞生物反应器：用于植物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。要求：具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。根据大规模培养方法主要分为悬浮培养生物反应器和固定化培养生物反应器两种。7、 初级代谢产物：通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等。8、次级代谢产物：通过次级代谢合成的产物，是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。9、 生产次生代谢物的程序：（1）诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系；（2）筛选高产细胞系(株)；（3）在生物反应器中进行大规模培养，获得所需次生代谢物； 培养条件p103 前体饲喂 诱导子10、 细胞系：由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。11、 细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株7. 什么是悬浮细胞培养?固定化培养?答：细胞悬浮培养法：指将细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态下培养。与固体培养相比。悬浮培养优点：增加培养细胞与培养液的接触面积，改善营养供应，避免有毒代谢产物的聚集，保证氧气的充分供应等。悬浮培养类型：成批培养、连续培养和半连续培养。 细胞固定化：指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态，进行无菌培养的一种技术。包括包埋法和吸附法。细胞固定化意义1）细胞生长较慢，有利于次生代谢物的积累。2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。4）有利于进行连续培养和生物转化。8.植物细胞大规模培养体系的建立程序是怎样的?答：诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系筛选高产细胞系(株)在生物反应器中进行大规模培养，获得所需次生代谢物1、 分离植物单细胞的方法有哪些？答：a、机械法：先将叶片常规消毒后于无菌条件下轻轻研碎，在经过一定孔径的不锈钢筛网过滤和离心得到净化细胞；b、酶解法：利用果胶酶和纤维素酶处理植物叶片，使细胞分离；c、愈伤组织诱导法。、2、 植物单细胞培养的方法有哪些？各有何特点？答：a、平板培养法特点：单细胞在培养基中分布均匀，便于定点观察，易筛选；通气差，排泄物易积累造成细胞毒害b、看护培养特点：简便、成功率高；不能在显微镜下直接观察.c、饲养层培养特点：操作简便；不能在显微镜下追踪细胞的分裂和细胞团的形成d、微室培养法特点：在培养过程中可连续进行显微镜观察；由于培养基少，水分难以保持，培养基的成分及pH 等也易于变动，细胞短期培养后往往不能再生长。e、液体浅层静置培养法特点: 易于补加新鲜培养基、可以镜检3、 什么叫细胞的悬浮培养？分批培养和连续培养各有何特点？答：悬浮培养:是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。分批培养的特点：a、有一定的气体交换；b、培养系统不与外部环境进行物质交换；c、培养体积固定。连续培养的特点：a、培养规模大；b、可以添加新鲜培养液；c、使细胞保持在对数期。4、 在细胞悬浮培养中，如何进行细胞生长量的计算？答：细胞生长量的测定一般方法有：（1）细胞计数：在显微镜下记数，以cells/ml 表示单位体积里的细胞浓度（2）细胞密实体积（PCV）：以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。测定时，将细胞离心于离心管内，测定细胞层所占的体积。（3）细胞鲜重或干重：过滤后直接称重为鲜重，干燥后再称得到的是干重。（4）有丝分裂指数（MI）：是指在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。对于愈伤组织有丝分裂指数的测定一般采用富尔根染色法。对于悬浮培养的细胞则先离心，然后置于载玻片上用乙酸洋红染色并镜检。5、 悬浮培养细胞同步化的方法？答：A、物理方法(1)体积选择法: 将培养一段时间的细胞经过一定大小的筛网过滤,收集筛网上层的细胞;再经过较小孔径筛网上面的细胞.选择每一孔径筛网过滤得到的细胞分别再进行培养.(2)冷处理法: 收集细胞,在4温度下处理数天,添加新鲜培养液培养.B、化学方法(1) 饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1 期或G2 期，经过一段时间的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。(2)抑制法：通过向培养基中添加尿苷(1g/ml),5-氟脱氧尿苷(2 g/ml)等化学抑制剂抑制细胞分裂,可使培养细胞同步化。(3)有丝分裂抑制法:在指数生长期的细胞悬浮培养物中加入一定浓度的秋水仙素。6、 如何提高植物次生代谢产物的产量？答：A、筛选得到高产细胞系（株）常用方法有：（1）、克隆选择（有相同遗传基因的细胞群）：指通过单细胞克隆技术和细胞团克隆技术，将培养细胞中能够积累较多次生代谢物且具有相同遗传基因的细胞群挑选出来，并加以适当的培养形成高产细胞系。（2）、抗性选择：指在选择压力下，通过直接或间接的方法得到抗性变异的细胞系。（3）、诱导选择：是通过化学诱变或紫外线照射等各种物理化学方法诱变产生比原亲本细胞全成能力高的细胞系（株）B、培养条件（1）、适宜温度（2）、不断调节PH（3）、营养成分：一方面要满足植物细胞的生长所需，另一方面要使每个细胞都能合成和积累次生代谢产物。（4）、光：包括光强、光质和光照时间对细胞生长和次生代谢产物合成都有一定影响。（5）、通气量和搅拌转速（6）、前体饲喂。7、活力鉴定的方法。答：a、相差显微镜观察法：在相差显微镜下观察细胞质环流和正常细胞核的存在与否来鉴别细胞的活性；b、FDA 染色法：FDA 既不发荧光也不具极性。能自由地穿越细胞质膜；c、伊凡蓝染色法：利用0.025%的伊凡蓝溶液对细胞进行处理时，只有活力受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，而完整的活细胞则不不能摄取，所以不染色的细胞为活细胞。第六章植物原生质体培养和体细胞杂交植物细胞原生质体：除去细胞壁后裸露的有活力的原生质团。用机械方法和或酶解法可除去细胞壁，得到原生质体。原生质体培养：将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长行程愈伤组织或胚胎，最后分化或发育形成完整植株的过程。体细胞杂交又称原生质替融合，是指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种细胞。细胞壁的主要成分是纤维素，半纤维素，果胶质和少量的蛋白质。去除细胞壁，获得大量有活力的植物原生质体是进行原生质体培养和体细胞杂交的前提和基础。一. 原生质体的分离（一）材料来源1.植物幼嫩的叶片 2.无菌实生苗的子叶和下胚轴 3.外植体来源的愈伤组织和悬浮培养细胞系 4.花粉细胞（二）材料的预处理：枝条暗处理，低温处理，叶片萎蔫处理，预培养，药物及添加物处理和预先质壁分离处理等。（三）酶的种类及酶液配制1.酶的种类：纤维素酶类，果胶酶类，蜗牛酶和胼胝质酶。在分离原生质体时，常常将纤维素酶和果胶酶混合使用，利用果胶酶分解果胶质的特性从组织中将细胞游离出来，再在纤维素酶的作用下，把细胞壁分解而释放出原生质体。2.酶液配制：分离培养基，酶和渗透压稳定剂组成。植物材料经酶液处理后的混合物中，除了完整无损的原生质体外，还有混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，细胞团和破碎的原生质体等。（一）过滤-离心法 （二）漂浮法 三）界面法活力测定：形态识别法和染色法。染色法:1.荧光素二乙酸脂染色法（当紫外光照射时，荧光素便产生绿色荧光；而无活力的原生质体不能分解FDA,因此无荧光产生。）2.伊凡蓝染色法（有活力但受损伤的细胞或死细胞能摄入，而完整的活细胞则不能。）3.酚藏花红染色法（酚藏花能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原原生质体不染色。）原生质体数量和活力的因素：(一)材料的基因型和外植体(二)酶的种类、浓度与酶解时间(三)渗透压稳定剂(四)质膜稳定剂(五)酶解方式(六)酸碱度(七)温度和光照原生质体的培养意义：第一建立单细胞无性系，第二用于原生质体融合，第三遗传转化的良好受体，第四多种基础理论研究的实验材料。培养方法：液体浅层培养，固体平板培养和固液双层培养三种。(一)液体浅层培养。优点：操作简单，对原生质体伤害小，通气性好，代谢物易扩散，形成细胞团或小愈伤物组织后也易于转移。缺点：原生质体在培养基内分布不均，常发生粘连或造成局部原生质体的密度过高，从而影响原生质体再生细胞的进一步生长发育。(二)固体平板培养，优点：原生质体的位置被固定，可以避免细胞间有害代谢产物的影响，有利于单个原生质体的细胞壁再生以及细胞团的形成全过程进行定点观察，易于统计分裂频率和植板率。缺点：操作要求比较严格，特别是原生质体悬浮液与琼脂糖培养基混合时温度必须合适。(三)固液双层培养，优点：当液体培养基蒸发完消耗完时，分裂的小细胞团会散落在固体培养基上而被固定，估计培养基中的成分也可以缓慢地释放到培养基中，补充营养的消耗。植物再生过程1.细胞壁再生 2.细胞分裂 3.植株再生影响原生质体的培养因素：(一)材料1.基因型 2.原生质体的来源（2） 培养基1.基本培养基2.无机盐3.激素4.活性物质5.酸碱度(三)渗透压稳定剂（四）原生质体的培养浓度（五）培养条件1.光照2.温度原生质体步骤1材料准备（选材）2 原生质体分离（预处理） 3原生质体纯化 4原生质体培养 5体细胞胚的诱导与植株再生体细胞杂交意义 P125融合类型自发融合：当细胞壁溶解后，胞间连丝发生膨大，相邻细胞原生质体和细胞器通过膨大的胞间连丝融合形成同核体，实现原生质体的自发融合。诱发融合：将植物原生质体制备出后，再加入诱导剂或其他方法促使两亲本原生质体融合的方法。（一）化学诱导融合法1.无机盐诱导融合法NaNO3 能诱导原生质体融合的原因是钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触，促进细胞融合。2.高PH-高钙离子诱导融合法钙离子决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的融合；高PH 既能够改变质膜的表面电荷，也能促进原生质体的集聚和融合。3.PEG 诱导融合法PEG 是一种多聚化合物，由于PEG 分子具有轻微的负电性，可与具有正极集团的水、蛋白质和糖类等形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，从而使原生质体发生粘连。优点：成本低无需特殊设备融合细胞率高4.PEG-高PH-高钙离子诱导融合法PEG 是相邻原生质体表面的分子桥。当PEG 被高PH、高钙离子洗掉时，可能引起原生质层表面电荷的紊乱和再分布，从而促进了融合。体细胞杂种的筛选:1.互补选择法生长互补选择法营养缺陷性互补选择法抗性互补选择法细胞代谢互补选择法2.机械选择法:#利用融合亲本的形态色泽上的差异筛选杂种细胞#利用荧光素标记分离杂种细胞#利用荧光激活细胞分选仪自动分离杂种细胞再生植株的鉴定:1.形态学鉴定2.细胞学鉴定3.同工酶鉴定4.分子生物学鉴定1，目前用做原生质体分离的材料主要有哪些？优点？答：原生质体的来源：(1) 来自各种植物的幼嫩的叶片、根尖，其中叶片由于取材容易而广泛采用。（2）来自花粉，尤其是适合制备单倍体的原生质体。（3）从组织培养产生的愈伤组织中获得2、试述原生质体分离的方法和步骤答：(1)机械法：在细胞质壁分离的状态下，用利刀切割细胞壁,使原生质体流出或释放出来(2)酶解法：常用的制备原生质体的酶包括；果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶等。实际应用中需要根据不同的细胞来源选择合适的酶。酶解法分： 顺序法（两步法）：先用果胶酶预处理，再用纤维素酶直接法（一步法）：直接用果胶酶和纤维素酶优点：获得量大，适用广泛。缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。3、影响原生质体分离效果的因素有哪些？试做分析答：供试材料的基因型和外植体酶解条件：酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度、渗透压稳定剂质膜稳定剂分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间、分离用具4、原生质体纯化主要有哪些方法？答：1、过滤-离心法2、漂浮法：原生质体比重较小,能在具有一定渗透压的溶液(如25%的蔗糖溶液)中漂浮，然后用吸管收集。转入另一管中，如此反复离心、悬浮23 次，即可获得纯原生质体。优点:制备的原生质体较纯净.。缺点:丢失的较多3、界面法：又称不连续梯度法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时保持着相同的渗透强度使原生质体免受渗透冲击而受损。5、为什么原生质体要培养在等渗培养基中？答：只有培养在等渗培养基中植物才能正常生长如果植物的原生质体培养在非等渗培养液中植物有可能会因为浓度差而吸水或是失水从而导致植物的死亡，所以植物的原生质体要培养在等渗培养基中。6、原生质体培养中如何稳定培养基的PH？答：分离原生质体时，酶液的pH 值是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH 值是不一致的。为了维持酶液的PH 恒定，常用0.05-0.1mol/L 的磷酸盐溶液来配制酶液。此外，MES 对保持酶解物的酸碱环境也有缓冲作用。7、试分析影响原生质体培养的主要因素供试材料的基因型和外植体酶解条件：酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度渗透压稳定剂质膜稳定剂分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间。分离用具8、 原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点？液体浅层培养法： 优点： 原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点： 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。双层培养法液体-固体双层培养法： 优点： 固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点： 不易观察细胞的发育过程。固体薄层培养法优点： 使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。缺点： 培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d 左右。9、 为什么说原生质体培养系统是现代生物技术的载体？（1）原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。（2）用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。10、 原生质体融合要经过哪些过程？(1)选择亲株为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。(2)原生质体制备去除细胞壁是制备原生质体的关键。一般都采用酶解法去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。(3)原生质体融合早期的原生质体融合实验中，曾采用离心力作用使两种细胞的原生质体紧紧挤在一起以帮助融合，或者在冷的渗透稳定剂中使原生质体密集凝聚，但这些方法的效果不佳。(4) 原生质体再生原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。11、 PEG 融合与电融合,何电融合的原理是什么？ PEG 法特点：融合频率高；诱发融合无特异性；毒性较低. (PEG原理)电融合特点：(1)融合率高、重复性强、对原生质体伤害小。(2)装置精巧、方便简单、可在显微镜下观察或录像融合过程。(3)免去PEG 诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。电融合的原理：交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。12、 PEG 融合法的技术关键是什么？电融合的关键技术是什么？ PEG 法融合PEG 为一种高分子化合物，由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。当PEG 分子足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。PEG 也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG 之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG 分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。高Ca2+，高pH 清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率。洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。电融合是将制备的游离细胞或原生质体，置于电融合室中，在高频交流电场的作用下，细胞被极化，成为偶极子，造成细胞之间相互连接，如果施加的高频交流电压(即正弦波的p-p 值)过高或作用时间过长，则细胞连接成串珠状，应适当控制以上条件，尽量使两细胞处于点接触状态，然后施加方波脉冲予以刺激，由于电脉冲的瞬间作用，可击破两细胞接触点部位的质膜，此时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，使两细胞融合逐步完全。13、对称融合与非对称融合的细胞杂交有何异同？异：对称融合是两个细胞的细胞核和细胞质都保留在融合后的细胞里；非对称融合则是少了一方的细胞核或细胞质 同：都是细胞融合14、体细胞杂交有哪些遗传特征？如何进行鉴定？体细胞杂交不能定向改变生物遗传的特性，只会母系遗传就是说母亲的性状才会遗传父亲的不会鉴定：形态学鉴定，细胞学鉴定，同工酶鉴定，分子生物学鉴定，15.原生质体融合产物有哪些类型？ 自发融合、诱发融合16.试述杂种细胞的选择方法？答：一、互补选择法：（1）生长互补选择法（2）营养缺陷型互补选择法（3）抗性互补选择法（4）细胞代谢互补选择法二、机械选择法：（1）利用融合亲本的形态色泽上的差异筛选杂种细胞（2）利用荧光素标记分离杂种细胞（3）应用荧光激活细胞分选仪自动分离杂种细胞17.如何用分子生物学方法鉴定杂种植株？（1）RAPD 检测，是在DNA 水平上迅速、有效的鉴定体细胞杂种的简便方法。（2）RFLP 检测，具有种的特异性和遗传稳定性，能直接发现同源染色体上核苷酸碱基序列的差异。18.体细胞杂交有何意义？答：（1）实现远缘杂交，形成新的物种。（2）创造细胞质杂种。（3）培育作物新种质和新品种。第七章植物花药和花粉培养及单倍体育种花药培养：（器官培养）是用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上，诱导其分化，并连续进行有丝分裂，形成细胞团，进而形成愈伤组织或分化成胚状体，最后形成完整的植株的过程。花粉培养：（细胞培养）在无菌条件下，将花粉从花药中游离出来，使其成为分散或游离态，发育成单倍体植株的过程。花药与花粉培养的意义？1诱导形成单倍体，快速获得纯系；2有利于筛选隐性突变体，提高选择效率； 3获得无病毒个体；4基础研究的良好材料。花药培养1.选材： 选择适宜培养的植株材料； 将适宜的母株置于一定温度、光照、湿度下培育，获得健康母株；选择司令的供体植株；（一般为幼年植株的花药培养力强）确定花粉细胞所处阶段。（单核小孢子阶段花粉最具活力）2. 预处理：雄核发育：通过花药培养产生单倍体植株的过程。原理：抑制花粉细胞正常发育成配子体而进入孢子体发育阶段，直接发育成单倍体植株。 低温预处理：指在接种之前将培养材料用0以上的低温处理后，再接种到适宜的培养基上进行培养。（最有效的方法）到正常培养条件下进行培养，提高花粉诱导率。热击处理：接种花药后，先在较高温度下培养（3035），再转移到正常温度下继续培养的方法。化学预处理甘露醇：外植体离体条件下，一定浓度的甘露醇预处理可以提高花药愈伤组织诱导率。 糖类：接种前，高浓度的糖溶液预处理后，再转移