评价肺炎链球菌疫苗免疫效果的功能性抗体检测方法的建立.docx

功能性抗体检测方法的建立强李江 姣杜 慧 竟石 继 春徐 苗叶中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室 ，北 京 100050摘 要 目 的 建立肺炎球菌疫 苗免疫效果评价的功能 性抗体滴度检测方法 。 方 法 参考美国阿拉巴马大学 的多 重调 理 吞 噬 实 验 （MOPA）方 法 ，构 建 并 鉴 定 HL-60 效 应 细 胞 库 、肺炎 球菌工作菌种库和补体 ；在 此 基 础 上 对 5 份血 清 样 本 进行调理吞噬活性检测 。 结 果 HL-60 细胞分化后表面 标 志表达量 CD35 为 71.78，CD71 为 10.97， 活 细 胞 比例 为 72.96%。 13 个血清型的肺炎链 球菌工作菌种的冻存复活率均高于 90%；抗 生 素 抗 性 与敏 感 性 与 预 期结 果 一 致 ；工 作 稀 释 度 均1000。补体的非特异性杀 菌率均70%。血清样本的杀 菌曲线均为标准的 S 型 ，平 行 孔间的差异不超过 3 倍 。 结 论 效 应 细 胞 、工 作 菌 种 、补体及血清样本的检测结 果均符合阿拉巴马大学参考 方法 的 标 准 要 求 ，成 功 建立 了 基 于 MOPA 的 功 能 性 抗 体检 测 方 法 。关键 词 肺 炎 链 球 菌 ；疫 苗 ；功能 抗 体 ；调 理 吞 噬 试 验中图 分 类 号 R392文 献 标 识 码 A文章 编 号 1673-7210（2014）07（b）-0004-05Establishment of functional antibody detection method for evaluation ofpotency of pneumococcal vaccineLI Jiangjiao DU Huijing SHI Jichun XU Miao YE QiangKey Laboratory for Standardization of Methods for Quality Control of Biotechnical Products, Ministry of Health, NationalInstitutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, ChinaAbstract Objective To establish the functional antibody detection method for evaluation of immune effect of pneu- mococcus vaccine. Methods The effector cell cultures, working bacteria stocks and complement, which were important components of multiplexed opsonophagocytic killing assay (MOPA) method were constructed and detected for applica- bility according to the reference method published by WHO reference laboratory in US University of Alabama at Birm-ingham (UAB). The opsonophagocytic titers of five sera samples were determined using the established MOPA method.Results After differentiation of HL-60 cells, the expression of cell surface markers CD35 and CD71 were 71.78 and10.97, respectively, and the proportion of live cells was 72.96%. The percentage recovery of working bacteria stocks of all serotypes were more than 90% . The antibiotic sensitivity and resistance of the frozen assay stocks were accor- dance with the expected results. The optimal dilution factor for all the assay stocks were more than 1000. The non - specific killing rates of complement for all serotypes were less than 70%. The samples killing curves for all serotypes were sigmoid shape, and the opsonophagocytic titers of the duplicates were differ by less than 3-fold. Conclusion The detection results of the effector cell cultures, working bacteria stocks, complement and sera samples meet the require- ments of reference method of UAB, indicating the MOPA method is successfully established in this study.Key words Pneumococcus; Vaccine; Functional antibody; Opsonophagocytic assay肺炎链球菌可以引起肺 炎 、菌血症、脑 膜炎、中耳炎 等 疾 病 ， 是 儿 童 和 老 年 人 获 得 性 感 染 的 主 要 病 原苗，普遍采用的体外效力 检测方法是 酶联免疫吸 附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）， 利 用 抗原-抗体的特异性结合特性对待 测血清中的 抗体水平进行检测3；但该类方法只能检测抗 体的总含量 ，无法将功能性抗体甄别出来 ，不能 真实反映疫 苗的免疫保护效果。 事实上，对于一些特殊人群 ，如老年人和免疫系统不完善的人群 ，接 种疫苗后产 生的抗体往 往是非功能性抗体，不能发挥免疫保护作用4-5。 可见，如果单纯以抗体含量来评估 疫苗质量 ，很 可能无法准 确鉴菌1；接种肺炎链球菌疫苗可以有 效预防肺炎 链球菌感染2。 为了保证疫苗质量，所有肺炎链球菌疫苗上市前 均 需 对 其 免 疫 保 护 效 力 进 行 测 定 。 目 前 针 对 该 疫基 金 项 目 国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 （863 计 划 ） 项 目 （ 编号 2012AA02A402）；中国食品药品检定研究 院中青年 发 展 研 究 基 金 （编号 2012B15）。通讯 作 者 4 CHINA MEDICAL HERALD Vol. 11 No. 20 July 2014 论著 中 国 医 药 导 报 2014 年 7 月 第 11 卷 第 20 期定疫苗的保护效力。 因此 ，迫切需要建 立能够准确 反映功能性抗体含量的检定方法 ，以便能够正 确评估肺炎链球菌疫苗的保护效力和质量。肺 炎 球 菌 疫 苗 的 保 护 机 制 主 要 是 通 过 特 异 性 抗体介导的调理吞噬作用将体内的肺炎球菌清除 。 所谓 调理吞噬作用是指抗体 、 补体与吞噬 细胞表面结 合 ， 促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用 。 由此可 见，注射疫苗后只有机体 产生能够有 效介导调理 吞噬 作用的功能性抗体， 才能发挥 真正的免疫 保护作用 。 通 过 体 外 调 理 吞 噬 实 验 （opsonophagocytic assay， OPA） 检 测 抗 体 的 调 理 吞 噬 活 性 ， 能 够 直 接 反 映 功 能 性抗体含量 ，实现对疫苗保护效力的准确评估6。 已有 多项研究表明，OPA 与疫苗临床有效性的相关性要高 于 ELISA7-8。近年来， 国际 上多个 实 验 室 开 始 致 力 于 OPA 技 术的研发，试图建立一套稳定 、可靠、标准化 的检测方 法。美国阿拉巴马大学通过长期探索，建立了优化的多 重 调 理 吞 噬 实 验 （multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA），可 同 时 对 4 种 血 清 型 的 肺 炎 球 菌 功 能 抗 体 进 行 检 测 ，简 化 了 实 验 流 程 ，减 少 了 工 作 量 并 节 约血清 样本，提高了 OPA 技术的检测 通量9。 并 且 国 外部分药 企已经开始 采用 OPA 方法 进 行 肺 炎 链 球 菌疫苗的临床效力评价8，10-11。 但由于该方法操作较为复 杂 ，技 术 要 求 高 ，目 前 国 内 该 方 法 的 研 究 和 应 用 比 较 缺 乏 。 本 研 究 参 考 美 国 阿 拉 巴 马 大 学 大 学 的 MOPA 实 验 ，结 合 国 内 的 实 际 情 况 ，旨 在 建 立 一 套 适 合 我 国 应用的肺炎链球菌疫苗效力评价方法。1 材料与方法1.1 材料HL-60 细 胞 系 购 自 美 国 ATCC（CCL-240）；13 个 血清型的肺炎链球菌菌株（带有特定抗生素抗性）来源 于美国阿 拉巴马大 学 伯 明 翰 分 校 Moon H Nahm 实 验 室 ；5 份 血 清 样 本 来 源 于 23 价 肺 炎 球 菌 多 糖 疫 苗 免 疫 后 的 健 康 人 群 ；SPF 级 新 西 兰 乳 兔 （34 周 龄 ）由 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 卫 生 部 生 物 技 术 产 品 检 定 方 法及其标准化重点实验室提供。1.2 试剂BactoTMTodd Hewitt Broth （THB）（批号：3071477）、 酵母提取物（批号：2220095）购自 Becton Dickinson 公司； RPMI1640（批号：1393807）、胎牛血清（批号：1428479） 购 自 Gibco 公 司 ； 二 甲 基 甲 酰 胺 （DMF） （ 批 号 ：3345C432）、2，3，5-氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 （TTC）（批 号 ：2532B313）购自 Amresco 公司 ；Anti-CD11b PE（批号：2184659）、Anti-CD35PE （ 批 号 ：2326940）、Anti -CD71PE（批号：2292633）、Annexin V FITC（批号：2202518）、Propodium Iodide （PI） （ 批 号 ：SLBB4626V） 和 AnnexinV Binging Buffer（批号：30435）购自 BD Pharmingen 公司；4 种抗生素：奥普脱欣（Optochin，批号：051M1257V）、奇霉素（Spectinomycin，批号 ：102K05447V）、甲氧苄氨 嘧啶（Trimethoprim，批号：BCBC9232V）、链霉素（Strep- tomycin，批号：2036B318）购于 Sigma 公司。1.3 仪器菌落计数器 （型号：ProtoCOL 3）购自英 国 Synbio- sis 公 司 ； 流 式 细 胞 仪 （ 型 号 ：FACS Calibur） 购 自 美 国 BD 公司。1.4 HL-60 细胞的培养及主代细胞库的建立从 ATCC 购 买 的 原 始 HL-60 细 胞 经 复 苏 、 增 殖 培养、再冻存建立一个主代细胞库（80 管）。1.5 HL-60 细胞的分化及鉴定使用 DMF 诱导 HL-60 细胞分化 5 d，用流式细胞 仪进行检测。 具体分化步骤及鉴定方法参考文献12。1.6 肺炎链球菌工作种子批的制备及鉴定1.6.1 肺 炎 链 球 菌 工 作 种 子 批 的 制 备 来 源 于 美 国 阿 拉 巴马大学 的各型肺炎 链球菌 ，37培 养 过 夜 后 转 移 至 THY 液 体 培 养 基 中 继 续 培 养 至 OD600 为 0.60.9， 收集培养液加 80%甘油混匀后分装冻存，制 备工作种 子批。1.6.2 冻 存 菌 种 活 力 检 测 将 冻 存 菌 种 与 未 经 冷 冻 的 细 菌 同 步 稀 释 后 ，37过 夜 培 养 后 进 行 菌 落 计 数 ， 计 算冷冻细菌的复活率。1.6.3 冻 存 细 菌 抗 生 素 抗 性 及 敏 感 性 检 测 在 分 别 含4 种 抗 生 素 （ 奥 普 脱 欣 、 奇 霉 素 、 链 霉 素 、 甲 氧 苄 氨 嘧 啶 ）的 培 养 基 和 不 加 抗 生 素 的 对 照 培 养 基 中 ，划 线 接 种 13 个型的肺炎链球菌 ，37培养过夜后进行观察 。1.6.4 冻存细菌工作稀释度的 确定 按照参 考文献12的 方 法 进 行 工 作 稀 释 度 的 测 定 。 选 择 菌 落 数 为 80120 cfu/spot 的稀释度作为最佳稀释度 。1.7 补体制备及鉴定取 SPF 级 新 西 兰 乳 兔 颈 动 脉 采 血 获 得 补 体 ， 按 照 文 献 12 的 方 法 测 定 该 批 次 补 体 的 非 特 异 性 杀 菌 率 。1.8 调理吞噬试验将 待 测 血 清 在 56水 浴 中 灭 活 30 min， 按 照 参 考 文 献12的 方 法 进 行 操 作 。 经 菌 落 计 数 后 ，用 软 件 Opsotiter3 计算样本的调理吞噬滴度 。2 结果2.1 HL-60 细胞的表面标志鉴定和活力测定经测定 ，未 分 化 的 HL-60 细 胞 表 面 标 志 表 达 量 ：CD35 为 7.03 ，CD71 为 88.87 ， 活 细 胞 比 例 为88.89%（图 1）。 HL-60 细胞在诱导分化 5 d 后表面标CHINA MEDICAL HERALD Vol. 11 No. 20 July 2014 5 论著 中 国 医 药 导 报 2014 年 7 月 第 11 卷 第 20 期志 表 达 量 ：CD35 为 71.78，CD71 为 10.97， 活 细 胞比例为 72.96%（图 2）。 阿拉巴马大学参考方法的标准规定，分化后 活 性 细 胞 比 例 应65%，CD35 表 达 应55，CD71 表达应20。 本实验测得的各项指标均 符合阿拉巴马大学参考 方法的各项 质量标准 ，可 用作OPA 实验的效应细胞 。图 3肺 炎 球 菌 工 作 菌 种 的 抗 生 素 抗 性 及 敏 感 性 鉴 定2.3 补体的非特异性杀菌率经计算，制备的补体非特异性杀菌率 ：1 型为7，3 型 为 9，4 型 为 35，5 型 为 1，6A 型 为 58，6B型 为 57，7F 型 为 12，9V 型 为 36，14 型 为 35，18C 型 为 1 ，19A 型 为 5 ，19F 型 为 4 ，23F 型 为47。 符合阿拉巴马大学标准中非特异性杀菌率应70%的质量标准 。2.4 血清样本的调理吞噬指数检测2.4.1 杀菌曲线 5 份 血清样本的 杀菌曲线见 图 4。 图 中可见，各血清样 本针对各型 肺炎球菌的 杀菌曲线均 为标准的 S 型曲线。2.4.2 调 理 指 数 经 菌 落 计 数 及 软 件 Opsotiter 3 的 计 算，各血清样本的调理指数结果见表 1。3 讨论OPA 实验中涉及四个主要元素：效应细胞、靶菌、图 1 未 分 化 HL-60 细 胞 表 面 标 志 表 达 量 及 细 胞 活 力 检 测图 2 HL-60 细 胞 分 化 后 表 面 标 志 表 达 量 及 细 胞 活 力 检 测2.2 肺炎链球菌工作菌种的鉴定2.2.1 冻 存 工 作 种 子 的 复 活 率 结 果 显 示 ，13 个 血 清 型 的 冻 存 肺 炎 链 球 菌 工 作 菌 种 的 复 活 率 分 别 为 ：1 型94% ，3 型 92% ，4 型 96% ，5 型 95% ，6A 型 94% ，6B型 93% ，7F 型 91% ，9V 型 93% ，14 型 94% ，18C 型94%，19A 型 95%，19F 型 96% ，23F 型 95% ， 均 高 于90%。2.2.2 工 作 菌 种 的 抗 生 素 抗 性 与 敏 感 性 检 测 结 果 显 示， 各型工作菌种均只具 有其特定的 抗生素抗性 ，对其余 3 种抗生素均为敏感。 见图 3。2.2.3 工 作 菌 种 的 工 作 稀 释 度 确 定 13 个 血 清 型 的 冻 存 肺 炎 链 球 菌 工 作 菌 种 的 稀 释 倍 数 分 别 为 ：1 型3333 ，3 型 6250 ，4 型 2000 ，5 型 16666 ，6A 型6250，6B 型 3030，7F 型 6666，9V 型 1250，14 型1250 ，18C 型 1470 ，19A 型 10000 ，19F 型 6250 ，23F 型 6250， 均符合阿拉巴马大学标准中稀释 倍数应1000 的要求。 每个血清型对应的稀释条件下，存活的细菌数为 80120 cfu/spot。1253125340%kiling50%40%Kiling50%kilingkiling样 品 稀 释 度样 品 稀 释 度1 型3 型2532531140%kiling50%40%kiling50%kilingkiling样 品 稀 释 度4 型样 品 稀 释 度5 型 6 CHINA MEDICAL HERALD Vol. 11 No. 20 July 2014菌 落 数 （cfu/spot）菌 落 数 （cfu/spot）菌 落 数 （cfu/spot）菌 落 数 （cfu/spot） 论著 中 国 医 药 导 报2014 年 7 月 第 11 卷 第 20 期补 体 及 抗 体 血 清 ，缺 一 不 可 ，对 于 试 验 的 成 败 都 非 常重要。 本 试 验 中 ， 效 应 细 胞 选 用 的 是 HL-60 细 胞 株（人早幼粒白血病细胞）。 通 过悬浮培养 ，HL-60 细胞 能持续增殖，人为诱 导后可以分 化为成熟的 中性粒细胞，具有吞噬 能 力13。 HL-60 细 胞 在 未 分 化 和 分 化 后 表 面 标 志 物 的 表 达 情 况 会 发 生 变 化 ， 如 CD71 和 CD35。 CD71 蛋 白 在 细 胞 增 殖 中 发 挥 重 要 作 用 ，其 表 达 情 况 可 以 指 示 细 胞 的 增 殖 状 态 ；CD35 是 一 种 跨 膜 的 补 体 结 合 蛋 白 ，存 在 于 成 熟 的 粒 细 胞 表 面 ， 其 表 达 情况可以显示细胞的分化程度。 HL-60 细胞未分化之 前，CD71 的表达量较高 ， 细胞具 有较强的增 殖能力 ； 分 化 后 CD71 的 表 达 量 降 低 ， 细 胞 增 殖 能 力 减 弱 ， CD35 的表达量升高， 细胞进 入分化后的 成熟粒细 胞 状态。 利用流式细胞仪对细胞表面标志物的表达情况 进行监测，可 以 实 现 对 细 胞 分 化 程 度 的 判 断 。 HL-60 细胞的活性及分化程度越高，吞噬能力越强。MOPA 实验中的靶 菌 ，是带 有 特 定 抗 生 素 抗 性 的 各型肺炎链球菌 。 将 靶菌按抗 性不同进行 分组 ，每组 中的 4 种靶菌分别携带不同 的抗性 。 利 用这一特点 ， 可同时对 4 种血清型的肺 炎球菌进行 功能抗体 检测 。 制备工作菌种后，对 各型菌种的 特定抗生素 抗性及敏 感性进行确认非常重要 。 此外，为了保 证试验数据 的 准确性，需要确保对照孔中的活性细菌数在 70180 cfu 范围之内；因此对工作 菌种的冻存 活力及工作 稀释度 的核实也必不可少。补体在 OPA 实验 中 同 样 处 于 重 要 地 位 。 补 体 除 了与型特异性抗体协作共同 参与调理吞 噬作用之外 ， 其本身还具有一定的非特异性杀菌能力。 如果补体自 身的非特异性杀菌力太 强 ，会使特定 型别的靶菌 被大 量杀死，导致试验 失败 。 因此试 验中需要先 对补体的 非特异性杀菌率进行测 定 ，必要时需 要对不同批 次补 体进行筛选。 血清样本在试验前需要进行灭活补体的 处 理 ，还 需 要 检 测 是 否 含 有 抗 生 素 ，从 而 排 除 对 试 验 的干扰。 血清样本恰 当的预稀释 倍数十分关 键 ，根据 实 际 情 况 需 要 进 行 调 整 ，如 果 预 稀 释 倍 数 太 高 ， 容 易 导 致 杀 菌 不 彻 底 ，影 响 试 验 结 果 的 准 确 性 ， 而 预 稀 释 倍 数 太 低 ，则 容 易 导 致 杀 菌 率 太 高 ，无 法 检 出 具 体 的 调理滴度。本 研 究 中 ，HL-60 细 胞 检 测 结 果 显 示 ， 分 化 5 d1253125340%kiling50%40%kiling50%kilingkiling样 品 稀 释 度样 品 稀 释 度6A 型256B 型25313140%kiling50%40%kiling50%kilingkiling样 品 稀 释 度样 品 稀 释 度7F 型259V 型251350%kiling3140%kiling50%40%kilingkiling样 品 稀 释 度样 品 稀 释 度14 型2518C 型251350%kiling1350%kiling40%kiling40%kiling样 品 稀 释 度样 品 稀 释 度19A 型19F 型125350%kiling40%kiling样 品 稀 释 度23F 型图 4 5 份 血 清 样 本 针 对 各 型 肺 炎 球 菌 的 杀 菌 曲 线表 15 份 血 清 样 本 的 OPA 滴 度样 本1 型3 型4 型5 型6A 型6B 型7F 型9V 型14 型18C 型19A 型19F 型23F 型1234522795014562924215540479370767841905106982820 90117 434793339036991337519514210 90422 74312 81529 160921622 14417 338967816 581421022 21214 21339 99613 633389356193750385225 41836 43512 61219 70539 09614 326101917751144233913 5503741712715 95653369214974116 19516 9854524300213 326731610 942714843 011CHINA MEDICAL HERALD Vol. 11No. 20July 2014 7 菌 落 数 （cfu/spot）菌 落 数 （cfu/spot）菌 落 数 （cfu/spot）菌 落 数 （cfu/spot）菌 落 数 （cfu/spot）菌 落 数 （cfu/spot）菌 落 数 （cfu/spot）菌 落 数 （cfu/spot）菌 落 数 （cfu/spot） 论著 中 国 医 药 导 报 2014 年 7 月 第 11 卷 第 20 期后 活 细 胞 比 例 为 72.96%，CD35 的 表 达 量 为 71.78，CD71 的表达 量为 10.97，符合 MOPA 参 考试验的标准要求。 工作菌种检测 结果显示 ，工 作菌种的冻 存活力 均 高 于 90%， 抗 生 素 抗 性 与 敏 感 性 与 预 期 结 果 一 致，工作稀释度均1000，符合标准要求。 补体的检测 结果显示，非特异性杀菌率均70%，符合 要求。 对 5 份 血 清 样 本 的 检 测 结 果 显 示 ， 两 平 行 样 本 孔 间 的 差异3 倍 ，杀 菌 曲 线 均 为 标 准 的 S 型 曲 线 ，符 合 MOPA 试验各项要求。 上述 结果表明 ，本 研究已经成 功建立 了 MOPA 检测方法。OPA 技 术 在 国 际 上 已 被 多 个 大 型 制 药 企 业 用 来 进 行 肺 炎 球 菌 疫 苗 的 临 床 免 疫 效 果 评 价 ，WHO 也 已 推荐 使用 OPA 技术进 行疫苗的功 能性抗体 检 测14-15， OPA 技 术 的 应 用 已 然 成 为 肺 炎 疫 苗 临 床 评 价 领 域 的一个发展趋势。 本研究在中国食品药品检定研究院建立 了 基 于 MOPA 技 术 的 肺 炎 球 菌 疫 苗 功 能 抗 体 检 测 方法，对于促进国内肺炎 疫苗临床评 价水平的提 高有重要意义。参考文献sonophagocytosis for serological evaluation of pneumococ-cal vaccines J. Clin Vaccine Immunol，2006，13（2）：165-169. Henckaerts I，Durant N，De Grave D，et al. Validation of a rou- tine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumo- coccal disease efficacy of conjugate vaccine in children J.Vaccine，2007，25（13）：25182527.Schuerman L，Wysocki J，Tejedor JC，et al. Prediction of Pneu- mococcal Conjugate Vaccine Effectiveness against Inva- sive Pneumococcal Disease Using Opsonophagocytic Activ- ity and Antibody Concentrations Determined by Enzyme -Linked Immunosorbent Assay with 22F Adsorption J. Clin Vaccine Immunol，2011，18（12）：2161-2167. Burton RL，Nahm MH. Development and validation of a four- fold multiplexed opsonization assay （MOPA4）for pneumo-coccal antibodies J.Clin Vaccine Immunol，2006，13 （9）：1004-1009.Yeh SH，Gurtman A，Hurley DC，et al. Immunogenicity and Safety of 13-Valent Pneumococcal Conjugate Vaccine in Infants and Toddlers J. Pediatrics，2010，126（3）：e493-505.Skinner JM，Indrawati L，Cannon J，et al. 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