COPD患者肺气肿和骨质疏松定量测量及其与系统性炎症和骨质疏松相关蛋白关系研究.doc

毕业（设计）论文COPD患者肺气肿和骨质疏松定量测量及其与系统性炎症和骨质疏松相关蛋白关系研究中文摘要目的：肺气肿是COPD的重要表型之一，骨质疏松是COPD常见系统性合并症。已有的研究显示：COPD患者肺气肿严重程度与骨密度减低之间存在明确相关性，但是这种相关性的潜在病理生理学机制尚不明确。炎症性细胞因子IL-1, IL-6 和TNF-在骨质疏松和肺气肿的发生发展过程中均起到十分重要的作用。骨质疏松相关蛋白OPG/RANK/RANKL系统是骨代谢的重要调节因子，在绝经后骨质疏松的发生发展过程中发挥重要作用。然而OPG/RANK/RANKL系统在COPD合并骨质疏松过程中的作用，目前尚不明确。本研究旨在对COPD患者肺气肿及骨质疏松严重程度进行定量评估，明确二者间的相关性，并进一步探讨炎症性细胞因子（IL-1, IL-6 和TNF-），及骨质疏松相关蛋白OPG/RANK/RANKL系统在COPD患者肺气肿及骨质疏松发生发展过程中的作用及相关性。材料与方法：入组80例COPD男性患者，均为既往有吸烟史或目前吸烟者。所有患者于入组当日完成一般资料及病史采集，生活质量及病情严重程度评分（BODE和CAT评分），肺部CT 扫描，肺功能检测，骨密度检测（双能X线吸光测定法），并留取血液标本。在所有80例患者中，根据骨密度检测结果，随机选择30例骨密度正常者和30例骨密度减低者，检测血清IL-1, IL-6 和TNF-水平（流式细胞术）及OPG/RANK/RANKL水平（ELISA）。选择20例年龄匹配的健康志愿者，作为对照组，完成上述细胞因子检测。结果：80例COPD患者中，36例骨密度正常，44例骨密度减低。骨密度正常组（36例）和骨密度减低组（44例）年龄，BMI 和CAT评分存在显著性差异(p0.05)。肺部CT肺气肿严重程度评估显示：80例COPD患者肺内低密度区百分比（LAA%）均值为24.66 12.90%，其中COPD骨密度正常组（36例）平均LAA%为18.67 10.00%，COPD骨密度减低组（44例）平均LAA%为29.57 13.03%，两组间存在显著性差异(p 0.0001)。LAA%与腰椎骨密度之间存在明确相关性 (r = 0.741; p 0.0001)。进一步逻辑回归分析显示：LAA% (p = 0.005)和BMI(p = 0.009)是骨密度减低的独立危险因素。两组COPD患者（各30例）血清IL-1水平无明显差异，但均高于正常对照组(p 0.05)， 血清IL-6 和 TNF- 水平在三组间存在显著性差异 (p 0.05)。血清RANKL水平和RANKL/OPG比率与腰椎骨密度负相关，与LAA%正相关，且二者在COPD合并骨密度减低组的水平明显高于COPD骨密度正常组及对照组(p 0.05)。结论：在有吸烟史的男性COPD患者，肺气肿严重程度与骨密度的减低具有明确相关性。肺实质的损伤和骨结构的破坏有可能存在共同的分子生物学机制，而炎症性细胞因子，如IL-1, IL-6 和TNF-, 以及骨质疏松相关蛋白系统OPG/RANK/RANKL，在肺气肿和骨质疏松症的发生发展过程中，有可能具有某些协同效应。 关键词：慢性阻塞性肺疾病；肺气肿；骨质疏松；细胞因子；骨质疏松相关蛋白Disturbance of the OPG/RANK/RANKL Pathway and Systemic Inflammation in COPD Patients with Emphysema and OsteoporosisABSTRACTBackground: Osteoporosis is one of the systemic features of COPD. A correlation between the emphysema phenotype of COPD and reduced bone mineral density (BMD) is suggested by some studies, however, the mechanisms underlying this relationship are unclear. Experimental studies indicate that IL-1, IL-6 and TNF- may play important roles in the etiology of both osteoporosis and emphysema. The OPG/RANK/RANKL system is an important regulator of bone metabolism, and participates in the development of post-menopausal osteoporosis. Whether the OPG/RANK/RANKL pathway is involved in the pathogenesis of osteoporosis in COPD has not been studied.Methods: Eighty male patients (current or former smokers) completed a chest CT scan, pulmonary function test, dual x-ray absorptiometry measurements and questionnaires. Among these subjects, thirty patients with normal BMD and thirty patients with low BMD were selected randomly for measurement of IL-1, IL-6, TNF- (flow cytometry) and OPG/RANK/RANKL (ELISA). Twenty age-matched healthy volunteers were recruited as controls.Results: Among these eighty patients, thirty-six had normal BMD and forty-four had low BMD. Age, BMI and CAT score showed significant differences between these two COPD groups (p0.05). The low-attenuation area (LAA%) in the lungs of COPD patients was negatively correlated with lumbar vertebral BMD (r = 0.741; p 0.0001). Forward logistic regression analysis showed that only LAA% (p = 0.005) and BMI (p = 0.009) were selected as explanatory variables. The level of IL-1 was significantly higher in the COPD patients as compared to the normal controls (p 0.05), but the difference between the two COPD groups did not reach significance. The levels of IL-6 and TNF- among the three groups were significantly different (p 0.05). The level of RANKL and the RANKL/OPG ratio were significantly higher in COPD patients with low BMD compared to those with normal BMD and the normal controls (p 0.05), and correlated negatively with lumbar vertebral BMD, but positively with LAA%.Conclusions: Radiographic emphysema is correlated with low BMD in current and former smokers with COPD. IL-1, IL-6, TNF-, and the osteoporosis-related protein system OPG/RANK/RANKL may have some synergetic effects on emphysema and bone loss in COPD. Keywords: chronic obstructive pulmonary disease; pulmonary emphysema; osteoporosis; cytokine; OPG/RANK/RANKL前言慢性阻塞性肺疾病（COPD）是危害人类健康的常见病。根据世界卫生组织（WHO）统计，约8千万人患有中-重度COPD。在常见的死亡原因中，COPD居第四位。这些流行病学数据大多来自发达国家，而90%的COPD死亡病例来自低-中收入国家。由此可见，COPD病死率可能更高。COPD患病人数多，死亡率高，给社会经济带来严重负担1。当前，在全球范围内，慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease ，COPD)的发病率和死亡率呈逐年增高的趋势。到2020年，COPD有可能成为第三大致死性疾病2,3。COPD是一种以气流受限为特征的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展。已有的研究表明，COPD并不是单纯的肺部疾病，而是一种可以累及全身多个组织和器官的系统性疾病，在常见的肺部临床表现的基础上，往往合并有肺外表现，也就是所谓的COPD系统性合并症，例如：心血管疾病、恶液质、骨骼肌萎缩及功能不良，贫血等4,5。 骨质疏松是COPD重要的系统性合并症之一。已有的多项研究证实：COPD患者的骨密度（Bone mineral density ，BMD)低于健康人6-8。COPD患者合并骨质疏松后，其发生骨质疏松性骨折的风险明显升高，进而影响患者的生活质量，加速病情进展，增加患者家庭及社会医疗经济负担9。研究表明，COPD患者的BMD减低与某些临床及生理指标之间存在相关性，如第一秒用力呼气容积（Forced expiratory volume in one second，FEV1)、低体重和骨骼肌萎缩等10,11。目前国内外用于测量骨密度的无创性方法主要有双能x线吸收测定法（dual x-ray absorptiometry， DXA）、CT扫描定量法和超声定量法。其中DXA发明于1987年，由于其准确性和精确度高，病人检查时间短，受辐射量小而得到广泛认可，并被认定为诊断骨质疏松的“金标准”，在世界范围内被广泛应用于骨质疏松的早期发现，随访以及疗效观察等研究 12,13。肺气肿是COPD患者常见的影像学表现，已经被认定为COPD的一种重要表型。目前对于肺气肿的诊断主要依靠肺功能检查(Pulmonary function test，PFT)。但该方法的局限性在于：1. 具有力量依赖性和年龄依赖性；2. 只有肺组织破坏达到30%以上才会出现PFT改变，且PFT不能反映局部肺功能损坏情况；3. 同一级别的肺功能水平所对应的结构和病理变化可能并不一致。随着影像学技术发展以及一些自动化评估软件的不断开发，肺气肿影像学诊断已成为当前研究的热点。胸部高分辨计算机体层摄影术(High resolution computerized tomography, HRCT)具有很高的空间分辨率,可以显示常规胸片及普通CT无法显示的细微病变,能够定量显示早期肺气肿并准确分级，可先于肺功能发现肺解剖结构的异常,对肺实质病变的评估与组织病理学有良好的相关性，并可预测呼气气流阻塞的程度14。CT肺功能成像是常用的肺气肿影像学定量方法。该方法采用多层螺旋CT对临床怀疑有肺气肿的患者进行深呼气末及深吸气末全肺计算机连续扫描，并用自带的肺功能评价软件进行定量分析。通过肺功能评价软件识别和定量肺低减损区（Low-attenuation areas，LAA）已被证实可用于定量肺气肿严重程度15。在确定阈值的前提下,计算机自动计算出所选阈值以下肺组织（肺低减损区）占全肺体积的百分比, 即肺气肿指数（Emphysema index, LAA%）。采用此指标来评价肺气肿的严重程度更为客观, 重复性好。围绕骨质疏松和肺气肿这两个COPD的重要表现，人们已经进行了广泛而深入的研究。但是对于COPD患者肺气肿严重程度与BMD减低之间的相关性，目前的研究并不充分。实际上，实质性肺气肿和骨质疏松症之间在病理生理学方面具有许多相似性，例如细胞外基质的丢失，炎症性介质的参与等。这些相似性也提示这两种不同的病理生理学过程之间有可能存在某些潜在的联系。已有研究证实，COPD患者存在系统性炎症（Systemic inflammation）。炎症性细胞因子，如IL-1, IL-6 和TNF-等在COPD患者外周血中呈持续性低水平升高，在COPD急性加重期其水平可进一步升高。而系统性炎症的持续存在，又可以导致COPD系统性合并症的发生和发展16,17,18。同时，大量的研究显示：IL-1、IL-6和TNF-是骨代谢的重要调节因子，在年龄和雌激素缺乏相关的骨量丢失过程中发挥重要的作用19。炎症已经被明确是骨质疏松的危险因素。目前与骨质疏松关系最为密切的炎症性细胞因子主要是IL-1，IL-6和TNF-a。动物和体外实验已经证实以上几个炎症性细胞因子水平的长期慢性升高是促进骨吸收的重要介质。主要机制为：1.增加破骨细胞的存活，分化和激活； 2.抑制成骨细胞的存活；3.增强 Receptor activator of nuclear factor-B (RANK)的表达。这些系统性炎症因子（IL-1, IL-6 和TNF-）通过上述机制的作用，最终可导致机体骨量丢失，骨密度减低，加速骨质疏松症的发生和发展20，21。另一方面，骨质疏松相关蛋白系统：骨保护素（Osteoprotegerin，OPG)/细胞核因子-B受体活化因子（Receptor activator of NF-B，RANK)/RANK配体（RANK ligand，RANKL)已经被证实是骨骼代谢和重塑的重要调节因子。已有的研究表明，该系统与炎症性细胞因子IL-1, IL-6 和TNF-在体内和体外均存在相互作用，并在绝经后骨质疏松症的发生和发展过程中起到十分重要的作用22,23。根据上述研究结果，我们有理由推测：在COPD合并骨质疏松症的发生发展过程中，也可能有这些炎症性细胞因子（IL-1, IL-6 和TNF-）和骨质疏松相关蛋白系统（OPG/RANK/ RANKL）的参与和相互作用。综上所述，我们提出假设：COPD患者肺气肿范围与骨质疏松严重程度之间存在相关性；炎症性细胞因子（IL-1, IL-6 和TNF-）和骨质疏松相关蛋白系统（OPG/RANK/ RANKL）通过相互间作用，共同参与了肺气肿和骨质疏松症的发生和发展。 对象与方法一对象的选择自2010年1月至2011年5月，共入组COPD稳定期男性患者80例。为了避免绝经后骨质疏松对研究结果的影响，本研究未纳入女性COPD患者。所有患者入组时均严格按照GOLD(the Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease) 标准进行COPD诊断和病情严重程度分级2。入组患者年龄均大于40岁，既往有吸烟史或目前正在吸烟。满足以上入选条件的患者如被证实具有以下任意一条或多条特征时则应退出本研究（病例排除标准）：1.入组前3个月内曾发生COPD急性加重；2.明确患有COPD之外的其它呼吸系统疾病；3.胸部手术史；4.入组前5年内有恶性肿瘤病史；5.既往有骨骼系统疾病史；6.目前和/或既往曾经吸入、口服或静脉应用过糖皮质激素；7.入组前1年内患有其它影响骨骼代谢的系统性疾病，如肾功能不全和甲状腺疾病；8.入组前1年内曾经服用过影响骨骼代谢的药物。本研究方案得到首都医科大学附属北京同仁医院伦理委员会批准(TRECKT 2008-14)，入组患者均签署知情同意书。所有患者于入组当日进行一般资料及病史采集，生活质量评估，并留取血液标本。（上述工作由我科经过培训的专业人员完成。）同日完成肺部CT 扫描、肺功能检测、腰椎和股骨颈骨密度测定。二方法1. 肺功能检测肺功能检查由一名有经验的技师应用德国JAEGER公司的Master Screen Body肺功能仪完成，质控达到美国胸科协会（American thoracic society, ATS）标准。入组患者吸入沙丁胺醇气雾剂400ug前后分别行肺功能检查，两次间隔时间为15分钟。根据GOLD/ATS标准，吸入支气管扩张剂后FEV1/FVC70%且FEV180%预计值被定义为气流受限不完全可逆。对于确诊为COPD的患者，根据其FEV1%预计值下降的幅度对COPD严重程度进行分级：I级：FEV180%预计值；级：50%FEV180%预计值; 级：30%FEV150%预计值；级：FEV130%预计值或FEV1200ml。2. 胸部高分辨率CT检查检查前让患者了解最大吸气末屏气的方法，并训练其达到最佳状态。应用飞利浦Brilliance 64 CT机（(Brilliance 64, Phillips, Eindhoven, Netherlands)在最大吸气末时进行肺尖至肺底的螺旋CT扫描。扫描参数：电压120kv，层厚1mm，螺距11.08。3. 肺气肿严重程度定量评估（CT肺功能成像） 应用飞利浦Brilliance 64 CT机后处理工作站自带的肺功能定量分析软件分析CT 图像数据。以吸气相CT值-950Hu为阈值，计算机自动计算出所选阈值以下LAA%。计算范围包括自主动脉弓上缘至膈肌以内的所有层面。本测量工作由一名有经验的放射科医生，在不了解病人病情的前提下，独立完成。4. BMD测量应用双X线吸光测定法（DXA）(Lunar prodigy, GE Healthcare, London, United Kingdom)测量患者第一至第四腰椎(L1L4)和双侧股骨颈BMD。BMD测量结果包括绝对值(g/cm2)和T值（表示与参考均值的标准差）两种形式。按照WHO(the World Health Organization)的骨质疏松诊断标准，根据T值做出如下诊断：BMD正常：股骨颈及腰椎各受检部位T值均-1；骨量减少：任一受检部位-2.5T值-1；骨质疏松症：任一受检部位T值-2.524。按照此标准，根据实际检测结果，将入组病人分为两组：COPD骨密度正常组（各受检部位T值均-1）（36例）；COPD 骨密度减低组（任一受检部位T值-1）（44例）。5. IL-1, IL-6, TNF- 和 OPG/RANK/RANKL系统检测根据BMD检测结果，从所有80例入组患者中随机选择30例BMD正常者（COPD骨密度正常组）和30例BMD减低者（COPD骨密度减低组），完成血清IL-1, IL-6, TNF- 和 OPG/RANK/RANKL系统水平检测。招募20名健康志愿者（目前吸烟者或既往有吸烟史，平均年龄58.4 7.1，BMD正常），检测血清上述细胞因子水平作为健康对照组。健康对照组排除标准参照COPD患者入住时采用的排除标准。各组间比较，吸烟指数无显著性差异(p 0.05)。采集空腹静脉血标本20ml, 室温下1000转离心5分钟，留取上清液，80C冻存。5.1 血清IL-1, IL-6, TNF-水平检测采用流式细胞术(CBA Kit, BD Bioscience, USA)检测血清IL-1, IL-6, TNF-水平。具体操作方法如下：5.1.1细胞因子标准品的制备细胞因子标准品冻干粉需要复溶并倍比稀释后使用。1）将所要检测的细胞因子标准品冻干粉微球依次取出放置到15ml试管中，用4ml分析稀释液稀释。充分混匀溶解，放置至少15分钟；2）1275mm FALCON进样管顺序标记：原倍标准品、1:3稀释、1:9稀释、1:27稀释、1:81稀释、1:243稀释、1:729稀释、3）在原倍标准品管内加入460mL分析稀释液；4）在其余管内各加入400mL分析稀释液；5）在原倍标准品管内加入40mL的稀释后标准品，充分混匀；6）倍比稀释：取原倍标准品200mL，加入到1:3稀释管中，充分混匀；取1:3稀释液200mL，加入到1:9稀释管中，充分混匀；依此类推，直至1:729稀释管，充分混匀；分析稀释液为0fg/ml。稀释后的细胞因子标准品浓度：原倍标准1:3稀释1:9稀释1:27稀释1:81稀释1:243稀释1:729稀释蛋白浓度(fg/ml)200,00066,66722,2227,4072,4698232745.1.2细胞因子检测微球的制备检测微球（试剂A）放置在其相应的细胞因子的试剂盒中，一个因子有一个检测微球试剂。1）计算分析实验管数（包括标准品），例如分析17个待测样本，加8个标准管，共计25管；每管需要加入20ul的检测试剂即25test20ul=500ul为总需要的检测试剂的体积；本次实验待测样本为79个，加8个标准管共计87管，8720ul=1740ul为本次实验总需要的检测试剂的体积2)充分摇匀各检测试剂瓶；3)按照每一个样品（包括标准品）需要1ul检测微球试剂计算，从试剂A中吸取，例如35个样品则取35ul试剂A，放入干净的1275mm FALCON进样管中；本次实验87管则需在每个因子的试剂A中取87ul放入干净的1275mm FALCON进样管中。4)用检测试剂稀释液稀释检测试剂，稀释方法如下：例如：有35个样品，以计算出所用捕获试剂体积为700ul 如果需要检测一种因子则所用的稀释液的体积为 700ul-（35ul1）=665ul 本次实验需要检测4种因子则所用的稀释液体积为 1740ul-(87ul4)=1392ul将其放入已有试剂A的1275mm FALCON进样管中5)检测试剂混悬液充分混匀，4保存待用。5.1.3待测样本制备标准曲线的检测范围是274-200,000fg/mL。如果待测样本细胞因子的含量超过了检测范围，则样本需要稀释。稀释步骤如下：1）使用分析稀释液按照理想浓度稀释样本（如1:2、1:10、1:100）；2）在加样前充分混匀稀释样本。 本次实验不需要样本稀释5.1.4超敏增强染色试剂配置1）增强染色试剂为有干粉的试剂B，一瓶试剂B可以检测50个样本；2）一瓶试剂B中加入0.55ml的检测试剂稀释液，将干粉溶解；在室温避光孵育15分钟3）吸取4.5ml检测试剂稀释液放入15ml试管中；4）再加入0.5ml已经溶解的试剂B5.1.5细胞因子CBA Flex操作步骤准备好标准品倍比稀释液、检测试剂混悬液和待测样本，按照以下步骤进行CBA Flex分析样本制备和分析。为了保证流式细胞仪的定量分析结果，要求每次实验时都要运行仪器调整程序，并定标。取干净的1275mm FALCON进样管87支，分别标记好标准1-8和样本1-791) 标准管中分别加入50ul的已经倍比稀释好的标准品，样本管中分别加入未知样品2) 混匀捕获微球混悬液5秒钟3) 各管加入20mL捕获微球，注意加样时要定时混匀微球；4) 室温孵育2小时5) 每管加入20ul检测试剂混悬液（试剂A），混匀6) 室温孵育2小时（期间开始准备增强染色试剂）7) 每管加入1ml洗液200g离心5分钟，弃上清8) 各管加入100mL已稀释好的增强染色试剂（试剂B）混匀9) 室温避光孵育1小时10) 各管加入1mL洗液，200g离心5分钟；11) 弃上清；12) 各管加入300mL洗液，重新悬浮微球；13) 使用流式细胞仪分析样本，上机前充分混匀3-5秒。5.1.6流式细胞仪检测结果后，使用BD FACP分析软件分析结果，做出标准曲线，求出相应样本值5.2 血清OPG/RANK/RANKL浓度检测采用ELISA 法(Catalog No.CSB-E04692h, 14931h, 08157h; Cusabio Biotech Co., Ltd, USA)检测血清OPG/RANK/RANKL浓度。各项指标检测过程严格按照试剂盒内操作标准进行，具体操作步骤如下：5.2.1标准品稀释标 号ng/ml标准品量样品稀释液1401ml2200.5ml从1号管0.5ml3100.5ml从2号管0.5ml450.5ml从3号管0.5ml52.50.5ml从4号管0.5ml61.250.5ml从5号管0.5ml1）依次加入每孔100ul标准品、样品2）37孵育2小时3）弃去液体不洗板5.2.2 加入二抗1）用结合稀释液稀释二抗，稀释比例为1:100 2）每孔加入100ul稀释好的二抗3）37孵育1小时4）洗板机洗板3次5.2.3 加入酶标结合物1）用酶标结合物稀释液稀释，稀释比例为1:1002）每孔加入100ul稀释好的二抗3）37孵育1小时4）洗板机洗板4次5.2.4 显色1）每孔加90ul TMB底物显色液2）37孵育10-30分钟，以标准品的颜色有明显梯度为止3）终止每孔加入50ul 终止液4）用450nm波长检测。做出4-PL曲线，求出相应的样品浓度值对所有标本均进行复孔检测，以两次检测结果的平均值作为最终结果。6. 临床资料采集和评估6.1呼吸困难评分：患者呼吸困难程度评估采用美国胸科协会（ATS）呼吸困难量表(Modified Medical Research Council Dyspnea Scale，MMRC) 25。0分：除过度活动外，无气短的呼吸困难1分：平地行走或略上斜坡时有气短问题2分：因气短较同龄人平地行走的慢或以自己的步伐行走于平地时不得不停下来呼吸3分：平地行走几分钟后需停下来呼吸4分：气短不能离开家或穿衣、脱衣时气短6.2 6分钟步行距离（Six-Minute Walking Distance，6MWD)测试在室内一条长50米的道路进行，两端和中间各放一把椅子，用作让受试者休息用。要求受试者在平直走廊里尽可能快的行走，运动前和运动后监测生命体征，记录心率、血压、呼吸频率和血氧饱和度。只要受试者出现明显的症状，如头晕、心绞痛、气短和晕厥等，就应该立即停止试验。当受试者感觉好转时，应尽快让他恢复原来的行走。终止试验后，让受试者卧床休息。操作规程符合美国胸科协会6MWT标准草案26。6.3 BODE指数计算按照Celli 等27提出的方法计算, 将以下4个变量分值相加，即为BODE指数：（1）FEV1占预计值百分比（65%：0分；50% - 64%：1分；36% - 49%：2分；35%：3分）；（2）6分钟步行距离（6MWD）(350m,0分；250-349m,1分；150-249m,2分；149m，3分)；（3）MMRC呼吸困难评分（0-1, 0分；2, 1分；3, 2分；4, 3分）；体重指数（body mass index， BMI) ( 21 kg/m2, 0分; 21 kg/m2, 1分)。总分范围0-10分。6.4 患者生活质量评估采用慢性阻塞性肺疾病评估测试（COPD Assessment Test CAT)CAT问卷共包括8个问题。患者根据自身情况，对每个项目做出相应评分（05），CAT分值范围是040。得分为010分的患者被评定为COPD“轻微影响”，1120者为“中等影响”，2130分者为“严重影响”，3140分者为“非常严重影响” 28。三统计学方法采用SPSS17.0统计软件(Statistics Package for the Social Sciences, SPSS 17.0, Inc., Chicago, IL, USA)进行统计学分析。计量资料数据以均数标准差表示。正态分布的计量资料数据两组间比较采用T检验，非正态分布计量资料数据两组间比较采用U检验（Mann-Whitney U test）。由于对照组，COPD骨密度正常组（30例）和COPD骨密度减低组（30例）3组间在年龄上存在显著性差异(p 0.05),各组间血清细胞因子水平比较采用协方差分析（年龄作为协变量）。连续变量间相关性分析采用多元线性回归。BMD与LAA%以及其它在两个COPD组间（36例和44例）比较存在显著性差异的参数（年龄、BMI和CAT评分）间相关性评估采用逻辑回归分析。p0.05为差异有统计学意义。结果一. COPD患者一般临床资料、肺功能及生活质量评分比较根据BMD检测结果，将80例COPD患者分为COPD骨密度正常组（36例）和COPD骨密度减低组（44例）。比较两组间年龄、BMI、吸烟指数、FEV1/FVC、FEV1占预计值百分比、BODE指数和CAT评分。结果显示（见表1）：两组间年龄（p=0.049）、BMI (p0.05）。表1. COPD患者一般临床资料、肺功能及生活质量评分比较变量 COPD骨密度正常组 COPD骨密度减低组 p值 (n=36) (n=44)年龄(岁) 65.55.1 67.85.2 0.049BMI(kg/m 2) 26.13.6 23.52.9 0.001吸烟指数(包年) 28.126.0 26.721.6 0.79CAT评分 15.89.6 21.08.5 0.01BODE指数 3.31.1 4.11.2 0.26FEV1/FVC(%) 57.010.1 53.99.6 0.17FEV1 占预计值百分比(%) 58.419.2 52.817.3 0.18 二肺气肿严重程度定量评估（CT肺功能成像） CT肺功能成像结果显示：80例COPD患者平均LAA%为24.66 12.90%，其中COPD骨密度正常组（36例）平均LAA%为18.67 10.00%，COPD骨密度减低组（44例）平均LAA%为29.57 13.03%，两组间存在显著性差异(p 0.0001)。三腰椎及双侧股骨颈骨密度测量80例COPD患者和20例健康对照者均采用DXA法测量第一至第四腰椎及双侧股骨颈的骨密度。为了避免同一患者不同椎体之间及双侧股骨颈之间存在的骨密度变异，所有受检者均用第一至第四腰椎椎体骨密度的平均值来表示腰椎BMD的最终结果,双侧股骨颈骨密度的平均值表示股骨颈BMD的最终结果。相关性分析显示：腰椎BMD与股骨颈BMD之间具有很好的相关性（r= 0.959; p 0.0001)（图1）。由于在国内外既往的研究中，应用最为广泛的方法是采用腰椎的BMD来判定受检者是否存在骨质疏松症，因此，在本研究中，我们也选取腰椎的BMD来代表受检者最终的BMD结果，并进一步与LAA%、生活质量评分和一般临床资料参数等进行相关性分析。腰椎BMD(g/cm2)股骨颈BMD(g/cm2)图1. 腰椎与股骨颈BMD相关性分析四血清炎症性细胞因子（IL-1, IL-6, TNF-）和OPG/RANK/RANKL系统水平比较由于COPD骨密度正常组（30例），COPD骨密度减低组（30例）和健康对照组之间在年龄上存在显著性差异(p0.05）,在比较三组间血清IL-1、IL-6,、TNF- 及OPG/RANK/RANKL系统水平时，我们采用了协方差分析方法（以年龄作为协变量）。比较结果显示（见表2）：表2.三组间血清IL-1、IL-6,、TNF- 及OPG/RANK/RANKL系统水平比较变量 对照组 COPD骨密度正常组 COPD骨密度减低组 (n=20) (n=30) (n=30)IL-1(fg/ml) 122.2135.14 186.83104.87 192.94115.82 IL-6(fg/ml) 354.3783.14 421.52125.78 483.73110.38 TNF-(fg/ml) 193.0981.20 261.2896.09 324.37141.29 OPG(pg/ml) 236.5038.76 240.4365.77 257.9786.80 RANK(pg/ml) 82.2829.76 73.9050.41 71.7141.23 RANKL (pg/ml) 432.8188.81 447.63141.30 541.63158.35 RANKL/OPG 1.860.42 1.890.49 2.240.80 ：与正常对照组比较p 0.05；：与COPD骨密度正常组比较p 0.051. 两个COPD患者组血清IL-1水平均明显高于健康对照组(p 0.05)，但在该两组间未见显著性差异(p 0.05)。 (见图2)2. 三组间血清IL-6水平存在显著性差异(p COPD骨密度正常组（30例）健康对照组(见图2)。3. 三组间血清TNF-水平存在显著性差异(p COPD骨密度正常组（30例）健康对照组(见图2)。4. 三组间血清OPG水平无显著性差异（p0.05）(见图3)。5. 三组间血清RANK水平无显著性差异（p0.05）(见图3)。6.COPD骨密度减低组（30例）血清RANKL 水平明显高于COPD骨密度正常组（30例）和对照组(p 0.05）(见图3)。7. COPD骨密度减低组（30例）RANKL/OPG (R/O)比率明显高于COPD骨密度正常组（30例）和对照组(p 0.05）(见图4)图2. 三组间血清IL-1、IL-6及TNF-水平比较（：p 0.05）图3. 三组间血清OPG/RANK/RANKL系统水平比较（：p 0.05）图4. 三组间RANKL/OPG (R/O)比较（：p 0.05）五BMD与血清炎症性细胞因子（IL-1, IL-6, TNF-）和OPG/RANK/RANKL系统相关性分析多元线性回归分析显示：在对年龄因素进行调整后，腰椎BMD水平与血清RANKL 水平(r = -0.256, p= 0.015)和RANKL/OPG比率(r = -0.258, p = 0.015)呈显著负相关，而与其它细胞因子水平（IL-1, IL-6, TNF-, OPG, RANK）无显著相关性。六肺气肿严重程度(LAA%)与血清炎症性细胞因子（IL-1, IL-6, TNF-）和OPG/RANK/RANKL系统相关性分析多元线性回归分析显示：在对年龄因素进行调整后，LAA%与血清RANKL 水平(r = 0.216, p= 0.043)和RANKL/OPG比率(r = 0.213, p = 0.041)呈显著正相关，而与其它细胞因子水平（IL-1, IL-6, TNF-, OPG, RANK）无显著相关性。七BMD 与LAA%及其它参数相关性分析皮尔森相关分析（Pearson product-moment correlation analyses）显示：腰椎BMD 与LAA%之间存在显著负相关(r = -0.741; p 0.0001)。以BMD作为分组变量，包含LAA%、年龄、BMI和CAT评分等变量在内的（这几个变量在两个COPD组之间存在显著性差异）进一步逻辑回归分析显示：只有LAA%(p = 0.005)和BMI (p = 0.009)是预示COPD患者发生骨质疏松症的独立危险因素。讨论COPD已经被明确认定为是一种系统性疾病，在引起肺部相应临床表现的同时，往往合并存在多种肺外表现，也就是所谓的COPD系统性合并症。骨质疏松症是COPD重要的系统性合并症之一，其在COPD患者中的发病率明显高于正常人群6,10。从病因学角度来看，COPD相关的骨质疏松症是多种因素综合作用的结果。既往的许多研究提出了多个与COPD合并骨质疏松症相关的病因学因素，如BMI7，8，10，11、年龄7、生活质量下降7、FEV1减低7，11、吸烟7以及糖皮质激素的应用7,10,29等。在已经提出的这些相关因素中，只有BMI与骨质疏松症的关系得到了比较广泛的认可，而其它因素的作用目前尚存在争论。在本研究中，COPD骨密度减低组患者的BMI低于COPD骨密度正常组，差异存在统计学意义(p 0.05)，逻辑回归分析显示：BMI是COPD患者发生骨质疏松症的独立危险因素，此结果与既往的多项研究结果是一致的7，8，10，11。本研究还显示：COPD骨密度减低组患者的年龄大于COPD骨密度正常组，差异存在统计学意义(p 0.05)，但逻辑回归分析显示，年龄并不是COPD合并骨质疏松症的独立危险因素。年龄对于COPD相关骨量丢失的作用，目前尚不明确，而且，根据以往的研究结果，年龄因素有可能对血清中炎症性细胞因子（如IL-1, IL-6, TNF-等）的水平造成影响30。因此，在进行数据统计学分析时，我们选择了协方差分析和多元线性回归分析，从而在一定程度上矫正了年龄因素对统计学结果的影响。BMI和年龄都是与患者生活质量明确相关的因素，而CAT评分和BODE指数是评估COPD患者生活质量的两项新指标31,32。我们的研究结果显示，患者的骨密度水平与CAT评分之间存在明确的负相关，且该相关性具有统计学意义(p 0.05)。从上述结果中可以显示出一种趋势，也就是患者的骨密度越低，其生活质量越差。Iqbal等人的研究显示：COPD患者的BMD与其体力活动能力（采用圣乔治评分表进行评估）之间存在一定的相关性7，该结果与本研究的结果基本一致；而在Katsura8和Kjensli10等人的研究中，则没有发现BMD与体力活动能力（采用6分钟步行距离进行评估）之间的相关性。既往的多项研究没有发现骨密度减低与气流阻塞之间的相关性8,33，而本研究结果也是如此：FEV1/FVC和FEV1占预计值百分比两项指标在两个COPD组之间无显著性差异（p0.05）。而在Duckers等人的研究中，合并存在骨量减少或骨质疏松症的男性COPD患者，有超过80%者存在轻度至中度的气流阻塞(GOLDand ) 34。综上所述，COPD合并骨质疏松症的相关发病因素有很多，这些因素之间有可能存在相互作用，既所谓的多因素共同作用。目前针对这些相关病因学因素的研究还存在很多矛盾和争论的问题，更加深入系统的研究还有待进行。本研究结果显示：反映COPD肺气肿严重程度的指标- LAA%，与患者骨密度减低之间存在明确的相关性。此外，逻辑回归分析也显示：在各项临床指标中，只有LAA%和BMI对COPD患者的骨密度有预示作用，也就是说，LAA%和BMI是COPD患者发生骨质疏松症