临床化学的干扰试验教案整理(EP7)修改版.doc

临床化学的干扰试验（EP7-A）NCCLS文件（2002年7月翻译）摘要NCCLS EP7-A文件使临床实验室方法的干扰特性评估方式的一直。EP7-A叙述了厂商过筛可能的干扰物、确认干扰作用、和肯定病人样品中的干扰等的方法。这个文件也叙述了临床实验室为了确认干扰结果、和研究因为未预期干扰物使结果离散的方法。提供了详细的例子。EP7-A也含有干扰实验概念的背景信息，分析物和预期干扰物实验推荐浓度表，以及数据收集和分析工作表。前言干扰物可以是临床检验的显著误差1，2，3。常规使用内部质量控制监测精密度，和参考材料的比较确认准确度，但是实验室不能方便地检测干扰物引起的误差。虽然不断改进方法的特异性是一个目标。本文件让实验室和以医学需要来评估干扰物。注意到严密评估方案和配合评价技术的灵活性间的平衡。实验室和厂商需要理解一些概念，进行必要的选择，并且一起实现改善病人结果的共同目标很清楚，证实某干扰的作用、确定它的原因、设计改进方法等都需要实验室和厂商的合作。资料包括解释化学和统计的概念。注意：本文件注重分析过程的干扰。不是因药物和它的代谢物引起的生理作用。1 引言1.1 目的本文件用于以下2个目的：1) 支持厂商和方法的开发人员确定方法对干扰物敏感的做法通过科学的证实的实验设计、规定实验的相应物质和浓度、明确数据分析和解释的方法，这样得到有意义的结果给用户。2) 使实验室在研究因干扰造成结果离散时，进行系统的研究，明确数据收集和分析要求，鼓励实验室用户和厂商间的紧密合作，才能证实、揭示、最终消除新的干扰物。 1.2 采用的用户 2 范围2.1 分析方法任何分析方法，定量或定性的，都会受干扰。本文件适用各种方法和分析仪。2.1.2 干扰物干扰物来自内源性和外源性： 在病理条件下产生的代谢物，如：糖尿病，多发性骨髓瘤，胆汁阻塞性肝炎，等。 在病人治疗中引入的化合物，如：药物，非肠道（注射）引入的营养物，血浆扩充剂，抗凝剂，等。 病人摄入的物质，如：酒精，毒品，营养补充物，各种食物和饮料，等。 在标本准备时外加的物质，如：抗凝剂，防腐剂，稳定剂，等。 标本本身的基体效应，如：其化学和物理性质和理想的新鲜标本的差异。2.2 概念和科学原理2.2.1 干扰对不准确度的影响不准确度（总分析误差）主要有3个因素：不精密度、方法特定的偏倚、和样品特定的偏倚。方法评价一般仅估计了前2个。样品特定的偏倚（即干扰）常对个别特殊样品的问题处理，而不是作为方法的确认特性。从方法评价的做法上，干扰引起的系统偏倚，具有系统和随即误差二者，这2种误差统计上都是不准确度（总分析误差）的组分。 对某指定的病人群体，在标本中的干扰物平均浓度引起系统偏倚，包括在方法偏倚的估计中。对于这个平均偏倚的各个离散，在和较好的方法作比较时，表现为总的随机误差。对某些方法，随机干扰作用超出了作为随机误差主要来源的不精密度。 对某个别病人，干扰物造成的偏倚，依赖于病人标本中干扰物的浓度。偏倚岁干扰物浓度而异，如：因清除或代谢。当病人状况变化时，造成偏倚的改变也许会对病人有错误的解释。2.2.2 临床的关系检验医学必须把干扰和临床观点相结合。临床表现确定，分析结果的影响是否应看作干扰。检测的分析物形式和它的浓度必须明确地确定。一些分析方法的似是而非结果也许反映了真实的分析物浓度，但是没有临床意义。例如，火焰光度法和间接离子选择性电极法能准确检测血浆中的钠，和脂肪浓度无关。但是，如果脂肪浓度很高，这些方法将出现假性的低钠。直接离子法在这种情况下能正确地报告正常钠，因为此时结果是血浆中水组分的钠活度。所以，对样品中总钠的过分估计是临床的要求。很重要的是在解释干扰实验结果前，首先确定临床关心的浓度。2.2.3 分析前的影响在分析前，分析物或它的浓度出现了变化，称为“分析前影响”。这些不是分析干扰。分析方法在分析时检测样品中所有的分析物，不论它原先有多少。常见的分析前影响有： 体内药物的（生理）作用，如：药物作用使循环激素浓度的变化； 分析物因水解、氧化的化学变化； 分析物的物理变化，如酶的失活； 标本的蒸发或稀释； 被外加分析物的污染（如静脉注射内的盐，血液标本长期不分离造成葡萄糖的损失，溶血使红细胞减少）。2.2.4 相对干扰对控制品或基础混合血清检测的分析物具有的干扰，经计算是相对的。有时候，控制品或混合血清中含有内在的干扰物，如：在获得混合血清的病人群体某物质的平均浓度。常见的是胆红素、蛋白、和脂肪。有些方法校正或纠正了干扰物的平均浓度，所以对病人群体的干扰作用已经降至很小。典型的方法包括标本的预处理、空白纠正、以血清为基础的校准品、和计算纠正。但是当干扰物浓度大于或小于病人标本的平均浓度时，会出现误差。例如，某药物检测受蛋白影响，约每10.0g/L蛋白的偏倚为0.05mmol/L。由于血清中的平均蛋白浓度为70.0g/L，相对于无蛋白液的偏倚为0.35mmol/L。如果某方法已经对平均偏倚纠正了，当各个标本的蛋白浓度和平均浓度70.0g/L有偏离，每相差10.0g/L使药物结果0.05mmol/L。蛋白浓度为75.0g/L的标本具有的偏倚为0.025mmol/L，不是0.40mmol/L。除非标本蛋白浓度正好为70.0g/L，每个病人的药物结果都有小量的正或负偏倚，和实际蛋白浓度有关。以下表归纳以上的例子。假定药物浓度为25.0 mmol/L，检测受蛋白的影响如上述。注意：作空白测定后引入的偏倚仅0.20 mmol/L，而不作空白测定的偏倚为0.15 mmol/L到0.55 mmol/L。内在蛋白浓度（g/L）不作血清空白的测定作血清空白的测定结果（mmol/L）偏倚（mmol/L）结果（mmol/L）偏倚（mmol/L） 30.0 25.15 0.15 24.80 -0.20 50.0 25.25 0.25 24.90 -0.10 70.0 25.35 0.35 25.00 0.00 90.0 25.45 0.45 25.10 0.10 110.0 25.55 0.55 25.20 0.202.2.5 干扰的机制干扰物对分析过程影响的方式有： 化学作用。 干扰物和试剂竞争或抑制指示反应，干扰了结果。也可以因为络合或沉淀改变了分析物形式，产生干扰。 物理作用。 可能干扰物具有和分析物相似的性质，如能产生荧光、颜色、光散射、洗脱的位置、或电的相应等被检测和测量的信号。 基体效应。 干扰物可能改变标本基体的物理性质，如粘度、表面张力、浊度或离子强度等，是检测的分析物浓度发生明显的变化。 酶的抑制。 干扰物能通过抑制金属激活剂、和催化点的结合、或氧化必须的巯氢基等改变酶（分析物或试剂）活力。干扰物也能竞争酶反应中底物，形成干扰。例如，腺苷激酶会竞争和肌酸激酶（CK）反应的腺二磷（ADP），因此在某些CK测定方法中产生假阳性。 非特异性。 干扰物会和分析物以同样方式参与反应。虽然不同干扰物的非特异性有差异，但是它们在检验中的实际作用是一样的。如：在碱性苦味酸的肌酐方法中酮酸的干扰；在一些重氮胆红素方法中受吲哚硫酸盐的干扰等。 交叉反应。 在免疫化学方法中，干扰物的结构相似于抗原，也能和抗体“交叉反应”。这是一种非特异性。例如：在茶碱测定时咖啡因的干扰。交叉反应的程度是免疫化学方法特异性的度量，但它不是对干扰敏感的估计。 水取代作用。非水物质（蛋白、脂肪）占据了血浆中水的体积，影响了活度的检测。在报告血浆水中分析物浓度时，这些作用就不认为是干扰。3定义（略）4干扰试验的判断限（Decision Criteria）在进行评估实验前，为了确保实现目标，应该事先决定可接受限值。评估者必须确定检验结果用于临床时，干扰对分析影响的大小，因为在设计干扰实验时取决于离散多大时被认为在临床上有意义。在确定可接受规格时，要区分临床意义和统计意义。二者均重要。4.1 临床可接受的限值由干扰引起的允许误差的大小取决于检验结果的临床应用。一些项目的准确度要求（总允许误差）已经有了建议；可参见文献。有些项目的准确度限值用以下的方法确定。可以将准确度（允许误差）分解为偏倚、不精密度、和干扰因素，从中建立允许的干扰限值。在总允许误差中，除了方法偏倚和不精密度，以及分析物的生物变异外，余下的为干扰部分。（视作各个变量）4.1.1 从生理变异考虑的限值依据分析物的生理变异建立准确度要求的一种方法。原则上，认为相对于分析物在个体或群体中固有的变异（取决于检验项目的临床应用）可以消除的分析变异量为误差限值。这个方法对生理控制的分析物（项目）是合适的。4.1.2 从临床经验考虑的限值常以临床专家的协调来建立准确度的要求。依据他们的经验，参与者同意误差的限值，超过限值的误差将影响他们做出诊断或治疗的决定。可以由相关学科的临床专家共同确定准确度和干扰限值。4.1.3 从分析变异考虑的限值从检测方法的总长期不精密度也可以得到干扰的限值。如果干扰作用相对于分析变异很小，如小于一个标准差；则由可能的干扰引起的误差增量不会影响临床的决定，该物质也不认为是一个干扰物。这个方法的缺点是许多现代系统具有很好的精密度，则干扰的限值比医学的必要性更重要。4.2 统计意义（显著性）和作用在确定某物质是否为干扰物前，评估者必须确认结果在统计上是有意义的。要求作适当的重复，这样可以有充分的把握来检出临床上有意义的干扰，也可以有足够的可信水平肯定不存在临床上重要的偏倚。见第6.1节依据检出可能性和可信限确定样品的大小。本导则适用的统计方法称为“假设检验”。评估者事先决定病人结果中多大的偏倚在临床是显著的。这个允许偏倚量被认为是干扰限值。检验的无效假设认为没有干扰（即：偏倚不超过这个限值），另一种假设认为有干扰（即：偏倚超过了限值）。4.3 实验的分析物浓度应该在分析物的两个医学决定水平处进行初步的干扰评估。如果费用或其他问题限制初步实验只能作一个浓度，要知道；有可能遗漏了其他浓度处临床上有意义的干扰。附录A列出了许多常见项目推荐的实验浓度。已经出版的临界或决定值被选用。在缺少医学协调下的有些项目实验浓度是认为设定的。绝大多数项目是按照临床应用选择参考范围的上下限和病理浓度。4.4 可能的干扰物依据方法的特性，编辑了可能是干扰物的单子。列出的物质存在于病人标本中，也考虑了方法的化学反应和它的应用。以下列各点为导则。l 常见的标本不正常表现，如溶血、黄疸、和脂血。l 常用药物和非处方药。l 在病人群体中预期的不正常代谢物。l 检验项目涉及的病人群体常见处方药。l 药物包括其代谢物，因为它们的化学和物理性质可能会干扰检测方法。l 在相似方法报告有干扰的物质。见Young等、Tryding和Roos等的文献。l 标本添加剂，如抗凝剂（肝素、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐等），和防腐剂（NaF、碘乙酸、HCl等）。l 在收集和处理标本时接触的物质，如血清分离器用品、标本收集管和它的管塞，导管、导管的冲洗液、皮肤清洁剂、手洁净剂和洗液、玻璃清洗表面活性剂、涂粉的手套等。l 抑制影响某些检验的饮食（咖啡、b萝卜素、罂粟花籽等）。涉及的物质很多。属于下列的因为不是重要的干扰物，没有什么问题的可以不考虑： 基本上和清单上列出的某物质具有相同的组成和结构。依据相同的科学原理，说明对方法没有干扰的物质。依据化学性质和方法的化学反应，不认为是干扰物。处方剂量的药物太少，不会引起干扰。药物清除或代谢很快，在分析时已经不具有干扰浓度。4.5 实验的干扰物浓度要确定某物质是否在“最差”的条件下引起干扰，应该进行最高浓度的干扰过筛实验，这是实验室对要检验的标本进行观察的。下面的导则有助于选择相应的实验浓度。不同的机理会产生阳性或阴性的干扰作用（如血红蛋白既具有过氧化氢酶的活力，又在可见光范围内有强烈的光吸收），对每个物质在2个不同浓度实验，可以避免在实验浓度处对抗作用抵消的可能性。见第6.3节的其他实验方法，可以同时在多个分析物和干扰物浓度下实验。l 药物和代谢物血清、血浆和全血的标本，在报告的药物治疗剂量的2倍最高浓度下做实验。如果预期的血浓度不知道，可以假定药物剂量被分布在5升体积，进行2倍于这个浓度的实验。参见附录A-中常用药物推荐的实验浓度表。作尿液检验时，确定在24 小时排泄的最大量，2倍于该量进行实验（每升尿液的量）。 内源性物质同样，预先估计在病人群体中具有的最高浓度，并在此浓度下实验。见附录A-推荐的一些常见的内源性组分实验浓度。 抗凝剂和防腐剂对于血清、血浆和全血，进行5倍添加浓度的实验，并应注意添加后立即实验“short draw”。对于尿液，进行24小时尿液内每升含有的防腐剂量的5倍的实验。 饮食物质对于血清、血浆和全血，进行最大预期浓度的2倍的实验。对于尿液，按24小时尿液中每升的排除量的5倍进行实验。 标本收集和处理用品将用品和标本接触24小时，使提取可能的干扰物。使用的体积应视实际使用的最差状态。防止标本的蒸发，使易挥发分析物的损失。处理中应使用相应的控制标本以证实实验的标本，除了和用品接触外，其他的处理过程是相同的。5 质量保证和安全在进行干扰试验前，确认：l 已经按照厂商的说明对仪器作了校准和保养。l 分析系统在控制中，按预期要求运行。l 所有操作人员接受了培训，具有可接受的熟练操作能力。l 符合实验室安全要求。文件记录上述要求。5.1 训练和熟悉进行评估的人员必须熟悉被评估仪器的操作，接受了培训。按照仪器厂商的说明，对仪器保养和维修完善。5.2 标准警示（略）5.3 精密度的确认精密度必须和厂商的性能指标一致。需要作可重现性（批内精密度）的估计，按第6.1节实验要求确定重复次数。如果不知道重现性资料，按NCCLS文件EP5进行初步评价。5.4 真实性确认确定方法偏倚可以使用适当的回收实验或方法学比较实验（见NCCLS文件EP9）。尽管恒定偏倚不影响干扰研究，但比例偏倚将会低估或高估干扰作用。5.5 交叉污染的估计实验结果可能受处理标本时的交叉污染的影响。如果存在交叉污染，应设计实验将交叉污染作用从干扰作用中区分开来。5.6 质量控制实验开始前必须确认分析系统处在稳定运行中。在实验中使用统计质量控制方法进行监视。按照厂商要求或按NCCLS文件进行控制。5.7 安全和废弃实验用品关于安全、处理实验室化学品的废弃，请参见厂商的标贴和有关规定。6 确定干扰性质本节介绍评估某方法对干扰物敏感性的实验方法。实验室希望按照这些方法去了解新方法整个性能的一部分，但是这些实验方法主要是让厂商用来确定他们方法的特性。基本上有2个评价方法对干扰敏感的做法。每个都有优点和不足，但是他们可以互相补充提供信息，所以应一起使用。这2个方法是：l 将可能的干扰物加到有关标本中，观察干扰影响（见第6.16.3节）。l 将各个具有代表性的标本做评估方法和高度特异的比较方法的比较，评估偏倚（见第7.2节）。6.1 干扰过筛将可能的干扰物加到混合标本中，和同一个混合标本作对照，评价相对偏倚，称为“配对差异检验”。使可能的干扰物在较高的浓度下，形成“最差”浓度时评价干扰称为“干扰过筛”。如没有观察到临床的显著意义，由加入物引起的偏倚就不重要，不必再做试验。如果加入物具有临床显著意义，考虑为干扰物；应继续试验确定干扰物浓度和干扰程度的关系。目前尚无实用的干扰评价试验的方案能确认所有干扰物。一些干扰物（如药物的代谢物）在过筛中无法证实；而又会将一些物质误认为干扰物（如物质的形式不代表天然形式）。但是干扰过筛提供了标准化评估，补充了真实病人标本的研究。注意干扰试验的2个局限性l 加到混合血清中的化合物性质可能和体内循环的物质有差异。l 在检测的干扰物和分析物浓度时会抵消不同的干扰作用。因此，一直观察几个胆红素浓度下血红蛋白具有的干扰作用（见第4.5节）。将真正的病人标本的资料和“配制”标本资料结合起来有助于确定真实性。6.1.1 试验设计在一批检测中，对实验和对照混合血清一起如病人标本那样同样检测，作适当的重复。为了消除对没有干扰的无效假设出现假性拒绝（统计上为类错误）可能性，要求对样品作足够的重复检测，或对确实有干扰假设的假性拒绝（类错误）。每个样品的重复次数取决于4个因素：l 具有临床显著意义的最小差异大小。l 检验的无效假设的可信限水平。l 检验确认假设的有效率。l 检测的可重现性（批内精密度）。6.1.2 试验材料6.1.2.1 基础混合标本1）从数个没有服用药品的健康个体收集所需的新鲜标本（血清、尿液等）。混合标本应尽可能反映标本基体典型地符合检测的分析物的要求。2）如无法收集合适新鲜标本，特别注意选择冰冻或冻干的标本。处理过的控制品液体可能含有防腐剂和稳定剂，以及与实际不符的分析物结合状态，表现出的干扰作用和新鲜人血清不同。评价者有责任确认，试验材料是否适合替代新鲜临床标本。NCCLS 文件可以参考。3）考虑方法对样品量的要求，检测的物质数，和重复检测要求等，计算需要的混合材料的体积。4）确定基础混合材料中的分析物浓度，加入合适的纯材料调节试验混合材料中的分析物达到医学决定水平。避免引入其他物质。请参见附录B推荐的分析物浓度。6.1.2.2 储存液配制每个可能干扰物的储存液：（1）获取合适的可能干扰物的纯品，或物质的最相似循环形式。如果一定要使用药品级制品，注意药品内含有赋形剂、防腐剂、杀菌剂、杀真菌剂、抗氧化剂、着色剂、调味剂、金属氧化物、抗衡离子、和填充剂等，其中任何一个材料也许是观察到的作用的真实原因。（2）选择溶解试验材料的溶剂，具有最好的溶解作用。参见手册。要确认溶剂不会对评价方法具有干扰作用。以下为常用的溶剂。l 试剂级水（参见NCCLS文件C3）；l 稀释HCl或NaOH；l 乙醇或甲醇；l 丙酮；l 二甲亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）；l 其他有机溶剂。（3）对标本基体稀释越小越好，最好不超过5。因此加入的储存液浓度是要求浓度的20倍以上。（4）对有机溶剂要特别注意。易挥发试剂应防止蒸发。储存液应配制为可以达到的最高浓度。许多物质在水中的溶解度很差，可以加一些影响试剂或反应本身的后生物（artifacts）。氯仿在血清中溶解度很低，至少作1：100的稀释。乙醇浓度超过12会使抗体失活。注：有时候，干扰会随着内源性物质如CO2、pH、或蛋白浓度的减少而增加。为了评价这种作用，应在对基体影响最小的情况下，使基础混合材料中的可能干扰物降低，又保持分析物的浓度。用基础混合材料制备的对照控制，需要考虑稀释和添加的影响。所用的方式取决于分析物和干扰物的性质，也必须由评价者认可。6.1.2.3 对照控制混合材料应该和配制试验样品相同的方式配制对照控制。加入和试验样品内加入干扰物相同体积的溶剂。（1）如果在对照控制混合材料中含有试验的干扰物（如胆红素），用合适的方法确定内含浓度。（2）若对照控制混合材料的检测分析物浓度和基础混合材料间的可比性差，应评估溶剂是否是可能的干扰物。6.1.3 重复检测次数为了符合统计假设检验要求的可信限和可能性，需要确定重复检测次数。l 若假设没有强调干扰方向（阳性还是阴性），如在肌酐浓度为1.0 mg/L时的偏倚为0.2 mg/L，应使用双侧检验。l 若在假设中包括了干扰的方向，如在肌酐浓度为1.0mg/L时，a-酮丁酸引起0.2mg/L的干扰，应使用单侧检验。6.1.3.1 双侧检验用下列等式计算双侧检验需要的重复检测次数： （1）式中：z1-a/2是双侧检验的可信限水平100（1b）的标准化正态分布的百分位数，z1-b是100（1b)可能性的标准化正态分布的百分位数。s是检测批内重复的标准差，dmax是在某分析物浓度下最大的允许干扰。6.1.3.2 单侧检验单侧检验只要将等式中的z1-a/2换成z1-a。z1-a是单侧检验在可信限水平100（1a）时的标准化正态分布的百分位数。 （2）6.1.3.3 z百分位数值为方便应用，将常用的z百分位数值列表如下。表1. 常用可信限水平和可能性的百分位数百分位数0.9000.9500.9750.9900.995z百分位数值1.2821.6451.9602.3262.576例如，评价者需要检出1.5mg/dl的影响，以此作为可接受干扰的程度，这是在95的可信限（a0.05）和95的可能性（b0.05）。需要双侧检验。可重现性（批内精密度）为1.0mg/dl。计算需要的重复次数时，将这些值代入等式（1） = 2 (1.960+1.645) 1.0/1.52 = 11.6所以次数为12。即每个样品（试验和对照）要求重复检测的次数。6.1.3.4 重复次数在95的可信限和可能性下检出各种干扰作用需要的重复次数见表2。为方便应用，将干扰标准表示为批内重复标准差（dmax/s）的倍数。表2 在95可信限和可能性下检出各种干扰作用需要的重复检测次数dmax/s重复次数（N）dmax/s重复次数（N）0.8 411.5 121.0 261.6 101.1 221.8 81.2 182.0 71.3 162.5 51.4 143.0 3 6.1.3.5 重复次数的影响举例说明重复检测的适当次数的重要性。医生将血清肌酐的少量变化视为肾功能损害（肾排斥）的指示。有时候会对小于0.2mg/dl的变化很敏感。但是实验室知道，有许多生物化学代谢物和药物干扰了碱性苦味酸肌酐测定方法，它们应对表现的损害（排斥）负责。在某种情况下，近日肾可接受性为重复变化在1.01.2mg/dl间。医生希望知道这个变化是否是头孢菌素引起的。肌酐为1mg/dl 时，批内的重复标准差为0.075mg/dl。实验室考虑0.1mg/dl为显著的干扰。如果进行适当的重复检测，可以将不精密度的影响减小到能检出0.1mg/dl的干扰影响。首先，以批内重复性标准差（dmax/s）的倍数表示不精密度：0.1mg/dl/0.075mg/dl1.33。简略为1.3，从表2确定重复次数为16。如果考虑较大的干扰，如有0.2mg/dl的影响也可接受，则dmax/s2.7，从表2可知，只要进行4次重复检测即可。6.1.4 试验方法配对差异的干扰检验方案如下：（1）确定相应的分析物浓度。（2）建立“临床显著水平”的差异（dmax）标准。（3）确定每批需要重复检测的次数（n）。（4）制备临床标本的基础混合材料。（5）制备试验用物质的储存液（20倍浓缩）。（6）取1/20体积量的储存液加于容量瓶。例如：加0.5ml20倍浓缩储存液到10ml容量瓶。（7）用基础混合材料补充至体积。（8）取1/20体积量的配制储存液的溶剂加于第二个容量瓶。（9）用基础混合材料补充至体积。（10）吸取n份试验和对照样品检测。（11）按以下的顺序进行检测：试验（T）；对照（C）如：C1T1C2T2C3T3CnTn。注：如果系统受交叉污染影响，增加几个标本预防对照样品结果受试验样品结果的影响。如：C1T1CxCxC2T2CxCxC3T3CxCxCnCn。其中添加对照标本（Cx）结果不用。（12）将结果填于附录F表格。6.1.5 数据分析计算观察的干扰作用“点估计”dobs，作为试验均值和对照均值差。 （3）计算判断值dc，用下列等式确定假设是否接受， (4) 式中n是实际样本大小（来自等式1或表2）。判断值dc用双侧检验计算。dnull是无效假设确定值，通常为0。单侧检验以1a代替1a/2。如果需要计算干扰影响的95可信区间，按下等式。95%可信区间 式中 s方法批内重复精密度， n是每个标本的重复次数， t0.975，n-1在n30时，可以用2.0估计。6.1.6 结果的解释如果估计值dobs小于或等于判断值dc，说明有干扰物引起的偏倚小于dmax；反之，接受另一种解释，即该物质具有干扰作用。在解释干扰试验结果时，注意要点：l 由于抽样误差，实际干扰可能和观察的“点估计”不同。但是如果无效解释成立，有100（1-a）的可信限接受它，如果认为有干扰，有100（1b）的可信限接受它。反之，否认的可信限各为100a和100b。l 试验的配制标本加工性质会引入人为因素： 实际的干扰物可能不是现有药物，而是代谢物。 试验标本的基体可能不反映典型的有问题病理标本，因此引入了另外的基体效应。 加入的物资可能可病理标本中的干扰物不一致，例如：和蛋白的结合、金属的复合物、或分析物的异质性。l 认为选择的试验浓度也许不反映干扰。 干扰作用也许仅在和其他化合物的协调作用中表达出来。 干扰可能出现在分析物和干扰物的其他浓度，在试验的浓度下可能不干扰。6.2 干扰作用的特性如果在第6.1节试验的一个或多个分析物浓度中发现干扰作用，进行剂量响应的系列实验，确定干扰程度和干扰物浓度的关系。可以将具有最高干扰物浓度的混合材料和对照混合材料按不同比例配制形成干扰物浓度的剂量响应系列。6.2.1 实验设计剂量响应实验确定干扰物浓度和干扰大小的关系，用来估计在实验范围的任何浓度处的干扰作用。以定量容量法精确对2个混合材料配制系列实验标本，仅内含干扰物浓度不同，1个混合材料为实验的最高浓度，另1个为最低浓度。以随机顺序对所有标本在一批内作检测，避免批间差异，如校准或试剂批号的变化，造成结果解释的混淆。进行多个干扰物浓度实验的优点是，在相同的统计可信限下从每个浓度检出干扰可以减少重复次数。因为在确定可信区间时可以将所有标本的重复结果一起估计。一般对每个标本作3次重复足够了。如果需要确保95可信限和可能性，计算重复次数，请参见附录E。6.2.2 实验材料6.2.2.1 基础混合材料参见第6.1.2.1节。6.2.2.2 储存液间第6.1.2.2节。6.2.2.3 高浓度混合材料参见第4.5节和第6.1.4节。注：如果内源性物质在较低浓度引起干扰，见第5.1.2.1节。6.2.2.4 低混合材料用临床标本制备内含干扰物平均浓度的混合材料。几乎内含治疗药物为阴性；或对血红蛋白或胆红素是很低的。可参见第6.1.2.3节。6.2.2.5 实验混合材料配制系列实验材料，内含中间浓度的干扰物。按以下方式制备。确定线性的剂量响应有5个浓度足够了。（1）将高低混合材料等量混合形成中间浓度。（2）将低和中间浓度的混合材料等量混合，形成高低浓度1/4量的混合材料。（3）将高和中间浓度的混合材料等量混合，形成高低浓度3/3量的混合材料。6.2.2.6 制备方案图1为假设干扰物配制的方案。一般病人标本中含有约干扰物5mg/dl，在病理标本中可以达20mg/dl。所以高混合材料应为40mg/dl，低混合材料可检测出5mg/dl。高混合材料G（40mg/dl）低混合材料L（0mg/dl）中混合材料（LH）/2（20mg/dl）75混合材料（L3H）/4（30mg/dl）25混合材料（3LH）/4（10mg/dl） 图1 5个水平系列配制方案6.2.3 实验方法剂量-响应干扰实验的方案如下。（1）确定实验的最高和最低浓度。（2）确定认为具有“临床显著”意义的差异。已经在“配对差异”实验叙述（见第6.1.4节）。（3）确定每个浓度实验重复次数n（见附录E）。（4）配制高低混合材料。（5）制备中间浓度的混合材料。在烧杯中温和混匀。（6）制备1/4浓度的混合材料。在烧杯中温和混匀。（7）制备3/4浓度的混合材料。在烧杯中温和混匀。（8）按步骤3确定的重复次数n，对每个混合材料取样。（9）在一批内对5个浓度样品检测。第1次重复检测按低到高浓度，第2次从高到低；第3次从第到高。以平均可能的偏移的影响。（10）另一个消除偏移作用的做法是随机顺序检测，参见统计的随机表。（11）计算低混合材料的均值，所有各个结果都必须减去这个值。将结果列表分析。6.2.4 数据分析将干扰物浓度为X，观察值为Y，点在坐标纸上。检查剂量-响应关系。6.2.4.1 线性的影响如果数据点在直线上下呈随机分布，采用直线回归处理。计算斜率、截距和残余误差（回归标准误sy.x）。注意这是采用所有各观察值的回归分析，不是均值。将回归线绘于图上，确认回归线和数据点的配合，说明响应是线性的。见表3示例（干扰和干扰物浓度呈线性关系示例）。表3 5个水平剂量-响应结果的汇总说明具有线性关系混合材料干扰物浓度观察值重复1重复2重复315.004.825.852.89213.755.8611.0510.41322.5014.7714.1112.70431.2516.3418.4321.08543.0028.2124.3522.44数据分布和计算的直线回归见图2。注：原文件上的回归式为Y0.54X1.64。和本人的处理有差异。可以计算95的分布范围，这样可以在任何浓度下确定95的可信区间。用图2的数据表达的区间如下（略）。注意，可信区间将随着干扰物浓度而变化，最可信的是实验的干扰物浓度的中间。关于统计方法参见Draper的教科书。6.2.4.2 非线性的作用干扰作用可以和干扰物浓度呈非线性。这样，确定给定干扰物浓度下的干扰程度的估计可以从曲线图上进行。表4的数据为非线性。表4 5个水平剂量-响应结果的汇总说明具有非线性关系混合材料干扰物浓度观察值重复1重复2重复315.00-1.421.540.06213.758.7613.9510.3322.5019.8719.217.83431.2520.2422.3824.95543.0029.5125.6523.74将数据点于图上，见图4。在任何干扰物浓度的干扰程度可以从图中做出估计。也可以使用非线性回归分析。图4 干扰正常混合血清为了确定在干扰物25mmol/L下的干扰程度。从图中可知约为20mmol/L。也可以使用合适的非线性回归分析确定可信区间。6.2.5 结果的解释回归的斜率为每单位干扰物引入的偏倚。截距和内源性干扰物浓度有关。从回归式或图中可以估计在任何干扰物浓度下的干扰程度。图2中的斜率是正值，所以干扰是使结果偏高（阳性干扰）。由回归式可以估计出干扰物为25mmol/L时干扰程度为：Y 0.8225 mmol/L 4.116.4mmol/L。6.3 干扰物的结合评估可以在一个实验中更有效地评估2个或更多干扰物的作用。将实验的可能干扰物浓度和分析物作系统不同组合。对各个可能的干扰物的作用由因素分析作估计。这样可以增加有效性，提供更多信息；1次实验可以少做一些分析，又可以观察干扰物间以及和分析物的互相作用。可能的缺点是样品制备复杂，增加了认为误差。Kroll有这方面报告。更详细的内容见Box、Hunter、和Hunter的内容。7 用病人标本评估干扰第6.1节叙述的干扰过筛有明显的局限性。不论如何，在病人标本中还会有未曾预料的干扰。为了消除这种发生的可能性，应该分析有关病人群体的真正标本来评估内在的标本和标本间的变异。和各个标本有关的可重现的“离群”结果可以明确指示标本中有未知干扰物存在。由可重现标本的偏倚造成的高度“离散”也是说明存在干扰物的良好指示。7.1 实验设计用被评估方法和参考方法或认可比较方法进行2组病人标本的分析（即：实验组和对照组）的比较。从病人亚组间的偏倚结果说明有干扰。注：本节中没有详细的统计方法。7.2 比较方法在比较研究中以具有低干扰的良好特性方法来确定“真值”。理想状态下应该使用参考方法用于干扰评估。如果没有参考方法，使用其他的认可比较方法（即，方法具有良好的精密度和特异性，最好方法原理不同）。如果比较方法缺少征购的特异性，将方法具有的特性写出来。可能有以下的情况：l 由于任一个方法的被干扰，对某些病人标本会观察到偏倚。l 2方法间没有偏倚，可能因为（1）对相同的干扰物具有相同的灵敏度，或（2）没有一个方法被某干扰物干扰。2个方法间的关系（系统偏倚）由分析对照标本结果来确定。7.3 病人群体7.3.1 实验标本从某些病人群体中选择标本。具有明确诊断和某种疾病的、已知内含1个或多个可能的干扰物（如：治疗药物）的病人中收集标本。例如，可以依据下列要求选择病人标本：l 相关疾病（如具有心、肝、或肾病的病人标本）。l 相关治疗（如：来自已知使用某药物的病人标本）。l 尿毒症病人（如透析前），血液内含有高浓度的内源性代谢物或药物。l 其他可确认的组分（如：不正常浓度的胆红素、血红蛋白、蛋白、脂肪等）。7.3.2 对照标本对照标本必须具有相同范围的分析物。已知这些标本中没有某物质，或包括了检验的某疾病。选择对照标本应：l 来自不使用某药物的病人；l 内含可能的干扰物在正常水平；l 具有相同或相似的诊断；l 标本中内含分析物分布和实验标本相似。应在每批实验中都有对照标本。7.4 实验方法方法学比较参照EP-9。每个方法对每份标本作双份测定。需要的实验和对照标本数取决于3个因素：l 2个方法的精密度；l 被检测的干扰作用的大小；l 需要的可信限程度。如果干扰作用大，2方法有良好精密度，每组有1020个标本足够了。为了在一定可信限下定量干扰作用，如：偏倚在不精密度水平内，说明干扰作用不具有临床意义。参见EP-9文件。l 选择实验和对照标本组。l 选择合适的参考或比较方法。l 对每份标本2个方法均作重复测定，相互间隔越短越好，通常在2小时内。依据分析物和方法的稳定性要求调整间隔时间，做好记录。遵循下列提示： 若分析物或可能的干扰物不稳定，或基体不稳定（如全血）或样品量（样品蒸发）很小，实验时间特别重要。这些情况要求有明确提示。 为减少天间的不精密度，将实验分布在数天进行。要改变每天2批实验的顺序；改变（或随机化）批内对照和实验标本顺序。 如果方法受交叉污染影响，注意标本的安排顺序。 一定要注意，任何系统的差异都会导致干扰的假性表现。l 如果观察到偏倚，若可能，检测标本中药物或其他可能干扰物的浓度，以确定偏倚和干扰物浓度间的关系。7.5 数据分析目视数据分布通常可以了解有无干扰。对每组实验标本和对照标本的比较中，估计有无系统偏倚。如果有偏倚，评价在选择的病人结果和对照结果均值间差异的范围，并将此和干扰指标比较。由此决定是否能确定为干扰，或作进一步的评价。以下为补充导则的方法和例子，但是确定干扰的原因超出了本导则的范围。7.5.1 偏倚和比较方法值的分布图按以下步骤：（1）结果列表。取每个标本的均值。（2）计算每个标本的平均偏倚（实验方法结果减比较方法结果）。（3）以偏倚为Y，比较方法结果为X，点成分布图。用不同符号标示实验结果和对照结果。（4）作直线回归统计，求每组的。计算95可信限（参见例子）。7.5.2 评价可能干扰的偏倚典型的例子间图7。图7。病人标本4种不同干扰实验的结果图7A说明实验组数据（）较对照数据（）离散，因此相对于比较方法而言，这些偏倚可以忽略。本例结果建议：由实验标本某些组分引起的干扰，并不能予以肯定，因为可信区间覆盖了所有点（图右侧的标示，为均值2）。这些结果只说明抽样误差。需要继续研究。7.5.3.1相对于对照组无偏倚比例方法偏倚图7B说明，实验组和对照组都有明显的比例偏倚。二者的可信限几乎相同。没有因干扰引起的差异。7.5.3.2 相对于对照组的负偏倚图7C说明有明显的负干扰。二者的可信限明显分开。对照组有正偏倚。注意：干扰作用的偏倚比若不作对照组实验，以纠正非干扰因素的系统偏倚还要大。将实验组偏倚上限和对照组平均偏倚间的差异和干扰指标作比较，去估计这些干扰有无临床显著意义。7.5.3.3 相对于对照组无偏倚图7D说明实验组的平均偏倚较对照组略有负偏倚的表现。但是，这个大小的偏倚考虑对照组数据变异的离散程度。可信限说明结果间无显著差异。7.5.4 偏倚和可能干扰物浓度的关系若可能的干扰物浓度已知，观察它们和干扰偏倚是否相关。图8。（1）将偏倚（实验方法结果减比较方法结果）为Y，和可能干扰物浓度X点于图上。图8说明观察的干扰和可能干扰物浓度呈良好相关。对偏倚点结果的解释可参见EP9-A.。（2）检查偏倚和可能干扰物浓度的点子。如果关系呈线性，并在整个范围内离散为恒定的，则所有数据可以一起分析。用直线回归分析确定干扰作用和干扰物浓度的关系。见第6.2.4节。如果关系不呈线性，将数据分成较小的浓度范围，计算平均偏倚（干扰）和每小组的干扰物平均浓度。以此说明由可能干扰物引起的干扰作用的大小。7.6 结果的解释使用病人标本的局限性主要缺少实验变量的控制，要求在结果解释中有高特异性的比较方法。l 注意！本实验只说明偏倚和某物质的相关；无法证实引起干扰作用的关系。真实的干扰物可能和存在的预期干扰物是一个巧合。例如，因为某疾病，出现了某生化代谢物的干扰，会错误地认为是治疗疾病的药物的影响。l 标本不新鲜使易变组分损失（如：乙酰乙酸，CO2）。l 住院病人通常用多种药物，使内源性代谢物浓度升高。l 获得期望具有某疾病和使用某药物的病人组是很困难的。l 也许实验的病人群体的抽样组没有该干扰物。l 也许比较方法对于某干扰物没有良好的特异性，所以也会收相同干扰物的影响。但是，方法已经证明在提供有无干扰物的证据上是有价值的，可能不这样做会遗漏；可能是唯一的方法检出某药物代谢物未预料的干扰。它也为真实病人标本中确认可能干扰物提供了手段。请参见附录D用什么分离或免疫测定方法的考虑内容。8确定、确认和证实干扰的说明这些由厂商用来确认特异性和建立干扰说明；或由实验室证实厂商的说明和证实：它们方法的特异性满足医学要求。具有良好特性的方法使临床实验室去核实厂商的数据是否符合它们自己的确认和证实要求。本节叙述符合本方案干扰评估的必要要求。确认和证实（Validation，verification）词语很相似，但是在临床实验室、医疗用品和软件公司的应用中略有差异。容易出现混淆。本导则使用的词语见参考文献。Validation为符合了用户的要求（如：病人结果的准确度要求）；Verification为符合了特定的规格（specified criteria）（如：干扰的规定或干扰的说明）。8.1 建立干扰的说明（Claims）干扰是方法在使用中的局限性。商品化的方法，已知干扰的物质应在说明书中指出。没有干扰的物质也应在说明中说明，这样可以使实验室确定方法是否适合他们服务的病人群体。临床实验室要求厂商提供如下的信息：l 说明分析物和干扰物的浓度；l 可能有干扰的物质名称；l 已知干扰物的化学名和/或一般名称；l 用于确定临床具有显著意义干扰的规格（Criteria）；l 指出物质的某浓度，在该浓度以上将具有干扰；低于该浓度将无干扰；l 在某特定分析物浓度下干扰的95可信限；l 评估方案（若没有用EP7，说明方法和确定干扰的可能性和可信限。有3种方法说明干扰。（1）说明某物质的某浓度，超过该浓度将使偏倚超出干扰的规格（可能性为95）。（2）说明某物质的浓度，低于该浓度没有观察到有干扰（可信限为95）。（3）说明仅仅为：据报告某物质对方法有干扰。这种方式仅适用于尚无定量信息的情况。例如，出版资料报告有证据：当病人服用某药物后的结果和真值有差异。如果误差程度在临床上是显著的，厂商应（1）进一步研究来确定干扰；（2）说明物质有干扰的文献来源。 经过实验发现没有干扰的物质应该列表告诉用户。或以“特异性”方式提供（见第8.1.2节）。干扰和特异性的说明模式如下。8.1.1 干扰说明例1干扰物浓度系列结果：按照EP7文件评估Acme 的AST方法的干扰。将以下干扰物加入血清，在以下浓度下具有干扰。偏倚超过10将认为是干扰。*实验物质AST在25U/L时的干扰浓度AST在250U/L时的干扰浓度评论血红蛋白250g/dl325g/dl溶血表现N-乙酰胱氨酸150mg/ml300mg/ml药物剂量180mg/ml * 为95可信限。注意：不要依据这些结果对分析物结果作纠正。分析物和干扰物的关系没有被确定。例2胆