自来水中细菌总数的测定.doc

自来水中细菌总数的测定（太原师范学院生物系 生物科学 082班 山西 太原）摘 要：各种天然水中常常含一定数量的微生物。天然水中微生物的主要来源是：水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等1。自来水是指通过自来水处理厂净化、消毒后生产出来的符合国家饮用水标准的供人们生活、生产使用的水。它主要通过水厂的取水泵站汲取江河湖泊及地下水，地表水。并经过沉淀、消毒、过滤等工艺流程，最后通过配水泵站输送到各个用户，但是自来水中仍然含有微量的微生物。我国饮用水标准规定，饮用水中细菌总数（1mL水样中所含的细菌菌落的总数）每毫升不超过100个。本实验应用平板菌落技术测定水中细菌总数。目前一般采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取自来水的样品，利用培养基制作平板。按菌落计数方法进行计数，通过实验测得的菌数对照国家饮用水标准来判断水质2。自来水的微生物学检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。关键字：自来水 平板菌落计数技术 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 细菌总数 0 引言 水是生命之源，人的生存离不开水环境，水质的好坏对人们生活起着至关重要的作用，而判断水质的标准，微生物在水中的数量、种类是必不可少的。良好的饮用水细菌总数应500CFU/mL则不宜饮用，我国饮用水卫生标准（GB5749-85）规定每毫升水样细菌总数37培养24h不得大于100个。细菌总数是指水样在一定条件下培养后（培养基成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等）所得1mL水样所含菌落的总数。本实验只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧的细菌菌落总数。3 水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。通过此方法我们能够计算出水中的细菌总数，从而判断自来水是否符合国家标准，是否受到污染。国际上一般都采用总大肠菌群作为指示菌，每升水中的总大肠菌群指数。我国饮用水卫生标准（GB5749-85）规定每升水中总大肠菌群37培养48h小于3个。每升饮用水的水源中，总大肠菌群不得超过1000个。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。除采用平板计数技术测定水中细菌总数外，现在已有许多种快速、简便的微生物检测仪或试剂纸等也用来测定水中细菌总数。41 材料与方法1.1 时间地点(1) 实验时间 2010年10月26日27日(2) 实验地点 太原师范学院南区实验教学楼微生物实验室1.2 材料、试剂与仪器(1) 实验材料 自来水 (2) 实验试剂 牛肉膏 蛋白胨 NaCl 1mol/LNaOH 1mol/LHCl灭菌水 (3) 实验仪器 高压蒸气灭菌锅 培养皿 天平 pH试纸（pH5.5-9.0） 量筒 玻璃棒 电热炉 牛角匙 移液管 1.3 实验方法 1.3.1 灭菌（1）首先将内锅层取出,再向外锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。（2）放回内锅层,并把实验所用的培养皿、三角烧杯、移液管放入其中。（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺旋，使螺旋松紧一致，勿使漏气。（4）用电炉加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力上升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1MPa,121,20min灭菌。（5）灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时打开排气阀，旋松螺旋，打开盖子，取出灭菌物品。1.3.2 水样的采取放开水龙头使水流5min后，用已灭菌的三角烧瓶接取水样，以待分析。1.3.3 制备牛肉膏蛋白胨培养基（1）称量按培养基配方依次准确的称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在称量纸上，称量后直接放入水中，稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。（2）溶化在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。（3）调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/L HCl进行调节。1.3.4 细菌总数测定（1）灭菌移液管管吸取1mL水样，注入其中一套灭菌的培养皿中。共做两个平皿。（2）分别倾注约15mL已溶化并冷却到45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使自来水和培养基混匀。（3）另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL，作空白对照。（4）待培养基凝固后，倒置于37温箱中，培养24h，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数即为1mL自来水的细菌总数。2 结果与分析2.1 菌落照片 2.2 实验数据2.2.1 表 自来水中菌落数表实验数据平板菌落数平均值空白069/mL166263372475 2.2.2 菌落记数方法 （1）先计算相同稀释度的平均菌落数，若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。5（2）首先选择平均菌落数在30300之间的，则只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的菌落总数。（3）若有两个稀释度的平均菌落数均30300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数。6（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。 （5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。7根据我国自来水的饮用标准，即自来水中的大肠杆菌数不超过100个/mL，而本实验测得结果是69个/mL，故可知实验所取自来水样达标。3 讨论本实验应用平板菌落技术测定水中细菌总数。采用能使大多数细菌生长的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，采集自来水的样品，利用培养基制作平板，在适宜无菌条件下培养自来水中的细菌，按菌落计数方法进行计数，通过实验测得的菌数对照国家饮用水标准来判断水质。所以实验过程中保证无杂菌污染和适宜环境培养自来水中细菌尤为重要。实验过程中的一些注意事项：（1）倒置培养基时应降温至45 ，温度过高会烫死大肠杆菌，过低会使培养基凝固。（2）倾注培养基后要将平皿在桌面上做匀速旋转，将培养基和自来水样摇匀，在培养基中观察时可见一些菌苔就是平皿没有摇匀的结果。8（3）培养基不能反复升降温，倾入培养皿后应立即加盖，且灭菌后不应在空气中放置，以免杂菌混入。（4）应在高温时在对照组中倒入培养基，否则对照组中会出现大量的菌落。 实验过程中的误差分析：（1）倾注培养基后平皿在桌面上做匀速旋转，使培养基和自来水样摇匀，但由于平皿没有摇匀在培养基中可见一些菌苔。（2）由于菌种在固体培养基上借助重力作用而形成的，所以观察到绝大多数的细菌着生在培养基表面。4. 结论本实验的成败在于灭菌、无菌操作技术、培养基的温度等方面是否操作正确，因此接种过程务必防止杂菌的侵入。根据我国自来水的饮用标准，即自来水中的大肠杆菌数不超过100个/mL，而本实验测得结果是69个/mL可知实验所取的自来水样达标。 该实验存在着如下一些不准确的因素会影响实验结果：（1）在数菌落时，菌落太小且又处于培养基内部这样就不能观察到菌落从而影响结果；（2）在培养过程中由于细菌之间的相互抑制也会使计数菌落减少。因此，只有在实验不需要精确的情况下才可使用此方法。虽然水中存在大量的细菌且种类繁多，但由于牛肉膏蛋白胨所提供的生长条件的限制，培养基中所得的细菌群落较单一为大肠杆菌，呈圆片状。9（3）对照组中的菌落数为0个，说明我们实验做得很成功。如果对照组中的菌落数不为0个，这主要是因为有杂菌混入，杂菌来源可能：培养皿、三角烧杯、吸管等仪器灭菌不充分；灭菌后在空气中放置又落入杂菌；无菌操作技术不当，培养基倾入培养皿后没有立即加盖；配置培养基时反复升降温，使一些杂菌产生抗性等。10参考文献1 陈声明，刘丽丽. 微生物学实验研究方法 北京：人民教育出版社，19822 沈萍，陈向东. 微生物学实验M.4版.北京：高等教育出版社，2007.3 李根生 干燥培养基恩德制造及应用 上海：上海科学技术文献出版社，19944 郝士海 现代细菌学培养基和生化试验手册 北京：中国科学技术出版社，19925 罗雪云等 食品卫生微生物检验标准手册 北京：中国标准出版社，19956 沈萍、范秀容等.微生物学实验（第四版）.北京：高等教