第十一章-固相膜免疫测定.ppt

1 HRP催化的反应式为DH2 H2O2 D 2H2O 何者习惯上被称为底物 A DH2B H2O2C DD H2O2 OPD经与HRP反应后 再用H2SO4终止反应后呈 A 橙黄色B 棕黄色C 黄色D 蓝色3 目前ELISA中应用最广泛的底物是A OPDB TMBC 5 ASAD ABTS A B B 4 ELISA双抗体夹心法是 A 酶标记特异抗体用于抗原的检测B 先将待测抗原包被于固相载体C 标记一种抗体可检测多种抗原D 能用于半抗原的测定E 属竞争结合测定5 捕获法主要用于何种物质的测定A IgMB IgGC IgAD IgD A A 6 下列哪种方法用一种标记物可检测多种被测物 A ELISA双抗体夹心法B ELISA竞争法C ELISA间接法D ELISA捕获法E 放射免疫测定法7 关于ELISA竟争法 正确的是 A 用于检测抗原B 被测物与酶标记物的免疫活性各不相同C 被测物多则标记物被结合的机会少D 待测管的颜色比参照管的淡表示被测物量少E 结合于固相的酶标抗原量与样品中被测抗原量成正比 C C 1 每个亲和素能结合多少个分子的生物素A 1B 2C 3D 42 生物素分子中与亲和素结合的主要部位是 A 噻吩环B 咪唑酮环C 苯环D 羰基E NH 3 在用生物素标记酶时 酶活性会降低的是A HRPB 葡萄糖氧化酶C GalD AP B D 第十一章 固相膜免疫分析技术 掌握 免疫印迹试验熟悉 胶体金免疫技术的方法学种类与原理了解 胶体金与免疫金的制备 其他膜载体免疫分析技术 一概述二免疫层析试验三免疫渗滤试验四斑点酶联免疫吸附试验五免疫印迹试验六影响固相膜免疫试验的主要因素七固相膜免疫分析技术的临床应用 概述固相膜免疫分析技术 solidphasemembrane basedimmunoassay 特点 以微孔膜作为固相载体多孔性 非共价键高度吸附抗原或抗体易于漂洗 第二节免疫层析试验 免疫层析试验原理 以NC膜等为固相载体 样品溶液借助毛细作用在层析条上泳动 同时样品中的待测物与层析材料上待测物的受体 抗原或抗体 发生高特异性 高亲和性的免疫反应 层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域 通过目测或仪器检测标记物 在短时间内得到直观的实验结果 毛细作用是指浸润液体在细管里升高的现象和不浸润液体在细管里降低的现象 第二节免疫层析试验 免疫层析试验分为 胶体金免疫层析试验 ICA 荧光免疫层析试验 GICA 二 测定模式 一 胶体金免疫层析试验 1 双抗体夹心法测抗原2 竞争法测小分子抗原3 间接法测抗体 胶体金免疫层析试验 A G C B 双抗体夹心法测大分子抗原 阳性 2个条带 胶体金免疫层析试验 A G C B 竞争法测小分子抗原 阴性 2个条带 三技术要点操作要点 1 将试剂条标记线一端浸入待测标本中2 5s 或在标本加样处加一定量待检标本 平放于水平桌面上 2 在5 20分钟内观察结果结果判断夹心法 阴性 1条棕红色指控条带阳性 出现2条棕红色条带无棕红色条带出现为试剂失效竞争法 阴性 出现2条棕红色条带 阳性 1条棕红色指控条带 第三节免疫渗滤试验 1原理在硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中 依次滴加标本 免疫金及洗涤液 因微孔滤膜贴置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用 达到检测目的 2方法类型双抗体夹心法测抗原间接法测特异性抗体 三 试剂盒组成和技术要点 渗滤装置 胶体金标志物 洗涤液 Ag参照品 技术要点 1 平放反应板 于小孔内滴加含待测Ag标本1 2滴 与膜上的Ab反应而结合在膜上2 于小孔内滴加胶体金标记Ab试剂1 2滴 使胶体金标记Ab与结合在膜上的Ag反应3 于小孔内滴加洗涤液2 3滴 待完全渗入 洗去未结合的胶体金标记Ab 4 结果观察 阳性膜中央有淡红色或红色斑点 第四节 斑点酶免疫吸附试验 Dot ELISA 技术要点 1 抗原包被NC膜吸附力强 包被后封闭 2 抗原抗体反应抗原抗体反应后再加二抗3 确定酶结合物最佳稀释度阴性样品不显色 阳性显色最强时的酶结合物稀释度4 显色反应pH值5 8 6 0时反应最灵敏强阳性蓝黑色斑点弱阳性淡绿色半点 方法学评价 1 NC吸附力强 灵敏度较ELISA高6 8倍 2 可同时检测多种抗体 3 操作简便不需特殊仪器设备4 吸附抗原 抗体 或已有结果的NC膜可长期保存 不影响期活性 第五节 免疫印迹试验 immunoblottest IBT 免疫印迹试验将凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体反应的高特异性结合 又称Westernblot 是检测蛋白质特性 表达及分布的一种最常用的方法 蛋白免疫印迹试验重组免疫印迹试验 二Westernblot技术要点 1 抗原印迹与包被 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 电转移2 抗原抗体反应 间接法 3 检测 动画 SDS PAGE抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷 在聚丙烯胺凝胶中从阴极向阳极泳动 分子量越小 泳动速度就越快 此阶段分离效果肉眼不可见 只有在染色后才显出电泳区带 电转移将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上 选用低电压 100V 和大电流 1 2A 通电45min转移即可完成 此分阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见 酶免疫定位将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后 加入能形成不溶性显色物的酶反应底物 使区带染色 阳性反应的条带清晰可辨 并可根据SDS PAGE加入的分子量标准 确定各组分的分子量 免疫印迹法 三 方法学评