肉鸡的疾病诊断实验报告分析.doc

肉鸡的疾病诊断预防兽医学 陈新诺，马艳君，张兴民，薛照越，夏宾雁 畜主：刘女士 主诉：地养了8800只肉鸡，现16日龄，3日龄时接种用禽流感、新城疫疫苗后（当天气温降低），鸡群出现了咳嗽等症状，投氟苯尼考、泰勒菌素、银翘散等药物进行治疗，12日龄再次接种禽流感、新城疫苗，并接种鸡痘苗，13日龄时咳嗽、伸颈呼吸等呼吸道症状严重，排白色糊状粪便，近来3天左右每天死亡1030只鸡，采食饮水状况无明显变化，精神较沉郁，发病率为56%左右，发病死亡率呈上升趋势。 免疫状况：3日龄穿刺接种用禽流感、新城疫疫苗； 12-13日龄再次接种禽流感、新城疫苗，并接种鸡痘苗。病例解剖： 对送检的7只鸡进行解剖观察，发现在气管和嗉囊中有少量的粘液，气管有轻微的出血现象；腺胃乳头有不明显的的出血点，其他部位没有明显的病变。由于不能确定引起此次疾病是细菌还是病毒，所以参照能引起呼吸道症状的疾病的资料，我们对送检病鸡进行解剖，采集主要的靶器官（脾脏，肝脏，肺脏，脑组织，气管）进行了细菌和病毒的分离鉴定。 一、 细菌的分离及生化鉴定病料：送检的病鸡的肝脏，脾脏，肺脏。主要试剂：TSA+10%犊牛血清，生化鉴定管。细菌的分离：用接种环蘸取在无菌条件下从肝脏、脾脏、肺脏实质器官分离病原，接种于含10%犊牛血清的TSA培养基上，37 培养，二天观察细菌生长情况，将细菌按菌落形态大小分类，见表1，表2。 表1 菌落形态结构特征（TSA+10%犊牛血清 37 18h）肝脏：表1-1编号形态特征7-8金黄12mm边缘不齐，表面光滑，湿润，扁平7-7淡黄12mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平7-10淡黄小于1mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平3-2金黄针尖大小边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平4-2金黄针尖大小边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平4-4淡黄1mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平4-5淡黄12mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平1-1金黄12mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平3-1金黄12mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平2-2淡黄针尖大小边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平 脾脏：表1-2编号形态特征3-4淡黄针尖大小边缘不齐，表面光滑，湿润，扁平3-5淡黄针尖大小边缘不齐，表面光滑，湿润，扁平3-6淡黄针尖大小边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平3-7淡黄针尖大小边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平4-1淡黄针尖大小边缘不齐，表面光滑，湿润，扁平4-2淡黄1mm边缘不齐，表面光滑，湿润，扁平1-1金黄12mm边缘不齐，表面光滑，湿润，扁平3-1半透明12mm边缘不齐，表面光滑，湿润，扁平7-5半透明针尖大小边缘不齐，表面光滑，湿润，扁平 肺脏：表1-3编号形态特征2半透明小于1mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平6-1半透明小于1mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平7-1淡黄12mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平3-1淡黄12mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平3-2淡黄12mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平3-3淡黄12mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平7-3淡黄12mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平4-8淡黄12mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平4-9半透明1mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平4-10半透明1mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平4-11淡黄2mm边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平1-1淡黄针尖大小边缘整齐，表面光滑，湿润，扁平从表1我们可以得出每一只鸡都有实质器官分离出细菌，主要有7种， 见表2。表2 细菌形态特征总结形态特征编号数量（株）淡黄色针尖大小边缘不齐表面光滑 湿润 扁平脾3-4，3-52半透明小于1mm边缘整齐表面光滑 湿润 扁平肺2, 4-9 , 4-10, 6-1脾7-55淡黄色针尖大小边缘整齐表面光滑 湿润 扁平肺1-1脾3-6,3-73金黄色针尖大小边缘整齐表面光滑 湿润 扁平脾3-3肝4-2， 7-8肺3-2， 7-3，5淡黄色1mm左右边缘整齐表面光滑 湿润 扁平脾3-6， 4-1肝4-2， 4-44淡黄色12mm边缘整齐表面光滑 湿润 扁平肝7-7,4-5肺3-1, 3-2, 3-3,4-8,4-11,7-1,7-39根据形态结构特点，挑取具有不同形态并且具有一定数量的单菌落进行革兰染色，染色结果如表3。表3 细菌革兰染色结果肝脏： 表3-1编号G+阳性/阴性G-形态排列方式3-1G-杆菌、球菌成堆3-2G-球菌成堆、链状3-3G-短杆菌散在7-7G-球菌成堆7-8G+球菌成堆7-9G+球菌链状7-10G-杆菌链状4-6G+球菌链状4-7G-短杆菌成堆4-3G+球菌链状4-4G+球菌链状4-5G+球菌成堆、链状2-1G+球菌成堆、链状2-2G+球菌成堆、链状脾脏：表3-2编号阳性G+/阴性G-形态排列方式3-1G-短杆菌成堆3-2G+球菌成堆、链状3-3G+球菌成堆7-4G+球菌散在7-5G-短杆菌散在7-6G-短杆菌散在肺脏：表3-3编号阳性G+/阴性G-形态排列方式3-1G-杆菌成堆、单个都有3-2G-杆菌多散在分布3-3G-短杆菌成堆7-1G+球菌散在7-2G+杆菌散在7-3G+球菌成堆4-8G-球菌散在4-9G-杆菌链状4-10G-杆菌链状4-11G+球菌成堆通过染色结果我们发现，所分离的细菌主要分为革兰阳性（G+）球菌，革兰阴性（G-）球菌，革兰阴性（G-）杆菌三种，其中G+球菌有15株，G-球菌有3株，G-杆菌有12株。 取单菌落连续纯化至第三代，将纯化后的细菌，挑取具有代表性的进行生化鉴定试验。根据菌落形态和染色结果，我们挑取7株（脾3-4， 肺2， 肺1-1， 肺3-1， 脾3-3， 肝4-4，肝7-7）具有代表性的细菌进行生化鉴定。生化鉴定结果编号分别为00161，01775，01511，41777，01517，01745，00513，对照肠杆科细菌生化鉴定编码使用说明进行细菌种类查找，均未能找到相对应的编码，所以没能确定细菌的种类。这可能是由于所挑细菌并不是纯培养或者进行结果判定时主观性太强所致。虽然并未鉴定出有哪些种类的细菌，但我们从实质器官中分离得到了细菌，证明这些细菌为致病菌，本实验发现G+细菌和G-细菌数量一样多，且同一个样本中可以感染阳性阴性两大类细菌，说明鸡群的细菌感染较为严重。 二、病毒检测及鉴定 1病毒学检测 1.1 试验材料与方法 取送检病鸡7只，无菌采集脑组织，气管，肺脏，肝脏，脾脏。分别编号17号，取17号的脑组织进行病毒的检测。 1.2 实验步骤：（1） 病料处理 剪取一小块组织病料放入4ml离心管中，剪碎按1:3比 例加入PBS,用高速涡旋器将其制成悬液。 将上述悬液样品反复冻融3次之后，3000r/min离心 30min将上清液转移到新的离心管中备用。 （2）病毒RNA提取及反转录 在1.5 mL的离心管中加入刚离心过病毒原液300L，再加入TRIzol LS 700L，充分混匀，室温放置10min； 加入200L的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管 在4条件下，13000r/min离心15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）； 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min； 4，13000r/min离心15min用枪小心吸去所有上清； 1mL 75%乙醇洗一遍，4，10000r/min离心10min， 用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min； 加入20L DEPC处理水溶解沉淀。 （3）反转录 （10l体系）表4 反转录体系 试剂 剂量 5Buffer 2.0l dd H2O 4.5l RT酶 0.5l 引物 1.0l 反转录其条件: 37 15min,85 15s,16 10min。转录产物于-20保存。（4） 反转录产物进行PCR扩增 用4对PCR扩增引物，禽流感H5,H9引物，流感病毒引物，新城疫病毒引物表5 引物信息表引物名称 序列 目的基因片段新城疫上游引物 5-ACCAAAGAGAATCTGA-3 330bp新城疫下游引物 5-GACAGTCCCACTGGTCTC-3H1N1-M基因上游引物 5-TACTAAGGCTTTGGGAG-3 228bpH1N1-M基因下游引物 5-CTACTAAGGCTTTGGGGAA-3禽流感H9上游引物 5-GTCAGGATTAGTTGCTGGTTGG-3 540bp 禽流感H9下游引物 5-GATGAGGCGACAGTCGAATA-3禽流感H5上游引物 5-CGAATCCAATGACC-3 306bp禽流感H5下游引物 5-TCTATGGCAACCGTTCTT-3 PCR扩增反应条件如下:94预变性 4 min；94变性 30 s，54退火30 s,72延伸40 s，共40个循环；72延伸8 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统观察记录结果。（5） 结果见图11图分别为新城疫、禽流感H1、禽流感H5禽流感H9检测结果：新城疫：无阳性禽流感H1：3、6为阳性，500bp左右禽流感H5：无阳性 但由于图中阳性条带均不是目标条带，所以不能判定其是否为新城疫或禽流感病毒的感染，且由于之前鸡群接种过疫苗，所以还需要进一步试验来验证。2 鸡胚攻毒实验由于该鸡群接种过新城疫、禽流感疫苗，所以PCR鉴定结果的阳性不能判定是野毒感染还是由于疫苗的作用，于是为了鉴定是否为野毒感染，我们采用接种SPF鸡胚方法，回收尿囊液，测定病毒的凝血效价来进行判定。 2.1 材料与方法：10日龄SPF鸡胚18枚，分别接种从脑组织提取的病毒7枚，从气管提取的病毒7枚，4枚空白对照。 尿囊腔接种 标记气室与胚胎位置，并在胚胎面与气室交界之边缘上约1mm处避开血管作一标记，此即为注射点。 将鸡胚竖放在卵杯上，钝端向上。消毒气室的蛋壳，用开孔器钻开一长约2mm小口。 再次消毒钻孔区，接种病毒液0.2ml，将针头刺入孔内，经尿囊膜入尿囊腔，注入病毒液。 消毒后用石蜡溶化封孔，于37孵卵器孵育。 然后每天对鸡胚进行活力检测，看其是否死亡。 2. 2 病毒收集接毒后26h，有两枚鸡胚死亡，把死亡鸡胚放于4保存。（接种后收获病毒的时间根据不同病毒而异，甲型流感病毒一般培养4448h，乙型流感病毒培养72h）。之后72h内无鸡胚死亡，96h时将鸡胚全部放于4冰箱612h，以便收集尿囊液。消毒卵壳气室，用灭菌镊子去掉气室部的卵壳，再用无菌镊子撕去气室部壳膜，并翻开到卵壳边上。将鸡卵倾向胚胎一侧，用一次性注射器吸出尿囊液，每个鸡胚收获5-7ml尿囊液。收集尿囊液后，观察胚胎的发育及病变情况，发现并无胚胎出现明显病变。 2.3 血凝试验： 红细胞的制备：采集新鲜鸡血1mL，加入20