壳聚糖季铵盐与蛋白质的相互作用机理研究项目-生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室开放基金申请书

编号密级生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室（武汉大学）开放基金课题申 请 书 课题名称：壳聚糖季铵盐与蛋白质的相互作用机理研究 申 请 者：夏彩芬 工作单位：湖北工程学院 通信地址：湖北省孝感市交通大道272号 邮政编码： 432000 电 话子邮件： 申请日期： 2015.09生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室（武汉大学）制2015年9月27日申 请 须 知1申请者必须认真阅读生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室（武汉大学）开放基金管理办法（暂行），并按该管理条例的有关规定进行申请。2申请者打字填写本表，如申请者不具备高级专业技术职称或非博士学位获得者，应由2位推荐人分别填写推荐意见。3所有申请者的生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室开放基金项目申请书（加盖单位公章一式3份）汇至生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室（武汉大学）开放基金课题联系人处，并交与实验室负责人存档。5填表必须实事求是，认真翔实，不得虚报或留空。有的栏目如无内容可填，请写上“无”、“未”等字；若填写不下，可另附纸。课题名称中文壳聚糖季铵盐与蛋白质的相互作用机理研究英文Study on interaction mechanism of chitosan quaternary ammonium salt and protein起止年月自 2016年 1月至 2017年12月申请资助经费2.0（万元）申请者姓名夏彩芬性别女出生年月1979年3月学位博士最高学历博士研究生职称讲师专业特长生物质应用、生物光化学办公电动电工作单位湖北工程学院隶属关系依托单位名称湖北工程学院隶属关系联系人覃彩芹电合作单位隶属关系主要成员姓 名性别年龄职称工作单位参加月数课题分工签章覃彩芹男49教授湖北工程学院4指导设计李伟男36副教授湖北工程学院6样品合成付梅芳女30讲师湖北工程学院8样品分析课题摘要（200字以内）：壳聚糖季铵盐材料是具有潜在应用价值的非病毒基因载体。本项目拟采用缩水甘油三甲基氯化铵为季铵化试剂，制备壳聚糖季铵盐材料。以蛋白质为研究对象，采用等温滴定微量热、光谱法、电化学、分子识别等研究手段相结合的方式，深入系统的研究壳聚糖季铵盐与蛋白质相互作用的方式、结合位点、结构变化等，为壳聚糖季铵盐的生物安全性提供分子水平的应用基础。主题词（5个）：壳聚糖季铵盐；蛋白质；光谱法；等温滴定微量热；相互作用一、 立论依据（课题研究目的、意义及应用前景；国内外研究概况、水平和发展趋势；主要参考文献。）基因治疗是通过基因载体材料负载正常功能的基因，使其替代或修正缺陷基因从而达到治疗疾病的目的，将治疗性基因以一定方式高效导入所需部位，并使之在靶细胞中适时适量表达，是比较理想的基因治疗模式。因而安全无毒且无免疫原性的基因载体是目前基因疗法研究的重点。壳聚糖因其糖链上具有高密度的-NH2而带正电荷，易与带负电荷的核酸相互作用形成复合物，因此可用作基因载体材料，但其非水溶性和转染效率低限制了其在基因传递和基因治疗领域的应用。研究表明，壳聚糖的化学改性能显著改善其水溶性，壳聚糖季铵盐就是一类能在生理条件下具备较好水溶性的壳聚糖衍生物。Sajonsang等认为壳聚糖季铵化后，不仅极大地改善了水溶性，还能显著提高抑菌性能，且抑菌能力随着取代度的不同而不同。刘璠娜等的研究结果表明，在壳聚糖分子上引入季铵基团可制备出N,N,N-三甲基壳聚糖盐酸盐，与质粒DNA复配后能形成稳定复合物，并能有效地包裹和保护质粒DNA，使其免受脱氧核糖核酸酶的消化。不同季铵化取代度的壳聚糖季铵盐在HepG2细胞中的转染效率与脂质体(基因治疗的理想载体)相似或较高。Xiao等将缩水甘油三甲基氯化铵作为改性剂制备壳聚糖季铵盐，并通过细胞转染实验证明，在HeLa细胞中，壳聚糖季铵盐作为基因载体材料的转染效率非常高，考察转染效率的影响因素后发现转染效率高低取决于其与质粒DNA质量比及季铵化程度。壳聚糖季铵盐材料在体内发挥其基因载体功效的同时，不可避免的与各种生物大分子、细胞、组织器官等相接触并产生不同的物理、化学或者生物反应，因此，该材料的安全性是衡量其作为生物医用材料的最重要性能指标之一，是其能最终应用于材料医学领域的先决条件。蛋白质是生物体形态结构和生命活动所依赖的物质基础，研究材料对蛋白质的结构和功能的影响，是了解其毒性机理的直接途径。目前国内外对壳聚糖季铵盐材料影响蛋白质结构和功能的研究还较少，且已有的研究中对于二者的作用机理除了静电作用外，是否存在氢键、疏水作用等还缺乏统一认识。基于以上考虑，结合课题组的工作基础，本项目中将合成不同取代度的壳聚糖季铵盐材料，继而综合利用微量热、光谱学等技术手段，从热力学、热动力学、生物学的角度出发，研究壳聚糖季铵盐与蛋白质的相互作用对其结构性质的影响，并深入分析壳聚糖分子量、取代度、及pH值等环境因素对作用机理的影响，从分子水平上阐明壳聚糖季铵盐材料的毒性作用机制，同时为其作为基因载体材料的设计、制备和应用提供重要的指导作用。主要参考文献：1 Amidi M., Mastrobattista E., Jiskoot W., et al., Chitosan-based delivery systems for protein therapeutics and antigens. Advanced Drug Delivery Reviews. 2010, 62: 59-82.2 Aljawish A, Chevalot I, Jasniewski J, Scher J, Muniglia L. Enzymatic synthesis of chitosan derivatives and their potential applications. Journal of Molecular Catalysis B - Enzymatic, 2015, 112, 25-39. 3 Saomsang W., Gonil P., Petchsangsai M, et al., Effect of N-pyridinium positions of quaternized chitosan on transfection efficiency in gene delivery system. Carbohydrate Polymers, 2014, 104: 17-22.4 Sajomsang, W., Gonil, P., Ruktanonchai, U., et al., Effects of molecular weight and pyridinium moietyon water-soluble chitosan derivatives for mediated gene delivery. CarbohydratePolymers, 2013, 91: 508517.5 Cui L M., Tang C., Yin C H., Effect of quaternization and PEGylation on the biocompatibility, enzymatic degradability and antioxidant activity of chitosan derivatives. Carbohydrate Polymers. 2012, 87: 2505-2511.6 刘璠娜, 饶华新, 张子勇. 季铵盐壳聚糖及其纳米粒子作为基因载体的研究J. 材料导报B: 研究篇, 2013, 27(1): 44-47, 67.7 Huang J., Cheng Z H., Xie H H., et al., Effect of quaterniazation degree on physiochemical and biological activities of chitosan from squid pens. International Journal of Biological Macromiolecules. 2014, 70: 545-550.8 初立秋, 陈煜, 谭惠民等. 新合成壳聚糖季铵盐/DNA复合物在Hela细胞中的转染效率J. 中国组织工程研究与临床康复, 2009, 38: 7437-7441.9 Hu Y J., Liu Y, Xiao X H., et al., Investigation of the interaction between berberin and human serum album. Biomacromolecules. 2009, 10: 517-521.10 Wei X W, Shao B, He Z Y, Ye T H, Luo M, Sang Y X, Liang X, Wang W, Luo S T, Yang S Y, Zhang S, Gong C Y, Gou M L, Deng H X, Zhao Y L, Yang H S, Deng S Y, Zhao C J, Yang L, Qian Z Y, Li J, Sun X, HanJ H, Jiang C Y, Wu M, Zhang Z R. Cationic nanocarriers induce cell necrosis through impairment of Na+/K+- ATPase and cause subsequent inflammatory response. Cell Research, 2015, 1-1711 Lakowicz JR., Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed., Springer Publishers, Berlin, 2006.12 陈艳晶. 壳聚糖和药物分子与生物大分子相互作用及其分析应用的研究D. 山东大学，2007.13 Grner S., Neeb M., Klebe G., Impact of protein and ligand impurities on ITC-derived protein -ligand thermodynamics. Biochimica et Biophysica Acta. 2014, 1840: 2843-2850.二、 研究方案及可行性（研究内容；预期研究目标和考核指标；需解决的关键问题和技术难点；拟采取的研究方法和技术路线；申请项目的特色或创新之处；可能遇到的问题及解决对策；成果形式（包括提交论文的数量、题目和时限。）研究内容1、壳聚糖季铵盐的制备及取代度的测定2、壳聚糖季铵盐与蛋白质相互作用及其对蛋白质构象和功能的影响预期研究目标和考核指标实现壳聚糖季铵盐的定量合成，确定最佳季铵化条件，做到可控合成，建立不同取代度壳聚糖季铵盐与蛋白质作用的构效关系，初步建成生物医用高分子材料与生物大分子相互作用的研究模型。拟采取的研究方法和技术路线本项目将以壳聚糖为原料、缩水甘油三甲基氯化铵为季铵化试剂，通过接枝反应制备不同分子量、不同取代度壳聚糖，并从生物医用材料安全性的角度出发，进一步研究壳聚糖季铵盐与蛋白质的相互作用及机理。拟采用以下方法进行研究：(1) FTIR和1H-NMR分析：利用FTIR和1H-NMR测试结果来确定壳聚糖改性的季铵化行为，并确定反应位点。(2) 容量分析法：采用电位滴定法测定壳聚糖季铵盐溶液中Cl-含量，从而确定壳聚糖季铵盐的取代度。(3) 等温滴定微量热法(Nano-ITC):采用Nano-ITC研究壳聚糖季铵盐与蛋白质相互作用的热力学及热动力学变化。(4) 光谱法：采用荧光和紫外可见光谱法，考察壳聚糖季铵盐作用后蛋白质结构中色氨酸、酪氨酸等发光基团的变化，并通过检测作用前后蛋白质的荧光寿命确定结合机理；采用红外和拉曼光谱法研究蛋白质在壳聚糖季铵盐作用下肽链的伸展变化；采用圆二色谱法研究蛋白质-螺旋、-折叠、无规卷曲等结构含量的改变；采用表面等离子体共振技术研究壳聚糖季铵盐与蛋白质间的结合参数；采用位点竞争及分子模拟等手段研究壳聚糖季铵盐在蛋白质上的具体作用部位。(5)电化学法：采用生物电化学方法研究蛋白质修饰过的金电极对壳聚糖季铵盐的电化学响应行为，获取二者作用的结合常数等。(6)分子模拟及原子力显微镜：通过分子模拟及原子力显微镜等研究HTCC/蛋白质复合物的结构、形态、结合位置等。需解决的关键问题和技术难点HTCC对蛋白质结构和功能的影响机制生物大分子水平上热动力学信息的有效获取申请课题的特色或创新之处1、通过具有重要生理功能的蛋白质生物大分子来研究HTCC作为载体材料的生理安全活性，文献中报道极少，在研究思路上具有创新性。2、将精密生物微量热技术、多种光谱手段、生物电化学方法等用于生物医用材料HTCC生理安全活性的研究，具有学科交叉的优势，能获得其他实验技术手段难以获取的信息，将建立基于生物热力学和光谱学表达的水溶性壳聚糖衍生物研究的新模式和新方法。可能遇到的问题及解决对策分子量和取代度对HTCC和蛋白质的作用效果会存在影响；通过比较分析，摸索出不同分子量、不同取代度HTCC对蛋白质的作用规律。成果形式发表高水平学术论文12篇三、研究计划（研究进度计划及阶段目标；在重点实验室从事研究工作的安排）(1) 2016年1月- 2016年12月不同取代度HACC的制备、结构和性能表征；不同取代度壳聚糖季铵盐与蛋白质相互作用过程中的生物热力学及热动力学问题；研究HACC与蛋白质作用的结合过程、方式及结合部位。(2) 2017年1月- 2017年12月研究壳聚糖季铵盐作用前后蛋白质分子构型构象及微观结构的变化；研究外部条件(pH值、离子强度)和壳聚糖季铵盐取代度、分子量等结构因素对壳聚糖季铵盐/蛋白质相互作用及对蛋白质构象和功能的影响；分析总结，撰写报告，结题。在重点实验室从事研究工作的安排：计划在重点实验室做研究8个月。四、 已具备的研究条件（与申请项目有关的研究工作基础；申请者所在单位现有的研究条件；外协及合作研究工作落实情况） 1、工作基础本实验室主要进行有关甲壳素和壳聚糖的结构修饰、生物活性和功能材料的研究，已积累了多种类型的壳聚糖及其衍生物类型。主持完成省部级多项有关壳聚糖基础应用研究课题。实验室的科研成果转化已为企业产带来较大的经济效益。这些研究为本项目的继续开展奠定了坚实的基础，积累了经验，探索了方法。另外，本实验室有超过5位教师在从事壳聚糖及其衍生物作为生物医用材料的研究工作，发表相关的高水平研究论文数十篇 。2、现有的科研环境、仪器设备本院已有美国TA公司的八通道生物活性微量热仪TAM Air、等温滴定微量热仪NANO-ITC、英国爱丁堡的瞬态/稳态荧光光谱仪FLS920、德国布鲁克红外光谱仪、X-ray衍射仪、紫外可见光谱仪、电化学分析仪、高效液相色谱仪(含GPC系统)、电化学工作站、原子吸收光谱仪、原子力显微镜、圆二色谱仪、酶标仪、扫描电子显微镜、透射电子显微镜(申购中)等大型科研仪器。本项目研究所需的分析检测仪器设备已基本具备。目前的工作条件已支撑项目组成员以前主持的省部级资助的科研项目的圆满完成，因此，现有的科研环境、仪器设备能保证该研究工作的顺利进行。3、研究基地申请者为生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室(湖北工程学院，原孝感学院)成员，同时为化学与材料科学学院科研骨干。本实验室主要任务就是结合湖北省社会发展、经济建设和科技进步的需要，深入研究将壳聚糖及其衍生物转化为安全无毒且环境友好材料的基本理论及应用技术。设有天然多糖、生物医用高分子材料、高分子复合材料三个研究方向，现有成员基本都为博士，实验室成员承担国家级和省级项目数十项，发表各类研究论文总计百余篇，且实验室面积、仪器设备等外在条件基本满足开展生物医用材料方面的研究。 五、申请者及主要成员情况（申请者学术研究简历和主要成果及水平；主要成员学术研究简历和主要成果及水平）夏彩芬，博士，毕业于武汉大学化学与分子科学学院，获物理化学博士，研究方向为生物物理化学，师从国家杰出青年基金获得者刘义教授。硕士毕业于华南师范大学化学与环境学院高分子化学与物理专业，研究方向为生物质材料及生物光化学，具有较好的学科交叉背景。目前主要从事壳聚糖及其衍生物的化学生物学、生物微量热技术方面的研究工作，熟悉生物微量热仪、多种光谱仪器的操作和使用，主持国家自然科学基金项目（21503075）和湖北省教育厅科学技术项目（B2015034），参与省科技厅科研项目两项，在Chemosphere、Biological Trace Element Research等杂志上发表SCI收录论文6篇。主要发表论文如下(排序1):1Microcalorimetric studies of the effect of cerium(III) on isolated rice mitochondria fed by pyruvate. Chemosphere, 2013, 91:1577-1582.2Ce(III)-induced rice mitochondrial permeability transition investigated by spectroscopic and microscopic studies. Biological Trace Element Research. 2013, 15