专题10中药指纹图谱的研究现状与进展.doc

中药指纹图谱的研究现状与进展一、中药指纹图谱的含意中药指纹图谱借用了法医学中的指纹鉴定的概念，通常是指借助于现代分析及检测技术来表达中药（主要是次生代谢产物）化学信息特征的指纹图谱，包括含中药材（原料药材）指纹图谱；中药原料药（包括饮片、配伍颗粒）指纹图谱和中药制剂指纹图谱。中药指纹图谱是组分群体的特征图谱，能全面反映中药所含化学成份的种类与数量，进而反映中药材及产品的质量。它是一种十分可行的质量控制模式，运用整体性与模糊性的基本属性，即物种特征的唯一性和同种个体间的相似性，为中药材和中成药提供综合的、 宏观的和可量化的质量评价，可使中药质量评价过程更加科学化、标准化。二、中药指纹图谱的属性中药指纹图谱是以各种分析技术为依托的质量控制模式，通过特定条件下完整图谱的整体信息来鉴别真伪，同时，在定量操作的前提下，用所得到的量的信息来估量被测样品的量的差别。中药指纹图谱有两个基木属性：整体性和模糊性。所谓整体性，是指要把所得指纹图谱作为一个整体进行评价，而不是孤立地看其中单一峰的有无、高低来判断药材或成药质量；而模糊性是指个体样品本身就存在着差异，难以精确地进行测量，绝大多数的指纹图谱本身就存在模糊性，不能保证所得的指纹图谱中每个峰都没有重叠，而且也不能保证所得的图谱包含了样品的所有特征，只要能固定图谱中关键部分就可对样品进行质量控制。三、中药指纹图谱的起源、发展与构建中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。最先发展起来的，目前最主要和常用的是中药化学指纹图谱。中药化学指纹图谱首推色谱方法和联用技术。光谱最常用的是红外光谱(IR)，色谱最常用的是薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)，近来又出现了X-射线粉末衍射指纹图谱。现代指纹鉴定始于19世纪末的犯罪学和法医学。每个人的指纹在微小的细节构造上各有不同，可以以此鉴别每个人的特征。指纹图谱技术应用于植物药质量控制，是从20世纪70年代色谱技术的发展开始的。人们大量采用薄层色谱(TLC)方法，将植物中化学成分展载于由各种担体铺成的薄层板上，根据薄层板上的斑点的位置、大小、颜色、数目进行定性鉴别，这种薄层鉴别方法具备了指纹图谱的特征。20世纪70年代及80年代，出现了薄层扫描仪，日本和我国部分学者用薄层扫描仪得到复方成药扫描图作为色谱指纹图谱，尝试应用于药材及成药的分析。20世纪80年代及90年代，高效液相色谱技术得到发展，同时植物药中化学成分的分离鉴定，活性成分的不断阐明，高效液相色谱广泛应用于中药的定性、定量分析。随着HPLCMS和GCMS等联用技术的应用，中药指纹图谱技术更趋完善。中药指纹图谱的发展概要见图1。构建指纹图谱的步骤通常包括:样品采集、方法建立、数据分析、样品评价和方法检验。样品采集是指采集足够多反映样品质量的标本；方法建立是指选取适当的方法建立指纹图谱并进行考察；数据分析是对所得数据进行处理找出共性与异点，确定评价指标；样品评价是指按所确定指标对样品进行质量评价找出孰优孰劣；方法检验是指在方法确立后的一段长时间内对更多未知样品进行检测，进一步考察方法的可行性。指纹图谱的构建与评价流程见图2。图1：中药指纹图谱的发展图2：指纹图谱的构建与评价四、建立中药指纹图谱的意义中药现代化是当代中药发展中的一个最热门的研究方向，已成为国内外医药界的一大热点但中药的均一稳定性即质量可控的问题则是制约中药发展，走向国际市场的瓶颈问题。我国地域广阔，药用植物资源极为丰富，目前拥有中草药12807种，其中植物药11146种，动物药1581种，矿物药80种。由于药材品种繁多，地区用药习惯各异，古代本草记载简单，误传错用和用药演变等因素，导致药材同物异名、同名异物以及正品、非正品都入药的混乱现象非常严重。更为普遍的是，影响中药成分的因素复杂，即使是同一药材，其有效化学成分常因生态环境、采集时间、储存和炮制方法等不同而有差异。这些问题严重影响了中药的质量和用药的安全性与有效性。传统的中药质量控制方法与现代化学合成药品的质量控制技术有着根本区别。中药一般为复方制剂，中药理论讲究君、臣、佐、使；讲究药物组方配伍；讲究因人而异、天人合一、辨症施治，方剂中有效成份极为复杂，大部分结构、作用机理尚不清楚。在现有条件下，以单一化学成份分析的观点，不适合中药（天然药物）这一复杂成份分析体系。中药材生产过程复杂，受多种因素的制约，这些都为其质量可控提出了新的课题。而解决这一难题的有效手段，可以参照国外植物药的质量控制方法，借鉴化学药品质量控制模式，借助于现代的、被国际社会所认可的中药指纹图谱技术。药材、中成药质量标准现代化是中药现代化的一个重要组成部分。目前为止，在中药生产和流通中，还没有一种质量控制手段能够全面、综合地反映出中药产品的质量变异，有效地进行全过程的质量控制。中药指纹图谱的研究和建立正是为了解决药品质量控制和监督这一关键问题而采取的一种方法。它从药材的生产、粗加工、贮存， 制剂的原料、中间品、成品、流通样品等等各个角度和方面，进行中药样品的理化分析，通过相似性和相关性对比发现质量变异和缺陷，从而全面、特异地把握住中药的质量命脉。中药指纹图谱这种方法现在已成为国际上通用的方法，并且已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段。 中药指纹图谱是用多学科交叉、综合技术手段对复杂物质组成体系，质量稳定性进行评价的检测方法，运用中药指纹图谱和指标成份定量相结合的方式，既可以完善表述中药的整体性特征，又别于西药单一成份定量的质量控制模式。中药指纹图谱学是分析科学、中药学、分离科学以及化学、生物信息学等二级学科交叉，综合应用研究的结果，是中药现代质量标准体系的核心技术之一，又是解决药品质量控制和监督这一关键问题而采取的一种方法。通过相似性和相关性比对，发展质量变异和缺陷，从而全面特异地把握住中药的质量命脉。又为中药新药研发带来了一种崭新的研究模式，从整体综合的角度把握住了药物多靶点作用及针对性，为新药发现和快速筛选提供了思路和方法。中药指纹图谱技术主要体现了信息获取、信息处理、信息挖掘三方面的内容。具体的讲，就是从中药物质基础的角度出发，运用现代分离分析科学的手段，获取中药化学指纹图谱。结合药效研究和相关物质成份的分离鉴定，经谱效关系研究，获取中药药效组分指纹图谱，并将已取得的指纹图谱用于中药材，中间体和中药复方制剂的质量控制以及创新药物研究的实践中，最终解决中药质量评价的科学性和关键问题；解决制约中药发展，走向国际市场的瓶颈问题。中药指纹图谱质控技术又与GAP基地建设，SOP质量管理息息相关。中药生产标准化是中药产业现代化发展的基础和关键，而中药指纹图谱技术又是中药现代化建设的主要技术手段之一，对中药“安全、有效和质量可控”，保证物种的延续，遗传基因的稳定性，品种的地道性和药用价值起着至关重要的作用。 中药指纹图谱质控技术是中药质量标准现代化的突破口，将现代分析学的优秀成果与中医药整体综合观有机融合，有效地运用了全面质量管理的理念，能对中药复杂体系特性作出科学的表达。可用于原料材料、工艺操作、成品质量的质量控制和监测，使其符合GAP、GMP的质量要求。总之，中药指纹图谱的建立和推行对企业的发展提高竞争力，提高中药质量评价技术水平和科技含量，使其为国际社会所公认，实现与国际双向接轨，挤身国际市场，把中药产业做大做强有重大的意义。 五、国内外中药指纹图谱应用的情况当前，研究中药指纹图谱技术在国内外已成为一种发展趋势。我国国家食品药品监督管理局2000年8月颁发了中药注射剂指纹图谱检测标准研究指导原则中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)(国药管注2000348号)以来，中药指纹图谱的研究成为中药研究的热点。国家药品监督管理局要求到2002年末，所有申报的中药注射剂均应有相关的指纹图谱资料，包括中药原料、提取物、产品3种图谱，3种图谱的峰形必须有较大的相关性，否则不予受理。，中药注射剂已强制实行中药指纹图谱质量标准指标，一批中药注射剂如注射用丹红(粉针剂)、注射用双黄连(冻干)、注射用辛芍(冻干粉针)、清开灵注射剂等有74种中药注射剂相继建立了指纹图谱质量标准。2003年国家科技部将指纹图谱研究列入“十五”重点攻关专项。近几年国家攻关计划中“常用中药的品种整理与质量研究”项目的开展，已经对200余种常用中药的本草考证、来源、产地、指标性成分含量测定等进行了系统研究。国外有关指纹图谱的报道无一例外地将指纹图谱作为鉴别项，用来评价植物药的真实性以及产品质量的一致性。美国植物药产品工业指南（2000年草案稿）中明确表示，允许植物药保健品申报资料提供色谱指纹鉴别图谱，在申报IND（Investigation New Drug）和CMC(chemistry Manufacture and Control )资料时，植物药物质（Botanical Drug Substance)和植物药产品（Botanical Drug Product）的质量控制可以采用指纹图谱；英国植物药典(1986年）、印度植物药典（1998年） 以及加拿大、德国等国家也接受色谱指纹图谱。此外，WHO于1996年植物药评价指导原则中明确提出：“如果不可能鉴别有效成分，则鉴别一种或几种特征成分（如色谱指纹图谱），以保证制剂和产品质量的一致”。欧盟在植物药质量指南的注释中也提到：“植物药的质量稳定性单靠测定已知的有效成分是不够的，因为植物药及其制剂是以其整体作为有效物质，因此，应该通过色谱指纹图谱显示其所含的各种成分在植物药及其制剂中是稳定的，其含量比例能保持恒定”。中药指纹图谱技术是符合中医理论及现状的较好的质量控制技术。因为它并不需要详细了解药物的具体活性成份信息，只需要了解个别指标性活性组分信息，以指标性成份峰作为标记，结合非指标成份进行比对，用来综合评价药物质量，既符合中医药理论的整体观点，也满足了对中药质量的可控、保证其疗效的要求。总之，随着中药指纹图谱技术的推广和应用，定会使古老的传统中药焕发勃勃生机，为中医药产业的发展插上了翅膀。六、中药指纹图谱在药品质量控制中的应用1中药指纹图谱用于中药材的鉴定辛海量对不同来源的蔓荆子、黄荆子、牡荆子，进行近红外漫反射指纹图谱聚类分析，建立基于近红外漫反射指纹图谱的快速、简便的鉴别方法，采用近红外漫反射光谱技术及聚类分析方法进行分析，结果4种生药聚类分析结果与传统植物分类结果一致，可以据此进行鉴别：多个产地来源的单叶蔓荆子聚类分析结果与其地域、纬度分布及品质关系密切，可据此分为3个居群类型。该方法可用于蔓荆子、黄荆子、牡荆子的鉴别，也可用于蔓荆子品质分析、种内变异研究。董雯雯等应用X射线衍射分析方法，对牡蛎、龙骨、白矾及其煅制品进行X射线衍射指纹图谱分析及特征标记峰鉴别，得了3组样品的标准X射线衍射傅立叶( Fourier)图谱及特征标记峰值。实验结果表明，X射线衍射傅立叶谱鉴定法可用于牡蛎、龙骨、白矾及其煅制品的鉴定。史昆波等以乙醇、三氯甲烷为提取溶剂提取中药材女贞子，采用X射线衍射Fourier谱鉴定法，对四个中药材女贞子的乙醇、三氯甲烷提取物实验分析比较，获得中药材女贞子的标准X射线衍射Fourier图谱及特征标记峰值，用于中药材女贞子的分析。石俊英研究了山东道地药材金银花HPLC 指纹图谱测定方法，建立山东金银花药材HPLC标准指纹图谱，并以绿原酸为对照，采用Venusil XBP2C18(5m，4.6mm250mm) 色谱柱，乙腈和0.4%磷酸为流动相梯度洗脱；检测波长：238nm；柱温：30；流速：1ml/min。结果获得19个共有指纹峰；同时标定了绿原酸、木犀草苷、芦丁、槲皮素、咖啡酸的位置。该方法准确、重复性好，建立的指纹图谱检测标准，能更好地控制山东道地药材金银花的内在质量，可以作为山东金银花质量评价和品种鉴别的重要依据之一。2中药指纹图谱用于中药炮制方法的研究张振凌等对不同方法炮制的酒萸肉饮片建立高效液相指纹图谱，并对其进行分析和比较发现，山茱萸常压酒蒸品和加压酒蒸品的共有峰和特征峰完全相同，高效液相指纹图谱的保留时间和峰面积差异均不显著，说明二者化学成分基本一致，常压酒蒸炮制需要的时间比较长，而加压酒制炮制工艺明显缩短时间。狄留庆等通过杜仲盐制前后松脂醇二葡萄糖苷的含量、醇溶性浸出物以及指纹图谱的变化进行比较研究发现杜仲盐制后松脂醇二葡萄糖苷的含量均有不同程度下降，醇溶性浸出物因产地不同而呈现不同变化趋势，杜仲指纹图谱共标出指纹峰11个，盐杜仲则标示出8个。显示杜仲经盐制后松脂醇二葡萄糖苷的含量下降，醇溶性浸出物也发生改变，杜仲盐制后HPLC色谱指纹图谱指纹峰减少，且大部分成分含量下降。杨云等对黄芩的酒炙工艺及其指纹图谱进行了研究，结果表明，来自不同产地的同一规格的炮制品指纹图谱主要峰群的整体图貌具有较高的相似性，用相关系数法、夹角余弦法进行的相似度计算，均0.98，说明已经确定的酒黄芩工艺稳定性良好，饮片质量一致。杨云等采用正交试验对黄芩炭炮制工艺进行了研究，确立了具体工艺参数，并采用高效液相色谱法建立了黄芩炭指纹图谱分析方法。结果表明，来自不同产地的同一规格的炮制品指纹图谱主要峰群的整体图貌具有较高相似性，用相关系数法、夹角余弦法进行的相似度计算，均0.99，说明已经确定的黄芩炭工艺稳定性良好，饮片质量一致。3中药指纹图谱用于药材采收季节的研究 中药材一般都有固定的采收时间，如根类、根茎类药材一般在秋天或春天挖采，花类药材一般在花蕾期采集，果实、种子类药材在果实成熟或即将成熟期采集，木类或皮类药材全年都可以采集。一般来说，采收时间固定(12月)的中药材，其指纹图谱的变化不明显，采集时间跨度较大的中药材，其指纹图谱往往有较大的差别。因此，对采集时间跨度较大的中药材 ，应考察不同采集时间的指纹图谱，分析采集时间对图谱的影响。郑晓珂等采用反相高效液相色谱法，运用相似度评价法和主成分分析法对各样品指纹图谱进行化学模式识别研究后，发现连翘成分随采收月份不同而各异，不同生长期采集的连翘中成分积累具有一定规律，该方法对连翘质量控制以及规范化种植提供了理论基础。4中药指纹图谱用于中药制剂及提取工艺的研究(1)中药指纹图谱用于中药制剂及提取工艺的研究 孔铭等采用HPLC色谱指纹图谱方法，比较月月舒免煎配方颗粒和月月舒煎剂两者指纹图谱的差别，并通过相似度软件分析两者的相似性。结果，月月舒合煎液和混合免煎配方颗粒指纹图谱的相关系数为0.829。表明月月舒合煎液同其分煎制成的免煎配方颗粒中的主要化学成分组成基本相同，其共有成分比例相近。欧英富等以乙醇提取溶剂采用回流提取法，用高效液相色谱(HLPC)法测定川芎中的阿魏酸，方法灵敏度高，操作简单。陆臻等选用明胶醇沉法对丹参注射液的制备工艺进行改进，采用高效液相色谱法对多批样品进行考察，建立指纹图谱，结果表明明胶醇沉法的制备工艺稳定可控。王春梅等研究了茵陈蒿汤中茵陈药材的最佳提取工艺条件，建立了茵陈的HPLC指纹图谱方法。该实验采用均匀设计法，以溶剂浓度、溶剂用量、提取时间、提取次数4个因素，每个因素9个水平进行提取工艺试验，并采用HPLC指纹图谱技术对各工艺条件下得到的提取物进行分析，最后以指纹图谱相似度与茵陈的提取效率为评价指标确定了茵陈的最佳提取工艺条件为 25倍量，11.14%的乙醇，每次提取90min，提取3次，结果得到的指纹图谱相似度为0.967，得率为22.2%。另外，作为一种较为成熟的技术，中药指纹图谱还用于药效物质成分鉴定和中药药效活性测定。周欣等采用水蒸气蒸馏法提取温莪术挥发油，用GC-MS联用技术对其进行指纹图谱测定，通过HPMSD化学工作站检索 Nist98标准质谱图库和WI LEY质谱图库，并结合有关文献谱图解析鉴定了20个共有峰；同时还采用冰片和莪术醇的对照品进行对照。从温莪术挥发油的质谱分析结果，鉴定出莪术油中具有抗肿瘤作用的活性成分2 榄香烯 (2 elemene) ，以及莪术烯、吉马酮、新莪术二酮 ( neocurdione)。所建立的 GC-MS研究温莪术挥发油指纹图谱的方法具有良好的精密度、重现和稳定性。七、各种不同的分析方法在中药指纹图谱中的应用1高效液相指纹图谱的应用HPLC指纹图谱是现在应用最多的一类方法，具有分离效能高、分析速度快等优点。如运用二极管阵列检测器可得到三维图谱，因而适用于成分比较复杂、紫外光区有吸收的药物分析，尤其对成分差别较细微的单味药材及成分较为复杂的复方制剂，其分离与鉴定能力大大优于相同分离原理的TLC。任爱农等研究红花输液在加热制备前后成分的整体变化，给药品的安全性评价提供参考依据。以羟基红花黄色素A为参照物，应用HPLC指纹图谱检测方法，对红花输液从药材、中间体到成品的全制备过程进行跟踪检测，其检测点温度分别设置为室温、100、115，观察不同温度下各样品指纹图谱中特征峰的出现和消失；峰面积减少和增大的变化。结果：温度升至100时，保留时间在7、26、27、44min时新的峰出现，8、36 min原有的峰消失，当温度继续升至115时，7、10min的峰又消失；保留时间在3132、44min时的峰随着温度的升高峰面积加大，37min时的峰(HSYA)随着温度升高峰面积减少。结论：随着温度的升高，红花输液中有新的化合物产生，但随着温度的继续升高，新的化合物又遭到破坏。 罗文等对决明子药材进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)指纹图谱分析，采用色谱柱为SunfireTM C18柱( 4.6mm150 mm，5m)，乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱，检测波长为280nm，流速为0.8mL/min，分析时间为120min，分析了10批决明子药材的HPLC指纹图谱。在选定的色谱条件下，通过相似度分析确定27个色谱峰构成决明子药材指纹图谱的特征峰。采用RP-HPLC方法建立的指纹图谱具有稳定、重复性好的特点，不但可用于决明子药材质量控制，还可作为决明子有效物质基础研究的有效手段。孙宁，秦培勇等研究乳块消片的高效液相指纹图谱，为科学评价及有效控制乳块消片的质量提供了有效可靠的方法。他们利用高效液相色谱法测定了10批乳块消片样品，色谱条件为：Kromasil C18色谱柱(250 mm 416mm，5Lm)；流动相：0.1% 醋酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱；体积流量：1ml/min；检测波长：280 nm；柱温：25；进样量：20L。结果显示，精密度、重现性和稳定性试验中各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，所得的色谱图各色谱峰分离较好，基线平整，符合指纹图谱有关规定。乳块消片的指纹图特征性及专属性强， 可作为全面控制乳块消片质量的依据。 冷静等建立了三七三醇皂苷(PTS)及其制剂三七通舒肠溶微丸胶囊的HPLC指纹图谱，同时对其进行LC-MS测定，以满足欧盟药品注册的药物质量控制研究技术要求。采用梯度洗脱法，流动相为水-乙腈，检测波长为203 nm，流速为1.0mg/ml，对多批PTS及其制剂进行HPLC测定和方法学考察，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版对测定结果进行相似度评价。采用对照品法和LC-MS法对原料药指纹图谱中的主要色谱峰进行了成分确证。所建立的LC-MS 指纹图谱条件能分离PTS的各组分，具有较好的精密度、重复性和稳定性。采用LC-MS指纹图谱能充分展示PTS及其制剂的物质组成，控制产品质量。2薄层色谱指纹图谱的应用TLC具有快速、经济、可靠、操作简单、适用范围广、重现性好等优点，为国内外学者最快接受和广为使用。用固定波长对薄层各斑点作薄层扫描的扫描图谱比目测的层析图谱更为客观准确，因而具有更好的指纹鉴别意义。屈爱桃，孙超等为苍术药材的鉴别及考察商品苍术药材的质量和稳定性提供新的方法，采用TLC法，建立苍术药材薄层色谱指纹图谱，指纹图谱由365nm及435nm检测波长下的6个共有特征峰构成，得到苍术药材的薄层色谱指纹图谱，所建立的方法具有简便，专属，稳定，直观，可重复的特点，可用于苍术药材的鉴别和质量的评价。崔淑芬，蒋轶伦研究甘草药材的薄层扫描指纹图谱(TLCS-FP)，为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。方法为采用1%(w)氢氧化钠浸渍硅胶GF254预制板(Merck)，醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(VVVV15112)为展开剂，254 nm 紫外吸收扫描。结果14批甘草药材样品得到的TLCS指纹图谱有6个共有峰，聚类分析结果正品甘草药材有较好的相似度；三维图谱可对不同产地的甘草药材质量进行直观比较，因而该TLCS-FP可用于甘草的真伪鉴别和质量评价。许重远初步构建复方茵黄解毒汤乙酸乙酯有效部位的指纹图谱，为复方茵黄解毒汤建立更高的质量标准打下基础。采用的方法是：以苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(511.55滴 )为展开剂，用薄层色谱法对上述有效部位进行展开，运用岛津CS9000薄层扫描仪，选择s= 275nm，R=365nm双波长扫描与=435nm单波长扫描。结果表明：该部位薄层色谱峰得到较好分离，获得了较理想的薄层色谱指纹图谱，并确定了其中小檗碱、咖啡酸、阿魏酸和大黄酸峰的归属；该方法简便、快速、精密度较高、重现性较好，可用于该复方中药制剂的质量控制。3气相色谱指纹图谱的应用目前，气相色谱是发展较为完善的色谱技术，具有高效、高灵敏度、样品用量少和分析速度快等优点并且得到了广泛的应用。由于毛细管柱分离效能好，结合多种高灵敏度的检测手段，在中药分析领域的应用越来越广。近几年来，除了在传统的挥发油、脂肪油等方面的分析测定不断发展与普及外，在中药有效成分的研究、药材的鉴定、资源的开发利用，特别是与药效研究相结合的指纹图谱研究得到了深入开展。阮健等建立当归挥发油指纹图谱的测定分析方法，为当归挥发油的质量控制提供参考。采用水蒸气蒸馏法提取当归挥发油，用GC对其进行指纹图谱测定，并采用中药指纹图谱计算软件进行计算，确定当归挥发油的共有指纹峰。结果精密度、重现性、稳定性试验中共有峰相对峰面积、相对保留时间的RSD 均小于3%。该方法准确可靠，重复性好，可用于当归挥发油的质量控制。单臻等采用GC色谱法建立肾宝片中挥发油的指纹图谱，探讨气相色谱-质谱联用(GC-MS) 技术在中药复方制剂挥发油指纹图谱中应用的可行性。采用GC-MS 对复方肾宝片中挥发油进行鉴别。结果挥发油GC 指纹图谱共检出12 个特征峰，峰面积之和大于总峰面积的90% ，其精密度、稳定性、重复性均符合中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行) 中有关规定。该方法可作为控制肾宝片挥发油内在质量标准。李晓波等建立野菊花注射液GC指纹图谱。方法使用DB217弹性石英毛细管柱(30m0125mm，0125m)。柱温：初温80保持5min，以5/min升至100保持10min，5/min升至170保持5min，10/min升至250保持3min；载气：高纯氮气，流量：110mL/min；分流比101；氢气：40mL/min；空气：400mL/min ；检测器：FID；检测器温度：280；气化室温度：280；进样量：1L。建立了野菊花注射液的对照指纹图谱并确定了22个共有峰，各批注射液与对照指纹图谱相似度均在0.95以上；该方法简便、准确、重现性好，为野菊花注射液的质量控制提供了依据。王斌等应用GC色谱法建立了鱼金注射剂(鱼腥草、金银花)的指纹图谱，并对相似度计算过程中某些问题进行了探讨。方法：使用SGE 30QC3石英毛细管柱(30m0.32m0.5m)；柱温：初温100，以2/min升至150，5/min升至170保持40min；载气：高纯氮气，流量：1.0mL/min；尾吹气：氮气，40mL/min，分流比110；氢气，40mL/min；空气，400mL/min；检测器：FID；检测器温度：200；气化室温度：200。结果测得，注射剂标准GC指纹由17 个特征峰组成，并对不同批注射剂进行了相似度比较，相关系数的RSD小于2%，注射剂各成分得到了很好的分离。张英以不同产地的23个广藿香样本作为研究对象，采用GC-MS方法，建立了药材的GC-MS指纹图谱，明确了广藿香的分子特征和化学特征，从而为鉴别广藿香的真伪以及道地性判定提供可靠的依据，并为广藿香的种质评价体系提供合理的技术平台和科学依据。4毛细管电泳指纹图谱的应用毛细管电泳的分离模式包括:毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱(MECC)、环糊精电动毛细管色谱(CDECC)、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦电泳(CIEF)、毛细管等速电泳(CITP)及非水毛细管电泳等。CZE适于分离小分子的有机、无机阴阳离子；MECC适于分离小分子的有机中性分子；CDECC适于分离异构体；CGE、CITP与CIEF适于分离水溶性高分子(如蛋白质、多肽、多糖等)；NACE则适于分离非水溶性小分子的化合物。中药成分，尤其是中药制剂的成分极其复杂，水溶性的极性成分占很大比例。这从常用中药方剂为汤剂，现代中药制剂注射剂近百种，以及中药成分的研究多采用水醇提取法等可得到印证。毛细管电泳非常适合水溶性或醇溶性成分的分离分析，是进行中药质量控制的绿色分析方法。其中毛细管区带电泳(CZE )及毛细管凝胶电泳(CGE)的分析对象为可解离的物质或带电荷的物质，适用于分离中药中的生物碱、黄酮及其苷、香豆素类、有机酸类、氨基酸类、核酸类、多肽类及蛋白质类等化合物。采用胶束电动毛细管色谱(MECC)除了能分析上述物质外，还能分析中性分子，因此它适用于各类物质的分析。以冬虫夏草为例：冬虫夏草是滋补强壮的名贵中药材，价格昂贵，自然资源接近枯竭，因而其人工培育品、代用品及伪品充斥市场，鉴定冬虫夏草的真伪、优劣成为当务之急。孙毓庆等用毛细管电泳分析冬虫夏草的水提取液获44个峰，而蛹虫草、人工冬虫夏草、人工蛹虫草、亚香棒草等伪品及次品的CE图谱与冬虫夏草的CE图谱有着非常明显的区别，很容易用CE加以鉴别。而冬虫夏草的HPLC图谱，只有十几个色谱峰，因而较难鉴别。他们还同时进行了冬虫夏草主要成分的定量分析，精密度与准确度均符合要求。10个产地的冬虫夏草的CE指纹图谱的测定结果表明，CE指纹图谱完全可用于冬虫夏草的鉴别与质量评价。孙国祥等采用高效毛细管电泳法，紫外检测波长228 nm，电压12. 5 kV，以硼酸(100 mmol/L)：硼砂(50 mmol/L)1110(调pH 11)为背景电解质进行指纹图谱研究。建立了大青叶药材的电泳指纹图谱(CEFP)。以胞苷峰为参照物峰，确定了18个共有峰，测定了10个产地大青叶的CEFP与共有模式间具有良好的相似性，用色谱指纹图谱指数对其进行评价。所建立的CEFP具有较好的重现性，可用于大青叶药材的质量控制。阎正建立了长白山人参的高效毛细管电泳(HPCE)指纹图谱。研究了不同的预处理方法、检测波长、分离电压、缓冲体系对人参指纹图谱的影响，并对原产地长白山人参和人工种植人参的指纹图谱进行了比较。采用毛细管区带电泳法测定指纹图谱，电泳条件：75m i.d.未涂层石英毛细管(有效长度65cm)，以20mmol/L的硼砂缓冲体系做背景电解质，分离电压18 kV，检测波长243 nm，气压进样3 s，进样压力8kPa，温度为室温。郭涛对心舒口服液的质量控制方法进行研究，采用高效毛细管电泳法建立以10批当归道地药材，10批川芎道地药材，10批红花道地药材，10批心舒口服液为样品的指纹图谱，比较研究制剂与药材指纹图谱之间的相关性，并与单味药材水煎液、各药材阴性对照液的指纹图谱进行比较，通过比较在线紫外光谱和迁移时间的方法，对口服液与各药材的水煎液、阴性对照液的指纹图谱中各指纹峰进行一一归属。分别建立标准指纹图谱，初步确定样品制剂与原料药材指纹图谱之间的相关性，最终建立复方中药制剂的质量控制方法。在心舒口服液指纹谱中，27个指纹峰中有14个指纹峰来自当归，10个指纹峰来自川芎(其中7个指纹峰是当归与川芎所共有的)，9个指纹峰来自红花。 由此可见，毛细管电泳能囊括中药所有类型复杂成分的分析，而且其指纹图谱的特征性远远高于其他色谱法。可以预见，CE在中药分析中的应用会越来越广泛，而中药毛细管电泳指纹图谱将是极有发展前途的中药质量控制方法。 5红外及近红外指纹图谱的应用FTIR光谱是一种不消耗毒性化学试剂，不破坏样品的绿色分析技术，具有快速、简便、准确等优点，在中药质量控制中可应用于药材产地判定、有效成分定性定量、假药鉴定，可以对样品进行快速、无损的检测，从分子水平宏观分析谱图特征峰变化规律，其结果可以用整体的直观的红外光谱图取代传统的经验标准。傅里叶变换红外光谱方法通过测量干涉图和对干涉图进行傅里叶积分变换来测定和研究光谱图，具有比经典的红外光谱法高得多的信噪比和分辨率。黄昊，孙素琴等首次采用傅里叶变换红外光谱法对五加科、桔梗科、木兰科、樟科、豆科、等科目中的典型药用植物进行了系统研究，比较了各科内植物的异同，并且讨论了相同植物不同药用部位、不同采药时间对其红外谱图的影响。结合药典中关于药物主体有效成分的记载，分析了各药用植物谱图中主要成分的特征基团，对主要吸收峰进行了指认。在传统形态比较分类方法的基础上， 可以成为一种快速、可靠、客观、有效的化学分类学的补充方法。彭勇用傅里叶变换红外光谱法(FTIR)无损快速鉴别了国产10种枸杞。结果表明：按其形态学分类的7种枸杞和3个变种枸杞与红外指纹图谱有一定的相关性，也有一些差异。这10种枸杞的红外光谱各自均有自己的特征吸收，可方便地给以鉴别和区分。同时还进一步表明了枸杞中的化学组分之间的差异，为枸杞品种优良的宏观质控提供了一个快速、直观、方便、可行的方法。田进国对大蜜丸剂采用统一的提取方法，对每一个样品都依次用正己烷、乙醚和丁酮提取并测试其提取物的红外指纹图谱。结果：25批同仁乌鸡白凤丸与31批消栓再造丸的样品分别具有独特而稳定的红外指纹图谱。结论：经过数据平均后的同仁乌鸡白凤丸与消栓再造丸的红外指纹图谱可以作为其质量控制和真伪鉴别的根据。李湘南利用傅立叶变换红外分析仪，以复方板蓝根颗粒和六味地黄丸为例，分别测试两种制剂与各自组方中缺不同药味制剂的红外光谱。两种复方中药与各自缺方制剂的无水乙醇提取物的红外图谱峰强和峰位存在差异，但是光靠人工比较难以得出正确结论，通过相似度计算可以得到比较客观的结果，说明傅立叶变换红外图谱定量分析法可用于复方中药的鉴定。近红外是人们最早发现的非可见光区域，由在1800年所观察到，距今己有200多年的历史。按美国试验与材料学会定义，波长范围780一2526nm的介于可见光和中红外之间的光谱区域，称为近红外区。近红外吸收是分子振动光谱的倍频或合频， 谱带弥散，强度比中红外吸收弱十倍至千倍，所以在很长一段时间内， 近红外光谱技术在理论上和实际应用上一直都没有得到足够的重视。60年代中期，随着中红外光谱技术的发展及其在化合物结构表征中所起的巨大作用，加之近红外光谱技术自身的灵敏度低、抗干扰性差等缺点，该技术在分析测试中的应用更被人们淡漠，以至于被称为光谱技术中的沉睡者。进入80年代后期，随着计算机技术的发展，化学计量学方法的应用以及过去中红外光谱技术积累的经验，近红外光谱分析技术得到迅速推广，成为一门独立的分析技术。我国对近红外光谱分析技术的研究起步较晚，但1995年以来己受到多方面的关注，并在仪器的研制、软件开发、基础研究和应用等方面取得了可喜的成绩。近年，近红外光谱分析法NIRS结合模式识别技术用于鉴别不同产地的药材得到越来越多的应用。孙丽英等等建立用近红外漫反射光谱鉴别不同产地黄柏药材的新方法，采集不同产地的黄柏药材及其伪品的近红外漫反射光谱，用模式识别方法进行聚类分析，建立判别模型并用三重交叉验证的方法对模型稳定性进行验证。黄柏样品与伪品能较好地区分开，建立模型后对已知训练集样本的分类精度高达100%，对未知样本的预测精度达到100%，该模型具有很好的预测性能，这说明了所建方法性能优良，能够适用于黄柏药材的不同种植产地分类鉴别。近红外光谱法简便、快速、不破坏样品，结合模式识别方法能够准确鉴别正品、伪品以及不同产地的黄柏药材。史春香等将不同产地黄芪粉末采集光谱，建立图谱库，同时结合模式识别的SIMA法进行模式识别方法学研究，取得了满意的分类结果，为中药材的道地性质量鉴别研究提供了新的研究思路，避免个人主观因素对中药材质量定性判别的影响。刘木清等使用聚类算法鉴别药材的油状提取物成分，结果显示8个样品的聚类性质与其实际特性相符良好，聚类分析结果合理。 用NIRS直接测定药材，通过适当校正样本建立起数学模型，应用优化后的数学模型和未知样品的近红外光谱，即可快速确定多组分未知样品的含量，适用于中药的定量分析。郭晔等采集蛇床子的CO2超临界流体萃取物的短波近红外漫反射光谱，结合偏最小二乘法快速测定蛇床子素和欧前胡素双组分中药的有效成分。王天志等使用偏最小二乘法建立校正模型，测定不同来源的黄柏中小檗碱含量，快速简便。王东等利用NIRS直接测定黄芩药材中黄芩苷的含量，与真实值之间的相关系数为0.9833，回收率符合要求。模型建好后，测定含量过程只需几秒钟，准确度高，可用于大批黄芩药材及其在线生产过程中的含量测定。6DNA指纹图谱的应用DNA指纹图谱是1985年英国科学家Jeffreys命名的，是基于生物物种或个体的DNA序列特性，利用分子生物学技术将这种DNA序列特异性通过特异的DNA条带图谱显示出来。DNA指纹图谱技术比传统的四大鉴别方法更为准确、客观，适用范围更广，非常适合于近缘种、易混淆品种、珍稀品种、动物药材、破碎药材、陈旧药材、腐烂药材及样品量极为有限的植物模式标本、中药出土标本、古化石标本等珍贵样品的鉴定。它不仅能区分相近物种(同科、同属不同种)，而且可以检测外型极为相似的同种中不同变种、变型、品系、乃至个体之间的DNA的细微变异。这一技术近年来正越来越广泛地被应用于中药材鉴别，道地药材的鉴定以及动、植物中药种质资源和遗传育种的研究中，并且取得了令人瞩目的成果。目前常用的DNA指纹图谱技术主要有RFLP (限制性内切酶片段长度多态性)、RAPD(随机扩增多态性DNA)、AP-PCR (任意引物PCR技术)、DNA测序法、AFLP (扩增片断长度多态性)、ISSR (简单重复序列间区)、SCAR (序列特异扩增)等。 RFLP分析技术要求新鲜的材料，不适用于干燥中药材的鉴别。日本千叶大学山崎真已等采用RFLP方法分析羽扇豆属 (L. upinus)5种药用植物白羽扇豆 (L. albus) 、黄羽扇豆(L. luteus)、多叶羽扇豆(L. polyphy llus)、埃及羽扇豆(L. termis)、毛羽扇豆(L. hirsutus)的亲缘关系及与其所含双稠哌啶类生物碱的相关性，结果表明RFLP可以区别这些羽扇豆属药用植物。严奉坤建立一种适于RAPD分析的快速提取枸杞叶片基因组DNA的方法，并利用RAPD技术研究枸杞属植物基因组DNA指纹图谱。采用改进的CTAB法提取枸杞冷藏幼叶的基因组DNA，利用RAPD技术对其进行指纹图谱分析。改进的CTAB法提取的10份枸杞材料基因组 DNA均适于RAPD分析；可提供清晰的RAPD指纹图谱，利用筛选出的2个随机引物对供试材料DNA进行随机扩增，共得到56条带，其中多态性条带44条，多态性百分率为78.6%。表明改进的CTAB法提取的枸杞基因组DNA不需经氯化铯梯度离心或柱层析纯化，可以直接用于 RAPD分析；说明RAPD对枸杞属植物进行指纹图谱分析是可行的。王志安对10份野生及栽培白术样品，采用EcoR I/MseI双酶切和银染技术，以获得指纹图谱。结果：（1）2倍CTAB法提取的白术基因组DNA质量最好；(2)从40对AFLP引物中筛选到了16对能扩增出较强多态性的引物组合，共获得了3003条多态性条带，并根据多态位点可将10个白术种质聚类为四种类型。所建立的白术种质 AFLP分析体系，可为种质保存和育种提供依据。汪小龙用细胞色素B基因PCR-RFLP方法对阿胶原料进行鉴定。提取马、牛、驴3种动物干皮DNA，PCR 扩增细胞色素B基因保守区域的359bp片段，用限制性内切酶Hinf和Hae酶切，采用琼脂糖凝胶电泳获得了DNA指纹图谱，根据获得的 DNA指纹图谱判定样品所属物种。该方法不仅简便，还可以100%准确鉴定阿胶原料皮样所属物种来源，适合作为常规技术应用于阿胶原料鉴定。Mizukami比较分析了当归 Angelica acutiloba ( Sieb . et Zucc . ) Kitag、三岛柴胡 B upleurum falcatum acut . sin . non L.和珊瑚菜 Glehnia littoralis Fr . Schmidt exMiq .的 5S rRNA基因的间隔区的碱基序列，针对该DNA片断的序列差异，选用限制性内切酶 Hind 消化 PCR产物，所获得的图谱可鉴别此3种药材。八、色谱指纹图谱与化学信息学1指纹图谱信号分析原理中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的分析方法和鉴定手段，表达的是中药的整体化学状况而不只是单个药理活性化合物的含量，对它们的分析与传统的只对某一个化学组分的含量分析有本质上的区别。如果采用数学语言，传统的、只针对某个化合物进行的含量分析是基于标量数据的分析，而中药指纹图谱的分析至少是对矢量数据的分析。在传统的组分含量测定中，常用的化学量测量为吸光度（紫外光谱）、峰面积（色谱）等，而常用的化学表征为浓度，如摩尔浓度、质量百分比浓度等，虽然它们不尽相同，但都是用一个数字来表示所需量测或表征的量，这样的量在数学中称为标量。如果在量测时采用标量来作为标准，一般只需直接比较它们的大小即可。所以，在传统的含量测定标准中，给出一个阈值或一个可以接受的范围即可。在现代化学量测中，尤其是在一些化合物或一些复杂样本的结构表征的分析中，一般都是有某个“谱”来表示，比如一个纯物质的紫外可见光谱、色谱、质谱或红外光谱等。如果将这些谱数量化（实际上这些由现代波谱或色谱分析仪器测得的谱本身都是以二进制形式保存于计算机之内），我们就可以得到一组数据，这样的一组数据就可以称为一个矢量，它可以在数学上表示为：at=a1，a2，an从以上讨论可知，从化学量测中抽象出来的矢量代表的实际是一组数，是表达整个谱的全息信息。因矢量代表的实际是由一组数来表示，所以不同矢量之间的关系不像标量之间的关系那样简单，首先，在不同矢量之间不能简单地像标量那样进行大小的比较，另外，由于一一对应相等，如果有一个元素不相等，则说明这两个矢量不同。同时，由于矢量含有n个元素，可以认为是N维空间的一个点，所以它实际上是既有方向又有大小，这是矢量数据处理中最值得关注的问题。对于中药指纹图谱而言，我们最关注的是“鉴别真伪、评价原料药材、半成品和成品的质量均一性和稳定性”，所以，矢量之间的相似程度，即指纹图谱的形状（是否具有相同化合物及组分间对应的相对比例）相似与否就特别重要。在化学计量学中，一般常用的两个相似性度量为相关系数和相合系数（矢量之间的夹角余弦）。2中药指纹图谱的数据预处理中药指纹图谱数据预处理方法主要分为以下几类：(1)谱图峰面积的计算与基线校准 对于光谱指纹图谱来说，要做好空白试验以得到平稳的基线。对于色谱指纹图谱来说，要保证测试条件的的一致与信号处理的设置阈。一般色谱仪器的工作站都提供了分段线性的基线绘制方法和自动峰面积积分的程序。分析者要注意到自动积分检测色谱起、止区域，估计噪音并设定阈值和最小峰面积的初始值，同时自动积分也设定一个峰宽的临时值，将最小峰面积设为0，做一个尝试积分。尝试积分中若得不到满意结果，还可以调整参数重新尝试积分，该过程可以尝试多次。(2)谱图保留时间漂移的校准 由于中药指纹图谱所表征的活性化学组分大都为药用动植物的次生代谢物，它们又受种培育产地的气候与地理特征、采集时间等因素的影响而使其化学组分的浓度分布具有不同程度的波动性（模糊性），而且很多组分还缺少相应的标准对照品，同时由于实验时间、地点以及一些不可控实验因素的差异，往往也会在一定程度上导致保留时间的偏移，给中药色谱指纹图谱的识别与鉴定带来不便，如不作必要的仪器系统误差的校准，还可能导致错误的结论。对于中药色谱指纹图谱，可采用色谱流出时间的仪器系统漂移的局部最小二乘校正方法。具体步骤如下： 检验大组分色谱峰的纯度。 利用光谱相关色谱技术判断大组分纯物质在不同中药色谱指纹图谱中的相关组分。 结合目标物质所在的局部色谱峰簇的保留时间信息，进一步正确判断其准确的色谱位置。 对相关组分色谱保留时间进行局部最小二乘校正。(3)谱图的平滑处理 在分析过程中，有时由于仪器噪声的影响，在量测时出现色谱曲线具有很多毛刺。为提高谱图曲线的信噪比，通常可以采用采用降低噪声来提高信噪比。平滑就是一种常用的去噪以提高信噪比的方法。分析信号因为存在测量噪声常常呈现为凹凸不平的曲线，平滑就是要将凹凸不平的分析信号曲线变为平缓的光滑曲线，它在分析化学的信号预处理中得到了相当广泛的应用。常见的平滑方法包括最简单的窗口移动平均法、窗口移动多项式最小二乘拟合法以及傅立叶变换、小波变换平滑等。(4)模式识别前的数据预处理 数据预处理的目的是去除噪声，加强有用的信息。对于多变量数据的评价，并非每个样本的特征都要用到。由于使用的几种特征的类型可能有较大的差别，其绝对值大小有时会差几个数量级（如不同组分在浓度上的差别），因此数据的预处理在模式识别中是非常重要的。数据预处理的第一步是考察数据的完整性，因为经常会出现某个数据缺失的现象。缺失的数据不宜用0来代替，而用行或列的平均来替代，或者使用随机数来替代。为了消除数据量纲不同或分布范围过大造成的常数偏移量，可以对坐标原点做变换，一般的步骤是均值中心化，即利用下式从每个变量中减去该列的平均值:式中，i是行下标；k是列下标。样品的不同性质往往差别很大，这就意味着不同变量具有不同的绝对值和变量范围。这些差异可以通过比例调整进行消除，将它们按一定规则调整到相似的范围和方差。常用的比例调整的方法有：范围调整 正规标准化 式中，S为列向量的标准差。变换后使各列的均值为0，方差为1。在模式识别中应用最多的是正规标准化变换。各种变换方法都可以以样本或变量分别或同时进行，以适应不同研究目的的需要。对样本和变量同时进行的标准化，称为双重标准化。3指纹图谱相似度的计算指纹图谱相似性计算就是通过量化比较各张指纹图谱上互相对应谱峰异同，计算出各指纹图谱间的相似程度。它包括两个步骤：指纹图谱的数值化（谱峰测量参数如峰面积、峰高等）；计算指纹图谱间相似程度。指纹图谱相似