结核分枝杆菌传统药敏试验方法.ppt

传统的药敏实验SJKim TheUnion 药敏试验的目的 耐药监测 评估治疗方案 选择有效的标准方案病例管理 诊断耐药结核病 耐多药 广泛耐药结核病 为个体病例 耐多药 广泛耐药结核病 选择有效的方案 问题 可靠性 技术重复性 临床反应预测 周转时间 操作可行性及可持续性 成本 基于标本的药敏检测系统直接法直接涂片法 涂片阳性 优点 结果快 更好的反映耐药情况缺点 大多数药敏试验不理想 接种量不容易标化 可行性较差 间接法对结核分枝杆菌进行培养后进行药敏试验优点 更好的控制接种量缺点 结果延迟 以传统的生长检测为基础的药敏试验方法以传统生长检测为基础的方法WHO 1963 的标准方法绝对浓度法 Meissner 标化接种量 药物浓度梯度抗性比率法 Mitchison 克服培养基中药物浓度变化的缺点比例法 Canetti Grosset 临界浓度比例 更好的控制接种量 GCanetti JGrosset France SFroman USA PHauduroy Switzerland MLangerova LSula Czechoslovakia HTMahler WHO GMeissner Germany DAMitchison England 以快速培养生长检测为基础的药敏试验方法快培生长系统观察显微镜下的微小菌落 玻片培养 显微镜观察的药敏试验 MODS 代谢情况检测 CO2产生量 放射BACTEC460 色素变化MB Bact3D O2消耗 荧光产生MGIT960 TREK系统 ESP培养系列II 微盘 阿莫拉蓝试验 指示管 TEMA ATP产生 生物荧光试验噬菌体检测 FASTPlaque Bonxbox LRP 以检测基因突变为基础的快速药敏试验系统扩增目标区的DNA测序聚合酶链反应 单链构象多态性分析技术 探针杂交 反向探针线性杂交方法 Hain分枝杆菌药物抗性plus分子灯塔 信标 GeneXpert系统是一个将样品准备 定量扩增和荧光检集于一身并自动进行核酸检测分析的系统 LAMP Eiken 核酸环介导等温扩增技术高效液相色谱应用与扩增的DNA的突变检测 药敏试验的结果可靠性治疗结果的预测值 药敏试验的耐药标准试验可靠性 试验精确度 可重复性 药敏试验的校正获得最相关的临床耐药标准 可能的敏感株的敏感级别 在治疗反应变化方面测定敏感性水平 从未接受过治疗的患者 PS 与至少接受5 6个月治疗的患者 PR 的标本菌株的敏感性进行比较PS 100菌株 PR 50菌株 CanttiG etal BullWHO1969 41 21 43 可能敏感菌株 可能无耐药性菌株 在不同药物浓度下的抑菌分布 Minimalinhibitoryconcentrations MIC 最小抑菌浓度 Frequencyofstrains Clinicallysusceptiblestrains PS Breakpoint 1SD 3SD 不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布 Frequencyofstrains Minimalinhibitoryconcentrations MIC Breakpoint Technicalvariation inoculum media drugconcent Clinicallysusceptiblestrains PS Clinicallyresistantstrains PR 不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布 Frequencyofstrains Minimalinhibitoryconcentrations MIC PS PR 2mcg ml Breakpoint 13 1as R 75 8 11 1as S 可能敏感 可能耐药菌株对利福平的最小抑菌浓度的累积分布 此试验采用L J培养基用绝对浓度法 85 8 不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药菌株最低抑菌浓度的分布 Frequencyofstrains Minimalinhibitoryconcentrations MIC Breakpoint Inoculumvariation Clinicallysusceptiblestrains PS Clinicallyresistantstrains PR 可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星敏感性分析 采用L J培养基 Donotquotethisdata n 81 n 111 校正的乙胺丁醇的临界浓度 此试验采用改良罗氏培养基的绝对浓度法 42 50 可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床分离株对卡那霉素敏感性分析 InL JMedium In7H10Medium 67 67 抗结核药物的最低抑菌浓度比平均峰值 EMB ETH OFX CFX INH RMP KM CPM PAS SM Proportion WHO推荐药敏试验的临界浓度 2007 抗结核药物药敏试验程序复杂 必须在有质量保证的实验室才能实施2 试验操作危险大 操作只能在拥有好的设施及设备的实验室 BSL 3 进行 而且所有的实验室工作人员都要熟练的掌握每个程序 影响药敏试验结果的物理化学环境因素培养基中活动性 精确的药物浓度药粉 试剂效价 剂量 溶解 稀释 存储purityxactivefractionxH2OEMB 99 purity C10H24N2O2 2HCl 277 2 72 9 204 3 nowater 0 99x0 74x1 0 0 7326 1000mg 733mg 培养物的制备 1 灭菌过程中热失活 2 蛋白结合 3 拮抗剂 离子 4 pH值接种量 接种量 离散度 可代表性 组织物的可行性试验 浓缩过程中利福平的稳定性 抗结核药物的储存在密封的硅胶容器内储存 最好在真空下储存 药敏试验接种物的制备 Inoculate0 1mlvolumeofinoculumontoeachmedium 比例法 byMiddlebrook Cohn Dilute稀释1mg mlbacterialsuspensionto10 3 10 5mg mlbyserial10folddilution Plant接种0 1mlontoeachslopeofdrug freeorcontainingmedium制备培养基Observe观察thegrowthafter4weeksincubation ifthegrowthispoor againafter6weeks 观察4周生长情况 如果培养基质量较差应观察6周 Report报告theproportionofcoloniesgrownatthecriticalconcentrationofthedrug 在药物的临界浓度报告结果 DrugfreeIsoniazidEthambutolInoculummedia0 2mcg ml2 0mcg ml10 3 310 52690 resistant34 60 1InterpretationResistantSusceptible 药敏试验结果 1 1 Ifusenichromewire 0 7mmwire 3mmofinternaldiameter inoculateoneloopfulofbacterialsuspensionof10 2 orifusepipette inoculate0 1mlof10 3 ofbacterialsuspension2 Ifusenichromewire inoculateoneloopfulof10 4 bacterialsuspensionorifusepipette inoculate0 1mlof10 5 药敏试验结果 2 1 Ifusenichromewire 0 7mmwire 3mmofinternaldiameter inoculateoneloopfulofbacterialsuspensionof10 2 orifusepipette inoculate0 1mlof10 3 ofbacterialsuspension2 Ifusenichromewire inoculateoneloopfulof10 4 bacterialsuspensionorifusepipette inoculate0 1mlof10 5 药敏试验结果 3 1 Ifusenichromewire 0 7mmwire 3mmofinternaldiameter inoculateoneloopfulofbacterialsuspensionof10 2 orifusepipette inoculate0 1mlof10 3 ofbacterialsuspension2 Ifusenichromewire inoculateoneloopfulof10 4 bacterialsuspensionorifusepipette inoculate0 1mlof10 5 药敏试验的技术可靠性 外部质量评估 17个跨国参比实验室网络第14轮熟练度测试结果 数据来源于ArmandVanDeun2007年 蓝色数字表示实验室数量 51个国家 或地区 参比实验室利福平和异烟肼药敏试验结果的一致性 世界卫生组织第四期全球耐药报告 2008 二线抗结核药物耐药预测值 1Prevalencerates2ResultsofSLDSTproficiencytestsdoneoncein2004 coordinatedbyDr NuriaMartineCasabona participatedSRL 9 3Basedonsensitivity specificityof9roundsproficiencytestsofSRLs 1994 2002 利福平敏感性试验耐药预测值基于跨国参比实验室网络第14轮熟练度测试数据 来源于ArmandVanDeun Resistancepredictivevalues Resistanceprevalence 敏感性 99 6 特异