（洪钦辉）论文-糙皮侧耳培养

糙皮侧耳液体深层培养条件的优化洪钦辉，郭桂珊，黄雨杏（华南农业大学食品学院生物工程，广州 510642）摘要：对粤西地区的菌种资源进行野外采集，通过对菌种的鉴定和分离培养，选取能产生漆酶的糙皮侧耳进行液体深层发酵，并对发酵工艺进行优化。结果表明：糙皮侧耳液体培养的最佳培养基配方为：葡萄糖 1%，玉米粉 4%，酵母膏 0.7%，硝酸铵 0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO47H2O 0.05%；最佳培养条件为：培养基装量120 mL/bottle，摇床转速120r/min，pH5.4，温度25。在此培养条件下，糙皮侧耳生长较好且表现出较高的分泌漆酶的能力。关键词：糙皮侧耳；漆酶；液体培养；培养条件食用菌含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和碳水化合物，是营养丰富的天然食品，数据表明，食用菌的蛋白质含量分别比芦笋和卷心菜高2倍、比柑橘高4倍、比苹果高12倍；按干重计算，食用菌通常含有19%35%的蛋白质，高于其他大多数食物甚至包括牛奶。而且食用菌含有人类所必需的18种氨基酸，各种食用菌中赖氨酸的含量都很高。除了普通氨基酸和酰胺之外，食用菌还含有不常见的氨基酸和相关的氮化合物。食用菌中含有高比例的非饱和脂肪酸，也是其作为健康食品的重要因素之一。此外，食用菌还富含多种矿物质、维生素、游离氨基酸、多糖、多肽和生物碱等活性成分，因而食用菌还具有抗肿瘤、降血脂、抗病毒和免疫调节等多种药理作用。因此，开发和利用食用菌资源具有广阔的应用前景。糙皮侧耳因载培技术易掌握，产量高，我国近年来的栽培面积大幅度增长，其产量都居全国食用菌产量首位，但目前糙皮侧耳的生产主要是进行固体基质培养，存在生长周期长、菌龄不一致、规模化程度小的特点，而采用液体深层发酵可以使生产规模化、工厂化，并且具有菌龄整齐、生长周期短的优点。漆酶(Laccase)是很早就被认识的一类含Cu原子的多酚氧化酶，广泛存在于真菌中，它与木质素氧化物酶(Ligninperoxidase)和锰过氧化物酶(Manganeseperoxidase)都是参与木质素降解的关键酶。漆酶主要攻击木质素的苯酚结构单元，可直接与木质素底物相互作用，也可在中间氧化调节物质存在下，与广泛的底物作用。漆酶可用于纸浆漂白、污水去毒、从酒中除去酚类物质以及抗菌素和类固醇的改造等，因而具有重要的应用价值。本文就糙皮侧耳的培养条件对产漆酶的影响做初步研究和分析。1 材料和方法1.1 基础培养基1.1.1 固体培养基（PDA培养基）马铃薯20g，蔗糖1.5g，琼脂2g，水100mL，自然pH1.1.2 液体培养基蔗糖2g，玉米粉3g（煮汁），麦麸3g（煮汁）， 酵母粉0.3g， KH2PO4 0.1g， MgSO47H2O 0.05g，水100mL，pH6.01.2 培养方法1.2.1 菌种固体扩大培养将菌种从保存斜面接种到PDA培养基平板上，25恒温培养7d得到平板母种。1.2.2 摇瓶种子培养将固体母种分割成小块，每瓶接入四块稍带培养基的母种（如蚕豆大小），25 ，150 r/min振荡培养。 1.2.3摇瓶扩大培养将得到菌种以10%的接种量转接到各处理摇瓶中。通过单因素实验和正交实验确定最优化的培养基配方和培养条件。1.3 测定方法1.3.1 菌球直径的测定取1mL发酵液于培养皿中用水稀释10倍，随机取10个菌球在培养皿中排成一行，用游标卡尺测定总长度。（3次取平均）1.3.2 菌球数量的测定取1mL发酵液于培养皿中稀释10倍，于培养皿下垫置方格纸计数。（3次取平均）1.3.3 菌丝体生物量的测定生长良好、无污染的摇瓶培养物于4000r/min下离心15min，取沉淀物称鲜重即为菌丝体生物量。重复3次取平均值。1.3.4 漆酶的活性测定1酶液的制备：取发酵液，4000r/min离心15min，取上清液。 0.5mL3.36mmol/L临联甲苯胺+ 3.4mL0.1mol/LPH4.6醋酸盐缓冲液+0.1mL粗酶液。28恒温水浴保温30min，测定A600。以每分钟OD值增加0.01为一个酶活单位。1.3.5 蛋白质浓度的测定：紫外吸收法2取1mL粗酶液，用蒸馏水稀释25倍，摇匀比色，测A280、A260，以蒸馏水做空白样。蛋白质含量（mg/mL）=（1.45A280-0.74A260）251.4培养条件优化组合实验1.4.1 碳源单因素实验以酵母膏1%为氮源，KH2PO4 0.1%、MgSO47H2O 0.05%为无机盐，对葡萄糖、蔗糖、麦麸、玉米粉四种碳源2%进行单因素对比实验，选择两种对生长最好、产漆酶最多的做正交实验。其中麦麸、玉米粉煮沸30min，八层纱布过滤，取其滤液备用，下同。以玉米粉2%为碳源，KH2PO4 0.1%、MgSO47H2O 0.05%为无机盐，对酵母膏、黄豆粉、硫酸铵、硝酸铵四种氮源1%进行单因素对比实验，选择两种对生长最好、产漆酶最多的做正交实验。1.4.2 碳、氮源正交组合实验通过碳、氮源单因素实验确定葡萄糖、玉米粉、酵母膏、硝酸铵为碳、氮源，无机盐选用KH2PO4 0.1%、MgSO47H2O 0.05%，采用L9（34）正交表确定碳、氮源最佳浓度组合，具体因素水平见表1。表1 碳、氮源正交因素水平设计表水平因素葡萄糖玉米粉酵母膏硝酸铵11%2%0.30%0.10%22%3%0.50%0.30%33%4%0.70%0.50%1.4.3 培养条件正交组合实验培养基配方为：葡萄糖1%，玉米粉4%，酵母膏0.7%，硝酸铵0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO47H2O 0.05%。以250mL的三角瓶为培养瓶，采用L9（34）正交表确定最佳的培养基装液量、摇床转速和培养基pH值，具体水平因素见表2。表2 培养条件正交因素水平设计表水平因素培养基装量（mL/bottle）摇床转速（r/min）pH1801205.421001505.831201806.22 结果与讨论2.1 不同的碳源对糙皮侧耳生长及漆酶产生的影响碳源单因素试验结果见图1。从图1的直方图可以看到，蔗糖、麦麸培养出的菌体虽然产酶和蛋白质含量比较高，但其菌体生长很少，特别是菌球数量比起葡萄糖和玉米粉的培养结果少了许多。综合五项测定指标的结果，葡萄糖、玉米粉不仅对菌球的生长还是产漆酶的活性都相对比较高，所以，选择这两种原料作为培养基的碳源。图1 各种碳源对对糙皮侧耳生长及漆酶产生的影响2.2 不同的氮源对糙皮侧耳生长及漆酶产生的影响图2 各种氮源对糙皮侧耳生长及漆酶产生的影响 氮源单因素实验结果见图2。从图2可以看出，酵母膏、黄豆粉这两个有机氮源对菌体的生产的影响存在着很大的差异，无论是从菌体的生长量，还是产漆酶的活性，酵母膏培养的结构五项指标都比黄豆粉培养的结果高了很多，所以选择酵母膏作为培养基的有机氮源。从无机氮源硫酸铵和硝酸铵的培养结果看，这两种氮源的培养效果差不多，考虑到硝酸铵培养的菌体产漆酶活性稍比硫酸铵高，所以选择硝酸铵做为无机氮源。最终2.3 碳氮源正交组合实验结果根据上述的单因素实验结果，确定培养基的碳、氮源分别是葡萄糖、玉米粉、酵母膏、硝酸铵。以此设计四因素三水平的正交试验，结果如表3所示。表3 碳氮源正交试验结果序号因素菌球直径（）菌球数量（个）菌丝体生物量（g）漆酶活性（U/mL）蛋白质含量（mg/mL）葡萄糖玉米粉酵母膏硝酸铵111113.7254258.790.316672.097212222.8352753.7450.483333.963313333.2656259.4450.548335.633421233.0252756.450.691674.075522313.723507.320.366675.26623124.2752758.0650.306673.297731322.873506.830.446676.091832134.033758.1750.361673.458933213.4752005.3650.548337.04通过做正交直观分析，得出如表4的结果。表4 直观分析结果指标最佳培养配方因子影响大小确定培养基组分菌球直径A2B3C1D3BACDA1B3C3D3菌球数量A1B3C3D3CADB菌丝体生物量A1B3C1D3CDBA漆酶活性A2B1C2D3CDBA蛋白质含量A3B3C3D1CABD注：A葡萄糖 B玉米粉 C酵母膏 D硝酸铵通过对表4的分析，以菌丝体生物量和漆酶活性为主要指标，菌球直径、菌球数量、蛋白质含量为参考指标的综合考虑下，结合各指标的最佳培养配方，以及各影响因子的影响大小，确定碳氮源的含量如下：葡萄糖1%，玉米粉4%，酵母膏0.7%，硝酸铵0.5% 时，菌体相对较多，酶活性也相对较大。2.4 不同培养条件对糙皮侧耳生长及漆酶产生的影响培养条件正交的实验结果见表5，通过做正交直观分析，得出如表6的结果。表5 培养条件正交试验结果序号因素菌球直径（）菌球数量（个）菌丝体生物量（g）漆酶活性（U/mL）蛋白质含量（m g/mL）培养基装量（mL/bottle）摇床转速（r/min）pH11112.3447512.653.933.9421223.1350014.052.834.2931332.57567514.952.674.6542123.0760015.352.674.1452232.8752515.653.793.8962312.8880015.72.914.2573133.82570018.42.843.8283212.9977517.452.83.7093322.3387518.052.13.93表6 直观分析结果指标最佳培养条件因子影响大小最佳培养条件菌球直径A3B1C3BA3B1C1菌球数量A3B3C1AB菌丝体生物量A3B3C3ACB漆酶活性A1B1C1CBA蛋白质含量A1B3C2 、A1B3C3ABC注：A培养基装量 B摇床转速 CpH同样以菌丝体生物量和漆酶活性为主要指标，其他为参考指标，可得出适宜的培养条件为：培养基装液量120 mL/bottle，摇床转速120r/min，pH5.4。此时，该菌的生长状况最为理想，菌体较在其它培养条件下的多，酶活性也较高。3 结论通过对粤西地区的食用菌的调查，我们了解到该地区有大量的有高营养价值的食用菌，其中有血红栓菌、糙皮侧耳等，该地区的食用菌有很大的开发潜力。通过对糙皮侧耳的深层培养条件的优化，最终确定其培养条件有：葡萄糖1%，玉米粉4%，酵母膏0.7%，硝酸铵0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO47H2O 0.05%，培养基装液量120 mL/bottle，摇床转速120r/min，pH5.4，培养温度25。该条件下菌丝体生物量大，菌体产漆酶活性高，菌球直径大，菌球数量多，蛋白质含量较高。经过工业的放