分子实验14 蛋白质纯化.doc

蛋白质纯化一、亲和层析1、绪论亲和层析是基于待分离物质，如蛋白质、多肽、糖蛋白和核酸等生物分子，与固定化在载体上的配基分子之间的专一性相互作用的一种色谱学方法。通常是在载体（无机或有机介质）表面先键合一段间隔臂，再连接上配基。间隔臂的作用是减少待纯化蛋白质（或其他生物大分子）与其相适应配基结合时的空间位阻。这种固相化的配基将只能与其有生物特异亲和性的蛋白质分子相互作用而吸附，没有这种作用的其他生物分子不被吸附而流出层析柱，然后，改变流动相条件将吸附的蛋白质洗脱下来，于是达到分离纯化的目的。2、 材料AKTATM 层析仪，电脑，分部收集器缓冲液贮槽层析柱、HiTrap chelating HP 1ml和5ml偶联试剂，Ni2+洗柱缓冲液1M NaOH纯化缓冲液 Binding Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 5mM imidazole 6M guanidine hydrochloride, 1mM 2-mercaptoethanol pH8.0Washing Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20mM imidazole 6M urea 1mM 2-mercaptoethanol pH8.0Refolding Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20mM imidazole 1mM 2-mercaptoethanol pH8.0 Elution Buffer: 20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl,500mM imidazole1mM 2-mercaptoethanol pH8.0洗Ni缓冲液：20mM Sodium phosphate, 0.5M NaCl, 0.05M EDTA pH7.43、操作步骤（以纯化N-terminal (His)6-tagged recombinant protein produced in E. Coli为例1、 亲和层析柱连AKTATM层析仪2、 用5-10柱体积的去离子水走柱，去除保存在柱子中的20%的酒精3、 走0.1M NiSO4入柱，至层析柱变蓝4、 走10柱体积的去离子水平衡层析柱5、 用Binding Buffer平衡层析柱纯化：1、 将已准备好的样用AKTATM层析仪进柱2、 用10柱体积的Binding Buffer平衡柱子3、 走10柱体积的Washing Buffer4、 复性：走线性梯度，共30柱体积，Washing Buffer 0%Refolding Buffer 100%5、 用Elution Buffer 将目的蛋白洗脱下来，并收集样品层析柱的再生和保存：1、 走10柱体积的去离子水去除层析柱中的Buffer2、 走10柱体积的洗NiBuffer洗掉Ni离子3、 用10柱体积的去离子水平衡4、 走1M NaOH入层析柱，并浸泡2h，去除层析柱中沉积的蛋白和其它杂质5、 走10柱体积的去离子水和PH为7.0的缓冲液平衡层析柱，直到层析柱中性为止。6、 用20%的乙醇保存层析柱1、 讨论在亲和层析中常出现的一些问题以及解决方法1、 注意任何时都不得使层析柱流干或进气泡，并且不要超过树脂所能承受的压力。2、 避免偶联试剂，缓冲液和乙醇三者混合在一起，易产生沉淀，可用NaOH浸泡的方法去除。3、 一般5-10次纯化后才用NaOH彻底清洗层析柱。4、 所有上柱的样品和缓冲液都须过0.2uM滤膜，防止堵塞。二、凝胶过滤层析1、概述凝胶过滤层析是一项重要的蛋白质纯化技术，又称为大小排阻、凝胶排阻、分子筛或凝胶过滤层析。原理：凝胶过滤层析是再装填有多孔性材料的色谱柱中进行的，是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果。凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外。因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分子量蛋白质更早地被洗脱下来。最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小。中等大小的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，因此他们晚一些到达柱底，而小蛋白质可以进入所有填料得孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。2、材料1、 凝胶过滤缓冲液：根据纯化的样品选择2、 部分常见的凝胶过滤色谱填料3、 仪器凝胶过滤层析柱装柱配套用具或凝胶储槽缓冲液储槽AKTA电脑分部收集器3、步骤1如果凝胶过滤的介质是干粉，则需在凝胶过滤缓冲液中完全溶胀。切勿用磁力搅拌器搅拌。让凝胶颗粒自然降。对预溶胀的凝胶，先用大量缓冲液洗去防腐剂，重悬于等体积的凝胶缓冲液，倾入细颈过滤瓶中，在使用前进行脱气。2 装柱：装柱前取3/4体积的凝胶和1/4体积的缓冲液制成凝胶浆。先将缓冲液加入层析柱，当有缓冲液流出时关闭柱的出口。沿柱子一侧或沿一根玻璃棒倾入凝胶浆，必须一次完成，否则柱床不均一。当凝胶装到柱底之后，打开柱底出口以加快装柱进程，随之加入更多的缓冲液。将层析柱与AKTA湘连接，用几倍柱床体积的缓冲液洗涤层析柱，以使其稳定和平衡。3 样品上柱及洗脱（1） 样品应高度浓缩（10-20mg/ml），体积应尽量小（适当的上养量为柱床体积的1%-5%）上样前样品需用0。22um的滤膜过滤。（2） 样品上柱：层析柱经平衡后，将平衡液流至柱床表面以下1-2mm时，关闭出口，用加样气将样品加至柱床表面，并打开出口，使样品渗入胶内。样品加完后，用小体积的洗脱液洗表面1-2次，再连接AKTA.（3） 洗脱：缓冲液流经层析柱进行洗脱，目的蛋白洗出时收集。（4） 层析柱的再生和保存：通常用稀的氢氧化钠或非离子型去垢剂清洗可去除大部分的结合物质。用20%酒精保存或在缓冲液中加入0。02%叠氮钠可防止微生物生长。4、在试验中应注意的问题1、 防止凝胶中有气泡。2、 蠕动泵控制层析柱的流速，使用泵的压力不要超过凝胶的耐受程度。3、 任何时候都不得使层析柱缓冲液流干，这样就不能进行正常层析分离了。三、离子交换层析1、引言离子交换层析的目的是利用蛋白质表面的荷电基因与带相反电荷的不溶性基质结合，更确切地说，先用蛋白质偶极离子置换基质官能团上的平衡离子如氯离子或钠离子，然后蛋白质本身又随着平衡离子比例的增加而被置换下来。这通常是通过增加洗脱液中的离子浓度来实现的，比如，用递增的盐浓度梯度进行洗脱。另一种方法是，也可以用pH梯度洗脱，使被吸咐的蛋白质表面的净电荷减少。在特定的缓冲液、pH和离子强度的初始条件下，可以控制待分离蛋白表面的净电荷与基质相互作用。离子交换剂分为两大类，即阳离子交换剂和阴离子交换剂。阳离子交换剂是在不溶性载体上结合有中性pH下向负电的官能团。这类树脂适用于分离等电点在中性以上的蛋白质。阴离子交换剂本身带碱性基因，在其pK以下荷正电，而阳离子交换剂则带酸性基因，在其pk以上荷负电。应根据被吸附的蛋白质的性质来选择弱的或强的离子交换剂。2、 材料AKTA层析仪层析柱分部收集器缓冲液Pka可控制pH值范围缓冲液用于阳离子交换树脂体系3.83.4-4.2乳酸缓冲液4.84.4-5.2乙酸缓冲液6.25.8-6.6MES6.66.2-7.0ADA7.26.8-7.6MOPS用于阴离子交换树脂体系6.05.6-6.4组氨酸缓冲液7.87.4-8.2三乙醇胺缓冲液8.17.7-8.5Tris8.88.4-9.2二乙醇胺缓冲液9.59.1-9.9乙醇胺缓冲液树脂：阴离子交换树指用于处理净电荷为负的蛋白质；阳离子交换树脂用于处理净电荷为正的蛋白质一些常用的离子交换树脂名称类型树脂基吸附容量mg/ml层析速度cm/min稳定pH范围DEAE Sepharose Fast Flow弱、阴离子X-连接琼脂3-11012.51-14DEAE Sepharose CL-6B弱、阴离子X-连接琼脂2-1701.72-14DEAE Sephace I弱、阴离子珠状纤维素10-1600.172-12DEAE Sephadex A-50弱、阴离子X-连接右旋糖苷2-1102-9DEAE Trisacryl M弱、阴离子合成高聚物80-9031-11DEAE Bio-Get A弱、阴离子X-连接琼脂450.32-9.5CM Sepharose Fast Flow弱、阴离子X-连接琼脂15-5012.52-14CM Sepharose CL-6B弱、阴离子X-连接琼脂10-12022-14CM Trisacryl M弱、阴离子合成高聚物90-10031-11Bio-Rex70弱、阴离子合成高聚物0.4-155-14CM Bio-Gel A弱、阴离子X-连接琼脂450.34.5-10CM Sephadex C-50弱、阴离子X-连接右旋糖苷7-1406-10Q Sepharose Fast Flow强、阴离子X-连接琼脂3-1206.7-11.72-12QAE Sephadex A-50强、阴离子X-连接右旋糖苷1.2-802-10SP Sepharose Fast Flow强、阴离子X-连接琼脂6012.53-14SP Sephadex C-50强、阴离子X-连接右旋糖苷8-1102-10SP Trisacryl M强、阴离子合成高聚物10061-113、 步骤1、 高子交换层析中溶液pH值的选择1）在九个EP管中各放入1ml阴性离子交换树脂（如DEAE sepharose CL-6B）2）用10ml 0.5mol/L, pH值为5.0的缓冲液润洗一号EP管后；加入10mmol/L NaCl的缓冲液平衡树脂，二号管以pH 值为5.5的缓冲液同法处理；以后各EP管所用缓冲液pH值依次增加0.5个单位。3）去掉多余缓冲液，保证各EP管中缓冲液高出树脂量为1ml。4）向各EP管中加入100ul蛋白质溶液。5）混匀EP管中物质，放置几分钟。6）检测上清液中是否存在目的蛋白。离子交换层析的最佳实验条件围绕蛋白质性质而制定，还要顾及到不要使溶液pH值与蛋白质等电点相差太远。选择条件时，正式洗脱后均须用浓度更大的NaCl溶液再次洗脱以判断洗脱效果，蛋白质活性必须进行测定。对一些与阴性离子交换树脂无反应的特殊蛋白质，可用阳性离子交换树脂，重复试验。2、 洗脱条件的选择自适的反荷离子可以大大简化蛋白质的纯化，缓冲体系选定后，就该进行反荷离子的选择试验了。以下是一个实例：1） 用含50mmol/L Tris缓冲液（pH值为7.9），10mmol/L NaCl的溶液平衡10m(DEAE Sepharose CL-6B离子交换树脂)2） 在九个EP管中各加入500ul离子交换树脂3） 用含0.1mol/L NaCl, 50mmol/L Tris缓冲液（pH值为7.9）的溶液10ml润洗二号树脂十次，使树脂与0.1mol/L的NaCl平衡。4） 同法处理三至九号树脂，但润洗液中NaCl浓度由三至九号依次为：0.2mol/L; 0.3mol/L, 0.4mol/L, 0.5mol/L, 0.6mol/L,0.8mol/L, 1.0mol/L5） 去掉多余溶液，保证各管中溶液高出树脂量为500ul6） 向各试管中加入100ul蛋白质溶液7） 混匀EP管中物质，放置几分钟8） 检测上清液中是否存在目的蛋白随着溶液中NaCl浓度的增加，上清液中将会出现蛋白质。若溶液中NaCl浓度在0.1mol/L这样低的水平时上清液就含有蛋白质，就需要改变pH值以提高蛋白质与树脂的结合力了。若目的蛋白在NaCl浓度仅低于合适的洗脱液的洗柱溶液中仍吸附在树脂上，则此溶液可用于洗柱以除去与树脂结合能力较弱的杂蛋白。例如当目的蛋白质在0.5mol/L NaCl溶液中被洗脱时，0.3mol/L的NaCl溶液很可能适于洗柱。3、层析柱的填装1） 层析柱的填装（1） 在烧杯中用样品缓冲液浸洗树脂，至pH值与原样品缓冲液相同。（2） 将树脂真空抽气1h以除去其中的小气泡。（3） 层析柱中加入少量样品缓冲液，打开层析柱出口，导出少量上样缓冲液以赶出层析柱底部的空气。（4） 摇匀树脂，用一根玻璃棒将其导入层析柱，不要带入气泡。（5） 打开层析柱出口，在树脂堆积时加入更多的样品缓冲液（6） 可用AKTA层析仪压柱，用样品缓冲液最终润洗树脂，使其PH值和离子强度最终达到实验要求，并将树脂洗到基线水平。2） 样品上柱（1） 样品溶液首先要通过离心分离或用0.45um孔径滤纸过滤而成为澄清溶液（2） 溶解蛋白质的样品缓冲液离子强度最好低于50mmol/L（3） 进样：可用AKTA层析仪直接进，也可用手工上柱的方法样品进柱3） 目的蛋白的洗脱蛋白质的洗脱分为步进洗脱和梯度洗脱（1） 步进洗脱 将洗脱液面与树脂床面平齐后，通过加入不同浓度的洗脱液中的NaCl进行洗脱。（2） 梯度洗脱梯度式洗脱的洗柱缓冲液总用量应为树脂床体积的5-10倍，离子强度较低的