L05069陈辉

类别项目批准号理科类L05069附件3 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称：修饰壳聚糖分离纯化慈菇蛋白酶抑制剂研究 申 请 人： 陈 辉 余伟君 所在院部： 生命科学学院 专业年级： 2003级生物技术 联系电话：指导教师: 巫光宏 职称 副教授 立项日期： 二五 年 四月 月 二十 日 结题日期： 二六 年 四月 月 七 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 填 表 说 明 一、 填写结题报告书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。申请书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。 二 、申请书为A4复印纸，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原件），由指导教师和所在院（部）审查并签署意见后报大学生科技创新活动项目指导中心。三 、一级标题三号宋体加粗，用“一、二、三”标示；二级标题四号楷体加粗，用“（一）（二）（三）”标示；三级标题四号仿宋加粗，用“1、2、3”标示；四级标题四号仿宋，用“”标示。示例：一、XXXX课题立项与研究的目的意义（一）XXXX课题立项与研究的目的的意义1、XXXX课题立项与研究的目的意义XXXX课题立项与研究的目的意义四、如表格不够，可以加附页。一、简表项目简况项目名称修饰壳聚糖分离纯化慈菇蛋白酶抑制剂研究项目类别B、理科类；申请经费1500元起止年月05年4月06年4月项目组成员姓 名性别出生年月年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字陈 辉男19840503生物技术1班生命科学学院78.94实验操作与论文写作郑铭集男19830503生物技术1班生命科学学院68.94试验操作与资料查找仇圣年男19840403生物技术1班生命科学学院60.07试验操作和设备调试陈竞帆男19850103生物技术1班生命科学学院72.32实验操作余伟君男19821203生物技术1班生命科学学院65.81试剂准备指导教师情况姓名巫光宏性别女学位硕士职称副教授研究方向植物蛋白质和酶学授课名称生物化学、生物化学研究技术、高级生物化学等项目简介本项目研究通过甲醛和戊二醛交联改性与修饰壳聚糖，制成球形微珠，再经过活化，制成亲和层析载体，对慈菇蛋白酶抑制剂进行分离纯化。实验结果表明改方法经济，可行，可以比较有效的分离纯化慈菇蛋白酶抑制剂，且能保持蛋白酶抑制剂的活性。这样，为类似性质的天然产物的提取，纯化以及检测提供一定的参考和借鉴价值。二、项目研究的内容与方法本项目研究包括：（一）改性与修饰壳聚糖制备亲和层析载体研究1、壳聚糖微珠的制备的最适条件研究 采用不同浓度的壳聚糖，研究其浓度对壳聚糖微珠制备的影响，并得到最适的壳聚糖浓度； 加入不同浓度的戊二醛，研究其对壳聚糖微珠制备的影响，并得到较好的戊二醛浓度； 加入不同浓度的甲醛，研究其对壳聚糖微珠制备的影响，并得到较好的甲醛浓度； 在较好的甲醛和戊二醛浓度的基础上，调节甲醛和戊二醛二者的比例，研究其对壳聚糖微珠制备的影响，并得到较好比例； 通过不同的加热过程的控制，研究其对壳聚糖微珠制备的影响，并得到较好的控制关系；2、微珠壳聚糖凝胶亲和层析载体制备研究 壳聚糖微珠活化过程中加胰蛋白酶与不加胰蛋白酶的对照，研究其对慈菇蛋白酶抑制剂的吸附情况； 壳聚糖微珠活化过程中采用与不采用戊二醛硼砂缓冲液的对照，研究其对慈菇蛋白酶抑制剂的吸附情况；（二）慈菇蛋白酶抑制剂的分离纯化实验1、提取慈菇蛋白酶抑制剂工艺研究 通过使用不同的缓冲液，研究其对慈菇蛋白酶抑制剂的提取效果，并得到最适的提取缓冲液； 通过不同的热变性温度（60-90），研究最佳除慈菇中杂蛋白的条件，并得到最适的杂蛋白热变性温度； 比较盐析与不盐析对提取效果的影响，得出使用与否的结论；2、壳聚糖凝胶亲和层析载体纯化慈菇蛋白酶抑制剂研究（三）慈菇蛋白酶抑制剂的纯度，活性检测和活力计算1、慈菇蛋白抑制剂及其纯度检测 SDSPAGE电泳检测慈菇蛋白酶抑制剂（分子量方面）。 配制不同体系的PAGE-明胶电泳凝胶，检测慈菇蛋白酶抑制剂的酸碱属性，并得出结论； 配制不同浓度的PAGE-明胶电泳凝胶，研究其对慈菇蛋白酶抑制剂检测效果，并得到最好的浓度； 按一定点样量（10l、15l、20l、25l、30l、40l）梯度点样,观测显示带，得到最适点样量； 设置不同的酶用量及酶解时间，研究其对蛋白酶抑制剂检测效果的影响，并得到最佳用酶量和最适的酶解时间；2、慈菇蛋白抑制剂活力计算采用BAEE法进行： 通过抑制剂与胰蛋白酶作用后，检测胰蛋白酶的剩余活力，从而间接测得蛋白酶抑制剂的活力；三、项目研究过程与资料查阅情况（一）研究过程慈菇是季节性植物，每年12月中下旬出产。因此，我们整个项目研究分为三个阶段进行1、2005年7月8月：通过提取大豆蛋白酶抑制剂和丝瓜蛋白酶抑制剂，建立起蛋白酶抑制剂提取的基本过程以及蛋白酶抑制剂的电泳检测方法；2、2005年9月11月：进行壳聚糖的交联修饰和层析载体的制备，建立起壳聚糖微珠制备和层析载体制备的基本方法；3、2006年1月3月：基于前两个研究过程所得到的方法，进行慈菇蛋白酶抑制剂的提取，分离，纯化和检测；（二）资料查阅情况，参考文献1卢晓风，夏玉先，裴严.植物蛋白酶抑制剂在植物抗虫与抗病中的作用.生物化学与生物物理进展.1998,25(4):328-3332潘进权,刘耘. 慈菇蛋白酶抑制剂研究进展. 生命的化学.2001,21(5):366-3673 杨慧玲,朱德煦,戚正武. 慈菇蛋白酶抑制剂的一级结构.中国科学B辑.1991,2:151-1614 吕耀昌. 豆类胰蛋白酶抑制剂活度测定方法的研究. 作物品种资源.1996,1:26-285刘铸英. 大孔吸附树脂提取酸性蛋白酶抑制剂研究. 离子交换与吸附.1989,5(4):251-2556 李严,宗晖.黄小莺等. 中国野生大豆胰蛋白酶抑制剂的初步研究. 复旦学报(自然科学版). 1999,38(5):529-5327 邓俊林,曾仲奎. 玉米巯基蛋白酶抑制剂的纯化及部分性质. 四川大学学报(自然科学版). 1998,35(1):107-1118于飞,曾鑫年,熊忠华等.蛋白酶抑制剂在害虫防治中的研究与应用.植物保护.2004,30(3):13-179 张宏,谭竹钧. 壳聚糖微珠作为亲和层析载体的制备及其用于分离牛凝血酶的研究. 内蒙古大学学报(自然科学版).2003,34(1): 37-4010 宋扬,侯司,赵辉等.改性与修饰壳聚糖固定化酶纯化抑肽酶研究J.生物化学与生物物理进展,2000,27(1) 82-8611 李红,王炜军,徐凤彩.壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶填充床反应器的试制研究J.华南农业大学学报,2000,22(3)60-6212 张所俊,王为国,江龙德,等.球形交联壳聚糖的制备及其在固定化-淀粉酶方面的应用J.现代化工,1997,(4):29-3013 马宁,汪琴.孙胜玲. 甲壳素和壳聚糖化学改性研究进展. 化学进展. 2004,16(4):644-65414 刘其凤,任慧霞. 壳聚糖的结构修饰及其应用. 生命的化学.2004,24(3):252-25415贺小进,谭天伟,戚以政等.球形壳聚糖树脂制备方法及吸附性能研究.离子交换与吸附.2001,6(1):47-5316 桑玉英,胡金勇,曾英. 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳快速检测胰蛋白酶抑制剂的方法. 云南植物研究. 2001，23（2）：23623817 廖海,杜林方,张年辉. 一种快速检测蛋白酶抑制剂电泳活性的染色方法. 植物生理学通讯.2002,38(3):257-25918 蒋挺大.甲壳素.北京:中国环境科学出版社.199619Hideki Kishimura_, Hiroki Saeki, Kenji Hayashi. Isolation and characteristics of trypsin inhibitor from the hepatopancreas of a squid (Todarodes pacificus). Comparative Biochemistry and Physiology Part B.130(2001):117-12320GUO Hong Nian,WU JiaHe,CHEN XiaoYing ect.Cotto Plants Transformed with theActivated Chimeric Cry1Ac and API-B Genes.Acta Botanica Sinica.2003,45(1):108-11321 Ted L. Anderson, David A. Osage. API 579: a comprehensive tness-for-service guide. International Journal of Pressure Vessels and Piping. 77 (2000) 953-96322 Ann R. Kennedy. Chemopreventive Agents: Protease Inhibitors. Pharmacol. Ther.1998,78(3):167-20923 Kaustubh Datta, Rajamm Usha, Samir K. A comparative study of the winged bean protease inhibitors and their interaction with proteases. Plant Physiol. Biochem. 39 (2001) 94995924 Tzeng-Err Chen, Dong-Jiann Huang, Yaw-Huei Lin. Isolation and characterization of a serine protease from the storage roots of sweet potato (Ipomoea batatas L. Lam). 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