大鼠缺血再灌注心肌TLR4、TNF-α表达变化及其关系研究.doc

大鼠缺血再灌注心肌大鼠缺血再灌注心肌 TLR4 TNF NF BNF B 表达及其关系的研表达及其关系的研 究究 刘冬云1 刘坤申2 摘要 目的摘要 目的 研究缺血再灌注大鼠心肌 TLR 4 TNF 和 NF B 的表达及相互关系 方法方法 建立大 鼠缺血再灌注模型 大鼠随机分为假手术组 缺血组 再灌注 30min 组 再灌注 60min 组 再灌注 90min 组 以 RT PCR 法检测心肌中 TLR4 及 TNF mRNA 的表达 结果结果 各种心肌中均检测到 TLR4 的表达 缺血及再灌注后 TLR 4mRNA 含量显著增加 随着再灌注时间延长 TLR 4mRNA 含 量增加更为显著 缺血组与假手术组 TNF mRNA 表达没有显著差异 而再灌注后表达显著增加 随再灌注时间延长 TNF mRNA 含量继续增加更为明显 缺血及再灌注后心肌 NF B mRNA 表达 增加 随再灌注时间延长 NF B mRNA 含量继续增加 且具统计学意义 TLR 4 表达增加时 TNF 和 NF B 表达也增加 三者有一定相关性 结论结论 心肌缺血再灌注损伤使 TLR 4 TNF 表达增 高 阻断 TLR 4 可能有助于减轻缺血再灌注所致心肌损伤 并抑制急性炎症反应的发生 关键词关键词 缺血再灌注损伤 心肌 Toll 样受体 4 TNF NF B Expression of TLR 4 TNF and NF B In rat cardial muscles during ischemia reperfusion LIU Dong yun1 LIU Kun shen2 1Emergency Department Bethune International Peace hospital of Chinese PLA Cardialogy Deparment the First Clinic Hospital of Hebei Medical Univrersity 050082 Shijiazhuang Hebei China Abstract Abstract ObjectiveObjective To investigate the expression of TLR 4 TNF and NF B In rat cardial muscles during ischemia reperfusion MethodsMethods Twenty five female SD rats were randomly divided into sham operation group n 5 ischemia group n 5 ischemia reperfusion 30min group n 5 ischemia reperfusion 60min group n 5 ischemia reperfusion 90min group n 5 Expression level of TLR4 TNF were measured by RT PCR ResultResult The expression level of TLR4 TNF and NF B significantly increased after ischemia reperfusion there are positive correlation among them ConclusiongsConclusiongs These data suggest that myocardial ischemia reperfusion can result in intensive activation of TLR 4 TNF and NF B Treatment with inhibitors to TLR4 may be benefit for attenuation of myocardial injury induced by ischemia reperfusion and subsequent acute inflammatory response KeyKey wordswords TLR 4 ischemia reperfusion NF B TNF 心肌缺血再灌注损伤 Myocardium ischemia reperfusion injury MIRI 是心肺复苏 心肌梗塞 溶栓和介入治疗 以及心脏移植中的重要病理生理过程 局部及全身炎症是缺血再灌注损伤的特征 但激发炎症的具体过程未完全阐明 由于Tool样受体 TLR 4 在识别细菌LPS及介导的炎症反应信 号转导中的重要作用 1 其在心肌缺血再灌注损伤中的作用也越来越多的引起关注 目前缺血再灌 注 1作者单位 050082 河北石家庄 河北医科大学 刘冬云 河北医科大学第一附属医院心内科 刘坤申 2作者简介 刘冬云 1969 女 汉族 吉林蛟河人 医学硕士 主要研究方向为危重病急救 3通讯作者 刘坤申 男 主任医师 博士生导师 心肌中TLR 4的研究正处于起步阶段 本实验通过研究缺血再灌注大鼠心肌TLR 4 TNF 和NF B 的 表达 探讨TLR 4在缺血再灌注损伤中的作用 材料与方法 材料与方法 1 11 1 材料材料 实验所用无RNA酶处理的DEPC Trizol购于北京赛百盛生物公司 逆转录试剂盒购自宝生 物工程有限公司 核酸酶抑制剂及Taq 酶购于宝生物工程有限公司 所有引物均由上海生工生物工程 技术服务有限公司合成 美国Beckman公司台式冷冻高速离心机 上海瑞赛斯仪器有限公司组织机械 匀浆机 美国UVP公司紫外凝胶成像分析系统 1 2方法方法 1 2 1动物实验动物实验 健康雄性SD大鼠 由河北医科大学动物中心提供 25只 体重平均200 250g 饲养 于清洁环境中 自由饮水 12h光照 依随机对照表等分为假手术组 A组 缺血组 B组 再灌注30 60 90 五组 缺血再灌注组取3 戊巴比妥钠90mg kg腹腔注射麻醉 记录全导心电图 常规去毛 消毒皮肤 气管切开 插管 小动物呼吸机辅助呼吸 潮气量1 1 5ml 100g 呼吸次数60 80次 分 I E 1 2 压力在5 15cmH2O之间 根据呼吸频率及强度调整呼吸参数 于左胸第3 5肋打开胸腔 暴露心脏 动脉圆锥及左心房之间下方1mm左冠状动脉前降支处 用7 0无损伤缝线穿过心肌表层 稳定10min后将一胶管平行置于冠状动脉表面 拉线推管 使胶管压迫冠状动脉造成心肌缺血 纹氏 钳固定30min 放松结扎线后即行心肌缺血再灌注 缺血组7 0无损伤缝线直接结扎 假手术组开胸后 暴露30min不结扎冠脉 实验动物模型要求达到下列要求 心肌缺血 再灌注过程中伴有心电图ST段 变化或QRS波增宽 伊文氏蓝TTC染色法将心脏染色后可见明显的缺血 坏死区 当每组累积到5个成 功模型时实验结束 1 2 2 心肌组织总心肌组织总 RNA 的提取的提取 大鼠处死后 立即剪取心肌组织 50 100mg 按照 Trizol 说明书的操 作步骤提取总 RNA 以适量无核酸酶水将 RNA 彻底溶解后 在紫外分光光度计上检测 OD260 及 OD280 并进行 1 琼脂糖凝胶电泳 分析 RNA 样品的纯度及浓度 上述实验中用到的所有耗材均经 过无 RNA 酶以及无 RNA 酶的 DNA 酶处理 1 2 3TLR4mRNA 及及 TNF mRNA 表达的测定表达的测定 心肌中 TLR4 及 TNF mRNA 的表达检测采用 RT PCR 法 按照试剂使用说明 先以心肌总 RNA 为模板 逆转录合成 cDNA 第一链 取上述逆转录产 物 2 l 进行 PCR 反应 反应体系为 50 l 包括 1 25 l 的 Taq 酶 终浓度为 0 4 mol L 的 5 和 3 引物 以 actin 340bp 作为内参照 其引物序列为 正义链 5 GAAGTACCCCATTGAACACG 3 反义链 5 CAGGTCCAGACGCAGGATGG 3 TLR4 178bp 的引物序列为 正义链 5 AGACATCCAAAGGAATACTGCAA 3 反义链 5 GCCTTCATGTCTATAGGTGATGC 3 反应条 件为 94 预变性 2min 94 变性 30s 57 复性 30s 72 延伸 1min 30 循环后 72 补充延伸 5min TNF 171bp 的引物序列为 正义链 5 CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG 3 反义链 5 CCCGACTACGTGCTCCTCACC 3 反应条件为 94 预变性 2min 94 变性 30s 59 复性 30s 72 延伸 1min 30 循环后 72 补充延伸 5min NF B 100bp 的引物序列为 正义链 5 GAGAGCCCTTGCATCCTTTA 3 反义链 5 CTTCCCTTTGGTCTTTCTGT 3 TLR4 TNF 及 NF B 的 PCR 扩增产物进行 1 琼脂糖凝胶电泳 溴化乙锭染色 片段大小经核酸分子量标准证实 Image J 分析处理电泳图 1 2 4PCR 产物测序产物测序 将 SD 大鼠 TLR4 TNF 及 NF B 的 RT PCR 产物进行测序 宝生物工程有限 公司 证明本研究检测 mRNA 为 TLR4 TNF 和 NF B 1 2 5 主要结局观察指标 主要结局观察指标 观察缺血及再灌注对大鼠心肌 TLR4 TNF 和 NF B 表达的影响 1 2 6 统计学处理统计学处理 应用 Sigma Stat3 5 Sigma plot 进行统计学处理 数据以x s 表示 多组方差分 析 p 0 05 为有统计学差异 2 结结 果果 2 1 大鼠心肌 TLR4mRNA 的表达 RT PCR 法对各组大鼠心肌 TLR4 mRNA 和的表达进行检测 各 种心肌中均检测到 TLR4 的表达 见表 1 缺血组 TLR4 mRNA 含量较假手术组显著增加 结果与 文献报道一致 大鼠心肌再灌注 TLR4 mRNA 表达 再灌注 30 min 后 TLR4 mRNA 含量增加 至再 灌注 90min 更加显著 2 2 大鼠心肌 TNF mRNA 表达 RT PCR 测定各组心肌 TNF mRNA 表达 表 1 缺血组与假手术 组 TNF mRNA 表达没有显著差异 而再灌注 30 min 后 其表达显著增加 与缺血组比较存在显著 差异 p 0 05 随再灌注时间延长 TNF mRNA 含量继续增加 且具统计学意义 2 3 大鼠心肌 NF B mRNA 表达 RT PCR 测定各组心肌 NF B mRNA 表达 表 1 缺血组较假手 术组 NF B mRNA 表达增加 而再灌注 30 min 后 其表达显著增加 与缺血组比较存在显著差异 p 0 05 随再灌注时间延长 NF B mRNA 含量继续增加 且具统计学意义 2 3 TLR4 扩增片段的测序 对 SD 大鼠 TLR4 TNF 和 NF B 的扩增产物进行测序 与 GeneBank 提供序列比较 结果证实检测 TLR4mRNA TNF mRNA 和 NF B mRNA 图 2 表 1 各组 TLR4mRNA TNF mRNA 和 NF b mRNA 表达变化 注 与假手术比较 p 0 05 与假手术组及缺血组比较 p 0 05 注 1 假手术组 2 缺血组 3 缺血 30min 组 4 缺血 60min 组 5 缺血 120min 组 3 讨论讨论 缺血再灌注损伤特征表现为氧合血液作用于缺血细胞产生的爆发性炎症反应 早期的研究 2 认为 中性粒细胞浸润和活性氧自由基生成MIRI形成的重要原因 而近期研究则发现MIRI程度与中性粒细 胞浸润数量无关 另一方面 多项应用抗氧化剂和抗白细胞粘附药物的大规模临床研究均未证实其 有效性 因此 Hill和Ward提出IRI是以补体成分错误的攻击自身抗原为特征的先天性免疫应答 先 天性免疫系统中能够识别病原分子模式的受体包括Toll样受体 补体和天然抗体 Toll样受体 3 4 5 Toll like receptor TLR 是新近发现的先天性免疫病原微生物的重要识别受体 能够同时激活先天 性免疫应答和获得性免疫应答 因此成为构建机体先天性免疫和获得性免疫的桥梁 TLR4在人类所 有细胞中表达 能够识别多种内源性和外源性配体 参与多种炎症过程 在Toll样受体家族中占有重 要地位 Chong 6 等率先应用C3H HeJ鼠 TLR4缺陷 研究观察TLR4在心肌R I中的作用 发现与野 生型小鼠C3H HeN的小鼠 相比 在相似的危险区面积之下 C3H HeJ的小鼠梗死区域大小下降了40 印 假手术组 缺血组 再灌注 30 再灌注 60 再灌注 90 TLR4 0 624 0 078 0 818 0 049 1 267 0 072 1 292 0 076 1 586 0 091 TNF 0 986 0 196 1 037 0 145 1 520 0 136 1 741 0 073 2 059 0 115 NF B 0 648 0 0719 0 992 0 109 1 582 0 148 1 828 0 136 2 146 0 146 证了TL R4可能介导心肌缺血再灌注损伤的炎症反应的结论 本研究应用SD大鼠 通过动物模型研究证实SD大鼠心肌中存在TLR4表达 通过RT PCR检测发 现 结扎大鼠冠状动脉前降支后出现TLR4 mRNA含量增加 与再灌注后继续升高 随再灌注时间延 长更加显著 表明TLR4作为先天性免疫特定的病原模式识别受体 参与了心肌缺血 再灌注损伤的 形成 TNF 是一种主要的炎症细胞因子 能产生多种生理效应 在心肌缺血再灌注损伤的病理 生理发展过程起到重要作用 7 核转录因子NF B 可能在缺血组织再灌注时 对调控炎性因子的 基因表达起重要作用 8 9 本研究发现 TNF NF B在缺血后并无显著增加 而与再灌注后则与 TLR4的变化有一定相关性 从而证实TLR4对缺血再灌注损伤心肌TNF NF B表达具有重要影 响 值得一提的是 国外既往对TLR在缺血再灌注损伤中作用的研究大都基于C3H HeJ基因缺陷鼠 试验成本较高 而本研究则应用常见的SD大鼠 通过简单可靠的动物模型证实缺血再灌注损伤中 TLR4对心肌局部TNF NF B表达变化的影响 通过DNA测序进一步证实了本研究的结论 近年来研究揭示心血管疾病的发生和发展与感染密切相关 TLR及其介导的信号转导在心血管疾 病发病中的作用受到人们的关注 抗TLR 4治疗可能有助于减轻缺血再灌注所致心肌损伤 并抑制急 性炎症反应的发生 参考文献参考文献 1 李志杰 刘靖华 姜勇 Tool样受体的发现及其研究进展 中国危重病急救医 2003 11 15 694 697 2 Hoffman JW J r Gilbert TB Poston RS et al1Myocardial reperfusion injury etiology mechanisms and therap ies J 1J Extra Corpor Technol 2004 36 4 391 411 3 ROWE D C MCGETTRICK A F LATZ E et al The myristoylation of TRIF related adaptor moleculeis essential for Toll like receptor 4 signal t ransduction J Proc Natl Acad Sci USA 2006 103 6299 6304 4 ZEU KE S ULMER A J KUSUMOTO S et al TLR4mediated inflammatory activation of human coronary artery endothelial ce