S-腺苷甲硫氨酸生产工艺优化.doc

S-腺苷甲硫氨酸菌株的筛选及发酵工艺优化摘要 以45 株酵母菌株作为出发菌株, 筛选出2 株高产SAM( S- 腺苷甲硫氨酸) 的酿酒酵母菌株( A12A、A18A) , 以该2 株酿酒酵母菌株为对象, 研究发酵温度、发酵液初始pH 值、摇床转速以及发酵时间对菌体产量和SAM 产量的影响, 并优化发酵工艺条件, 以提高SAM 的产量。结果表明: 发酵温度、发酵液初始pH 值、摇床转速和发酵时间对菌体产量和SAM 产量均有显著影响。经正交试验优化, 2 株酿酒酵母菌株产SAM 的最佳发酵条件为25 e 、发酵液初始pH 值5. 0、摇床转速225 r/ min、发酵时间108 h, 在该发酵条件下, 酿酒酵母菌株A18A 产SAM 最高量达2. 54 g/ L, 较优化前提高1. 17 倍。关键词 酿酒酵母; S- 腺苷甲硫氨酸; 发酵工艺 S-腺苷甲硫氨酸( SAM) 在生物体内具有转甲基、转氨丙基、转硫 1 等作用, 对人体许多疾病的预防和治疗都有积极作用 2 。自1952 年SAM 首次被意大利科学家分离出以来, 在欧洲一直将其作为抑郁症和关节炎的处方治疗药物, 市场需求量大大增加 3 。在培养基中添加一定量的L-甲硫氨酸, 能够在细胞内催化ATP 与L-甲硫氨酸反应, 合成较高浓度的SAM。因此, 先通过微生物发酵, 再从菌体中提取精制SAM 是目前其工业化生产的主要途径。酿酒酵母属 4-5 、毕赤酵母属 6 、大肠杆菌 7 等微生物可在体内合成SAM。Gaw e 等 8 考察了10种微生物产SAM 的差异, Shiozaki 等 9 筛选出S. sake作为高产SAM 的菌株 2 。目前学者研究了培养基组成、发酵方式 10 等对SAM 产量的影响, 如Shiozaki 1 采用10 mL 培养基的小量发酵法获得了1. 55 g/ L 的SAM, 叶盛 11 利用YPD 培养基, 经发酵条件优化, 获得了1. 74 g/ L 的SAM。基于酵母的安全性及高表达性, 笔者从45 株酵母菌株中筛选得到2 株高产SAM 的菌株, 编号为A12A 和A18A, 继而以该2 株菌株为对象, 研究发酵条件对菌体产量和SAM 产量的影响, 优化发酵工艺条件, 以提高SAM 的产量。1 材料与方法1. 1 试验材料1) 菌株来源。45 株酵母中有44 株由中国科学院微生物研究所提供, 1 株为笔者所在实验室保藏。2) 培养基。YPD 完全培养基( g / L) : 酵母粉10, 蛋白胨20, 葡萄糖20, 琼脂20; 自来水配制, pH值, 自然; 121 e 灭菌20 min。3) 种子培养基( g/ L) : 酵母粉10, 蛋白胨20, 葡萄糖20; 自来水配制, pH 值,自然; 121 e 灭菌20 min。4) 发酵培养基 11 ( g / L) : 葡萄糖10, 酵母粉3, 蛋白胨5, L-甲硫氨酸3; 自来水配制, 121 e 灭菌20 min。1. 2 试验方法1) 发酵方法。菌株筛选: 从新鲜斜面接种1 环酵母 1 2 于250 mL 摇瓶( 溶液体积25 mL) 中, 在一定温度和转速下摇床培养一定时间, 取样测定发酵液菌体产量和SAM 产量。发酵过程: 种子培养基按10% 接种量接种于250 mL 摇瓶( 溶液体积25mL) 中, 在一定温度和转速下摇床培养一定时间,取样测定发酵液菌体产量和SAM 产量。2) 样液的制备。参考文献 13 , 取25 mL 发酵液于12 000 r / min 离心10 min, 弃去上清液, 然后添加1. 5 mol/ L 的高氯酸, 并在室温下振荡提取30min, 进行第2 次离心( 12 000 r / min, 10 min) , 用25mm 滤膜上过滤清液, 最后用pH 值3. 0 的盐酸将滤液稀释至一定浓度。3)HPLC 测定方法。参考文献 14 , 色谱柱为SupeloC18 反相柱( 250 mm 4. 6 mm, 5 Lm) ; 流动相为甲醇: ( 40 mmoL/ L NH4 H2 PO4 - 8 mmoL/ L庚烷磺酸钠) = 30 B70( V/ V) , 流动相pH 值用稀盐酸调至3. 0; 流速1. 0 mL/ min; 柱温35 e ; 灵敏度0. 004AUFS; 检测波长257 nm; 进样体积20 LL。根据标准品峰面积与产量关系作出标准曲线, 样品在257 nm的峰面积代入标准曲线换算得到SAM 的产量。 4) 菌体产量的测定。取25 mL 发酵液, 滤纸过滤得净菌后, ( 105 ? 1) e 烘至恒质量后称质量 15 。5) 数据分析。应用SAS 软件和Ex cel 软件对数据进行分析, 试验结果取3 次平行测量的平均值。2 结果与分析2. 1 高产SAM 菌株的筛选45 株酵母菌株接种于pH 值5. 0 的发酵培养基,发酵温度25 e , 摇床转速250 r/ min, 发酵时间96 h,通过自然对比法进行产量筛选试验, 结果见表1。从表1 的结果看出, 菌株生产能力较好的有12、1 8、24、41 号。再将表现较好的4 株菌株复筛,获得产SAM 较高的12、18 号菌株。在后续试验中对18、1 2 号菌株进行最佳发酵条件的优化。1 20. 0 84 4. 5 215 2. 72 ? 0. 03 a 2. 75 ? 0. 07 e 1. 28 ? 0. 04 a 1. 76 ? 0. 09 de2 20. 0 96 5. 0 225 2. 76 ? 0. 07 a 2. 81 ? 0. 04 de 0. 96 ? 0. 02 ef 1. 67 ? 0. 12 ef3 20. 0 108 5. 5 235 2. 64 ? 0. 18 a 2. 80 ? 0. 10 de 1. 20? 0. 04 c 1. 93 ? 0. 16 bc4 22. 5 84 5. 0 235 2. 82 ? 0. 10 a 2. 99 ? 0. 10 bc 0. 96 ? 0. 01 ef 1. 73 ? 0. 30 de5 22. 5 96 5. 5 215 2. 83 ? 0. 15 a 3. 20 ? 0. 04 a 1. 00 ? 0. 03 e 1. 56 ? 0. 06 f6 22. 5 108 4. 5 225 2. 58 ? 0. 27 a 3. 00 ? 0. 03 bc 0. 92 ? 0. 01 f g 1. 57 ? 0. 09 f7 25. 0 84 5. 5 215 2. 62 ? 0. 16 a 2. 91 ? 0. 09 cd 0. 87 ? 0. 02 g 1. 86 ? 0. 08 cd8 25. 0 96 4. 5 235 2. 78 ? 0. 03 a 3. 04 ? 0. 05 bc 1. 07 ? 0. 05 d 2. 06 ? 0. 04 b9 25. 0 108 5. 0 225 2. 67 ? 0. 08 a 3. 08 ? 0. 07 ab 1. 35 ? 0. 04 a 2. 54 ? 0. 02 a编号Numb er温度/ eTemperature时间/ hT imepH转速/ ( r/ min)Rot at ion speed菌体产量/ ( g/ L) Cel l dry w eig htA12A A18ASAM 产量/ ( g/ L) SAM cont entA12A A18A120844.5215 2.72 ? 0. 03 a2209652252.76 ? 0. 07 a3201085.52352. 64 ? 0. 18 a