动物组织切片的制作与染色.ppt

1 水产动物组织切片的制作与染色 2 一 实验目的 学习石蜡切片法了解组织染色原理掌握各组织器官的基本结构 3 组织切片标本 载玻片 盖玻片 组织 二 实验原理 4 二 实验原理 取材固定脱水透明浸蜡包埋切片染色封片 5 1 取材 根据不同的实验目的 选择相应的材料 材料要求新鲜 准确 完整 材料要避免挤压 挫伤 干枯 种类 部位 肝 年龄或发育阶段 是观察横切面还是纵切面 取材原则 动作 快 轻 用力均匀体积合适 0 3 0 3 0 3cm刀要锋利及时固定 编号 注明采集时间 地点 名称 组织部位 6 2 固定 取材后应及时固定 编号 注明采集时间 地点 名称 组织部位 目的 保持原来的结构固定液 波恩氏液固定时间 48h左右固定后的处理 将固定液换成70 乙醇作短期保存 7 单一固定液复合固定液 长处突出 短处抵消 Bouin s 8 固定组织时应注意 保持组织新鲜 勿使其干燥 尽快固定处理 固定液必须有足够的量 一般大于组织20倍以上 组织块不易过大过厚 厚度必须控制在0 3cm以内 冲洗或漂洗 组织固定后应充分水洗 去除固定液造成的人为假象 抽气 使固定液尽快渗入材料内部 并排除材料内气泡的干扰 9 水和透明剂不能互溶 只有脱去水分后 才能让透明剂进入 现采用的脱水剂一般是乙醇或丙酮 它既能与水相混合 又能与透明剂相混 脱水的过程 70 80 90 各1h 95 95 100 100 各20min 脱水的时间 可根据组织的类型 大小而定 保证脱水梯度和每一步脱水时间 水要完全脱净 但不能过度脱水 过久使组织变脆 收缩 3 脱水 10 4 透明 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂 它具有渗透力强 溶解石蜡量大 又易挥发的优点 其缺点是易使组织收缩 变硬 变脆 因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定 替代品 水杨酸甲酯 30min 氯仿等 11 将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中 不断提高石蜡的比例 直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂 使石蜡浸入组织而起支持作用 便于今后的包理与切片 1h 浸蜡应在高于石蜡熔点3 左右的温箱 60 中进行 以利石蜡浸入组织内 5 浸蜡 12 将液态石蜡缓缓倒入金属模具中 再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入金属模具 摆好位置 待石蜡冷却成固态即包埋完毕 约15min 6 包埋 13 7 切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形 附于小木块上 通常切片厚度为5 6um切出一片接一片的蜡带 用毛笔轻托轻放在纸上 14 贴片与烤片 用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上 以免在以后操作中使材料脱落 在载玻片上涂抹粘片剂 再滴蒸馏水 放上蜡片铺展 最后用滤纸吸除多余水分 将载玻片放入45 温箱中干燥 15 8 染色 H E 碱性染料 使细胞核等呈紫蓝色 嗜碱性 酸性染料 使一般胞质和胶原纤维呈粉红色 嗜酸性 苏木精 hematoxylin 伊红 eosin 16 染色液配制 17 9 封片 染色后的切片尚不能在显微镜下观察 需经梯度酒精脱水 在95 及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底 如染液为酒精配制 则应缩短在酒精中的时间 以免脱色 二甲苯透明后 滴加适量 1 2滴 中性树胶 再将洁净盖玻片倾斜放下 以免出现气泡 18 三 实验主要仪器 切片机 烤片机 摊片机 19 四 实验试剂 Bouin氏液 饱和苦味酸75ml 甲醛25ml 冰乙酸5ml Ehrilich氏酸性苏木素液 苏木素2g 纯酒精100ml 钾明矾15g 蒸馏水100ml 甘油100ml 冰醋酸10ml1 伊红染液 中性曙红0 5 1g 蒸馏水100ml1 盐酸 酒精分化液 浓盐酸1ml 70 酒精99ml 梯度酒精 70 乙醇 80 乙醇 90 乙醇 95 乙醇 无水乙醇 二甲苯石蜡中性树胶 20 五 实验步骤 1 取材 21 取材固定 24 36h 70 乙醇 1h 80 乙醇 1h 90 乙醇 1h 95 乙醇 20min 2 100 乙醇 20min 2 水杨酸甲酯 约30min 1 2石蜡 1 2二甲苯 20min 蜡杯 20min 2 包埋 切片 贴片 烤片 2 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片 22 3 H E 染色流程 二甲苯脱蜡 1 10min 二甲苯脱蜡 2 5min 1 2100 乙醇 1 2二甲苯 1 3min 100 乙醇 2min 95 乙醇 2min 80 乙醇 2min 70 乙醇 2min 蒸馏水洗 3min 吸水 苏木精染色 14min 自来水洗 10min 分化液分化 3s 自来水洗 3 5min 伊红染色 1 5min 70 乙醇 2min 80 乙醇 2min 90 乙醇 2min 95 乙醇 1 2 2min