细胞培养操作规范.ppt

细胞培养操作规范 一 细胞培养的基本条件 1 无菌环境 细胞培养间消毒a 使用前紫外照射20 30分钟b 使用完75 酒精擦拭台面 紫外照射15分钟 c 每两周用84消毒液擦拭地面 台面一次的方式进行消毒 超净工作台 使用前开启柜内紫外灯照射15 30分钟使用时开启鼓风 在台面内操作使用完毕后要用75 酒精将台面和台内四周擦拭干净 紫外照射10分钟 CO2培养箱 1 设定的条件为37 5 CO2 2 使用CO2培养箱应注意的问题 用螺旋口瓶培养细胞时 需将瓶盖微松 以保证通气 保持培养箱内空气干净 定期消毒擦拭 箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000毫升 以保持箱内湿度 控制水盘内污染的方法 1 定期 至少每两周一次 更换水盘内的无菌蒸馏水或无菌去离子水 2 在水盘内添加适量硫酸铜 预防真菌污染 配制方法 20g无水硫酸铜 5ml浓硫酸 1L灭菌纯水 3 水盘内添加适量抗生素 4 定期为培养箱 含水盘 进行一次高温灭菌 2 细胞培养条件细胞培养器皿 细胞培养瓶 25平方厘米 加液量3 5ml 75平方厘米 加液量10 15ml 150平方厘米 加液量40ml 细胞培养板 细胞培养皿 35mm 加液量3ml 60mm 加液量5ml 100mm 加液量10ml 150mm 加液量15ml 常用培养基 RPMI1640 适合许多种细胞 如肿瘤细胞 正常细胞的原代培养 传代培养等 尤其适合人白细胞 如H9 HL 60 IM 9和K 562等细胞系的培养 DMEM DMEM A 不含谷氨酰胺 可高压灭菌 DMEM H 含谷氨酰胺 高糖型 4500mg L 除菌过滤灭菌 DMEM L 含谷氨酰胺 低糖型 1000mg L 除菌过滤灭菌 血清 常用血清种类 胎牛血清 新生牛血清 小牛血清血清的灭活 消除补体活性 56 30分钟 使用浓度 5 20 一般10 血清的消毒 过滤除菌血清解冻步骤 20 或 70 至4 冰箱溶解一天 至室温下全溶后再分装 一般用15ml无菌离心管分装 谷氨酰胺 谷氨酰胺在溶液中很不稳定 4 放置1周可分解50 故应单独配制 置于 20 保存 临用前加入培养液 消化液 胰蛋白酶溶液 常用浓度 0 25 消化时间 2 10分钟 显微镜下观察 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 EDTA溶液使用浓度 0 02 与胰蛋白酶配合使用 EDTA不能被血清中和 终止消化后 需用培养液或PBS彻底冲洗培养瓶 二 细胞培养前准备工作 1 相关耗材 细胞培养皿 瓶 若干 离心管 15ml 50ml 100ml玻璃瓶4个 500ml玻璃瓶4个 2mL冻存管 tip头及枪头盒 吸管 10ml刻度 吹打管 50ml 10ml 5ml注射器 一次性针孔过滤器 0 22um 一次性口罩 帽子 手套 纱布 牛皮纸 标签纸 2 相关试剂及配制方法 细胞培养的相关试剂配制均在超净工作台上操作 严格按照无菌操作流程 完全培养基 基础培养基90 血清10 碳酸氢钠2 0g L青 链霉素100U ml过滤除菌4 保存使用时加入谷氨酰胺 配制方法 谷氨酰胺2 922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol L的溶液 充分搅拌溶解后 过滤除菌 分装小瓶 20 保存 使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液 胰蛋白酶 EDTA消化液称取0 25g的胰蛋白酶和0 02g的EDTA用无Ca2 Mg2 的PBS缓冲液或D Hank s配制 用滤器过滤除菌 20 分装保存 细胞冻存液配制 90 血清和10 DMSO 3 常用培养器皿的清洗及消毒玻璃器皿的清洗刷洗 自来水 浸泡 洗衣粉 冲洗 自来水 烘干 50 恒温干燥箱 酸泡 24小时 至少6小时 清洗 流水冲洗和蒸溜水冲洗15遍以上 50 烘干 新的橡胶制品洗涤方法0 5MNaOH煮沸15分钟或浸泡过夜 流水冲洗 0 5MHCl煮沸15分钟或浸泡过夜 流水冲洗 蒸馏水冲洗15次以上 50 烤干备用 消毒 消毒前常用的包装 牛皮纸 棉布 铝饭盒包装高压蒸汽消毒 121 维持20 30分钟 三 细胞培养方法 1 细胞复苏方法 从液氮中取出冷冻管 迅速投入37 水浴中 甩动冻存管 使其融化 1分钟左右 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上 1000转低速离心5分钟 去上清 加新鲜培养液培养刚复苏的细胞 2 细胞换液方法 换液指针 观察培养基颜色 当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙黄色 颜色清亮 无杂质 无浑浊观察细胞生长状态 细胞生长状态良好 确认无细菌真菌污染换液方法 将吸管 废液缸放入工作台开启细胞培养房及工作台紫外消毒20分钟 开启恒温水浴箱 培养液预热关闭紫外灯 开启工作台上风机吸弃原培养液加入新的培养 3 细胞传代方法 传代指针 观察培养基颜色 当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙黄色 颜色清亮 无杂质 无浑浊显微镜观察细胞生长状态 细胞生长状态良好 铺满培养瓶80 以上 细胞透亮 形态清晰 间隙无杂质 确认无细菌真菌污染 传代方法 将新的培养皿 吸管 废液缸放入工作台开启细胞培养房及工作台紫外消毒20分钟 开启恒温水浴箱 培养液 消化液预热关毕紫外灯 开灯 通气 点燃酒精灯吸弃培养基 PBS清洗两次加入2ml消化液晃动培养瓶使消化液覆盖整个细胞界面后吸弃培养液肉眼观察细胞培养瓶底部出现一层云雾状 轻轻敲打底部有块状物脱落 显微镜下观察看到细胞间隙变大 细胞回缩变圆少量漂浮后加入10ml含血清培养基终止消化 吹打管吹打数次将细胞悬液吸至离心管 1000rpm离心5分钟吸弃上清 加入PBS吹打混匀 1000rpm再次离心5分钟吸弃上清 加入新鲜培养基 吹打混匀 按比例接种到细胞培养瓶 细胞消化时间的控制 4 细胞冻存 吸出旧培养液加PBS冲洗两次胰酶消化加培养基中止消化 以上步骤同细胞传代 细胞计数离心收集细胞 吸弃上清 加入冻存液调整细胞密度至1 106个 ml将细胞移入冻存管 写好标签 细胞种类 冻存时间 4 15 30分钟 20 1 2小时 80 保存 或过夜后至液氮罐内保存 5 细胞计数 细胞计数板计数室构造 数红色边框标记的四个方格内的细胞总数 如有压线则计上不计下 计左不计右 细胞数 ml 4个大方格细胞总数 4 104 稀释倍数 四 细胞培养注意事项 1 实验进行前 无菌室及无菌操作台 laminarflow 以紫外灯照射20 30分钟灭菌 以75 酒精擦拭无菌操作抬面 并开启无菌操作台风扇运转10分钟后 才开始实验操作 每次操作只处理一株细胞株 且即使培养基相同亦不共享培养基 以避免失误混淆或细胞间污染 实验完毕后 将实验物品带出工作台 以75 酒精擦拭无菌操作抬面 操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后 再进行下一个细胞株之操作 2 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞 必要物品 例如试管架 吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置 其它实验用品用完即应移出 以利于气流之流通 容器 培养瓶 培养板和培养皿实验用品以75 酒精擦拭外部后才带入无菌操作台内 实验操作应在台面之中央无菌区域 勿在边缘之非无菌区域操作