第三章_分子荧光和化学发光

1 7 5化学发光分析法简介 2 7 5化学发光分析法简介 基于化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法 这种分析方法具有灵敏度高 测定线性范围宽 仪器设备简单 分析速度快且易实现自动化等优点 3 化学发光的能量水平与荧光相同 引起发光的激发方式不同 产生化学发光 反应必须产生能够发出可见光的激发产物 只有热效应可以产生足够的能量 几乎所有的化学发光反应需要氧 过氧化氢或其它强氧化剂 4 任何一个化学发光反应都包括两个步骤 即化学激发和发光 如下式所示 A BC D 激发 C C hv 发光 间接的化学发光则按如下反应发生 A B CAB C 激发 C C hv 发光 由于加入发光能量接受体C所导致的化学发光称为敏化化学发光或活化化学发光 一 化学发光反应的条件 5 化学发光反应可以在气相 液相或固相进行 分别称为气相化学发光 液相化学发光或固相化学发光 若化学发光在两个不同相间进行就称为异相化学发光 6 化学发光反应都包括化学激发和发光两个步骤 则有 CL CE EN 1 式中 CL为化学发光效率 CE为生成激发态分子效率 EN为激发态发光效率 CL CE分别定义为 7 则化学发光的效率为 8 一个化学反应要成为化学发光反应必须满足下面几个要求 化学反应要提供足够的能量生成激发态 也就是要有足够的激发能 E 激发能的主要来源是反应焓 Hr 大多数的化学发光反应实例中 观察到的光子能量均比 Hr大 在 Hr 的条件下 将要由反应的活化焓 H 提供这种附加的能量 因此 必须有 Hr H 9 这是满足产生化学发光的必要条件而不是充分条件 有机发色基激发态的能量 E 通常在0 12 0 25J mol 1 对应于570 280nm 范围 若在整个可见紫外区 760 280nm 则 E 处在0 092 0 25J mol 1之间 这个能量要求化学反应提供 在多步骤反应中 由于化学激发的瞬时性 这个能量必须由某一步骤单独提供 否则前一步反应释放的能量将因振动松弛消失在溶液中而不遗留至下一步 10 至少要有一种物质能够接受化学反应的能量生成激发态 换句话说 也就足要有足够的激发效率 CE 对有机分子的液相化学发光来说 从能量上看 容易生成激发态产物的常是芳香族化合物和羰基化合物 11 在反应条件下激发态分子能够以电磁辐射的形式释放能量回到基态 若 CN很低 由式 1 可知 即使化学激发效率 CE很高 化学发光效率 CL也是低的 若加入适当高效率的接受体 使能量转移到接受体上而发光 就会大大提高发光效率 而在计算化学发光效率时 就得加入一项能量转移效率 ET 12 二 化学发光分析的基本原理 化学发光分为快发光和慢发光 化学发光的反应过程可用发光强度与时间的关系曲线来描述 图13 13 图中t1为化学发光峰值出现的时间 t2为化学发光峰值衰减了90 时的时间 对于快发光 t1 1s 化学发光衰减时间即t2 t1 5s 对于慢发光来说t2 t1 5s 还有一种慢发光 如图13 13b中所示 化学发光强度在一段时间基本保持不变 然后再较快的上升或下降 13 图13 13化学发光的动力学曲线 14 设某分析物与过量试剂作用而发光 则此时的化学发光强度与分析物浓度有如下关系 式中 ICL t 为在时刻t的化学发光强度 以每秒产生的光量子数表示 为化学发光效率 dc dt为分析物参加反应的速度 即每秒参加反应的分子数 2 15 对于一级或假一级反应t时刻的化学发光强度与该时刻的分析物浓度成正比 通常在化学发光分析中采用测量峰高 利用峰高与分析物浓度的线性关系进行定量分析 16 为了提高测量的灵敏度 也可采用测量峰面积 即在一定时间间隔内对化学发光强度进行积分 得到发光强度的积分值 3 17 t1和t2若为反应过程中的某一段时间间隔 则积分值只是部分化学发光强度的积分值 如果t1取零 t2取反应结束所需时间 得到的就是整个反应产生的总发光强度 它相当于图13 13中动力学曲线下的整个峰面积 它与分析物浓度存在线性关系 这种分析方法实质上是一种平衡法 特别适于慢的化学发光 18 化学发光反应对指定的测定最好是专属的 如酶法化学发光 不需实行光学分辨或化学方法排除干扰 如一个化学发光反应中出现不同的激发态分子 这就需要光分辨 选择测定所感兴趣的化学发光 用一个滤光片就可达到目的 19 若参加反应的试剂可与各种分析物反应产生发光现象 由于化学发光光谱均相同 利用光分辨将无意义 需要采用其他方法排除干扰 例如 许多金属离子能催化鲁米诺 H2O2化学发光 可利用色谱技术分离或化学掩蔽方法等手段达到分析目的 许多化学发光的强度与分析物质的浓度在几个数量级之内呈良好的线性关系 线性范围宽 20 三 化学发光反应的类型 1直接化学发光和间接化学发光直接化学发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应 生成电子激发态产物分子 此初始激发态能辐射光子 表示如下 A BC DC C hv 式中A或B是被测物 通过反应生成电子激发态产物C 当C 跃回基态时 辐射出光子 21 间接化学发光是被测物A或B通过化学反应后生成初始激发态C C 不直接发光 而是将其能量转移给F 使F处于激发态 当F 跃回基态时 产生发光 如下式表示 A BC DC FF EF F hv式中C 为能量给予体 而F为能量接受体 例如 用罗丹明B 没食子酸的乙醇溶液测定大气中的O3 其化学发光反应就属这一类型 22 没食子酸 O3A O2A 罗丹明B罗丹明B B罗丹明B 罗丹明B hv没食子酸被O3氧化时吸收反应所产生的化学能 形成受激中间体A 而A 又迅速将能量转给罗丹明B 并使罗丹明B分子激发 处于激发态的罗丹明B分子回到基态时 发射光子 该光辐射的最大发射波长为584nm 23 2气相化学发光和液相化学发光 气相化学发光主要有O3 NO S的化学发光反应 可用于监测空气中的O3 NO NO2 H2S SO2和CO等 NO与O3的气相化学发光反应有较高的化学发光效率 其反应机理为NO O3NO2 O2NO2 NO2 hv 24 反应的发射光谱范围为666 875nm 灵敏度可达1ng ml 也可同时测定大气中NO2的含量 将NO2还原为NO 测定二者的总量 再减去NO的量 液相化学发光几种体系 鲁米诺和光泽精 25 光泽精 光泽精 N N 二甲基 9 9 联吖啶二硝酸盐 在碱性溶液中与H2O2反应生成激发态的N 甲基吖啶酮 产生最大发射波长为470nm的化学发光 CL 0 01 0 02 反应历程为 26 利用金属离子对该体系的催化作用可以测定Mn2 Ag Fe2 Fe3 尤其是鲁米诺体系不能测定的Pb2 Bi3 等离子 基于对该体系化学发光的增强作用可以测定丙酮 尿素 甘油 羟胺 抗坏血酸 肌酸肝 葡萄糖 谷胱甘肽和果糖等 27 四 鲁米诺化学发光反应的机理 在常用的化学发光分析的发光物质中 鲁米诺的应用最广泛 深入的研究已经给出鲁米诺化学发光反应机理的初步模式 它产生化学发光反应的 CE为0 01 0 05 28 鲁米诺被氧化发光的整个过程如下 hv max 425nm 29 鲁米诺 3 氨基苯二甲酰环肼 在碱性溶液中可被一些氧化剂氧化 产生最大发射波长为425nm的化学发光 发光过程有两种方式 即单电子氧化和双电子氧化 单电子氧化得到中间体鲁米诺游离基 双电子氧化得到中间体叠氮醌 而最后发光体是3 氨基邻苯二甲酸根阴离子 在碱性溶液中 I2与鲁米诺的化学发光反应属于双电子氧化过程 该化学发光体系可检测碘的浓度低达5 10 10mol L 1 30 金属离子催化鲁米诺 H2O2体系的化学发光反应大都属于单电子氧化过程 例如 Mn HO2 Mn HO2 Mn HO2 鲁米诺 H2O M n 1 鲁米诺游离基 3OH 鲁米诺游离基 HO2 化学发光上述历程中Mn 如Co2 参与了反应 价态升高 本身是还原剂 31 四 液相化学发光的测量仪器 大多数化学发光和生物发光测量仪器称为光度计 因为这类仪器只有光电检测 没有单色器提供光色散 也有人称这类仪器为发光光度计 商品名称则更为多种多样 液相化学发光的一个重要优点是仪器比较简单 一般仅有进样系统和检测系统组成 32 化学发光仪示意图 33 1 进样系统 进样系统包括化学发光反应地 试样注射器 聚光和控温装置等 保证试样能在反应池内均匀混合 产生的光辐射供检测系统检测 进样分静态注射和流动注射两种方式 1 试样反应池反应池的材料可根据不同要求选择玻璃 石英或塑料等 池的形状要与光电管的有效接受面积相匹配 若为流动分析则其形状 大小都要严格要求 34 2 进样器在静态注射进样方式中 进样器通常为微量吸量管或各种形式的注射器 容积从微升到毫升不等 若为流动注射进样方式 用泵代替注射器或加有注射阀 35 3 聚光装置为了提高检测效率 通常在试样池的后方装一聚光装置 这种装置可以是凹面镜 简单的也可用一平面镜 也可直接在池子外面半圆圈周上镀一个镜面 使化学反应的光辐射能有效地到达光电管接受面 好的聚光装置可使进入检测器的光达50 36 4 进样方式在静态注射进样方式中 可以是反应物混合后最后注入分析物 也可以是分析物与介质混合后再注入反应物 应根据分析要求和反应体系特点 选择最佳进样程序 静态进样的优点在于反应条件容易选择且使用方便 仪器价格也较低廉 37 在流动注射进样方式中 传递分析物和反应物都是通过泵来实现的 它的反应池是一个透明性良好的盘管 分析时用泵驱动试剂进入流动系统 样品经注入阀注入到反应试剂的溪流中 试剂和试样在流动过程中进行混合 主要在盘管中混合 并在盘管中产生化学发光 用置于盘管正前方的光电倍增管检测光信号 流动注射式自动化程度高 分析速度快 便于连续监测和批量分析 另外 流动注射分析的准确度和精密度也较好 38 2 检测系统 检测系统包括光电转换 信号放大 信号处理和数据显示等部分 光信号转换为电信号由光电倍增管来完成 对于某一特殊用途的仪器 仅要求检测器的光谱响应最大值与指定应用体系的化学发光光谱峰值相同或相近即可 对通用仪器 则管子光阴极的光谱响应范围越宽越好 以适应各种不同的发光体系 39 五 影响液相化学发光强度的主要因素 1 溶液酸度不同的化学发光体系要求在不同的pH值下进行才能获得最大的发光强度 试液的酸度会影响发光活性物质的有效浓度 对化学发光强度直接产生影响 所以反应液及试液的酸度对化学发光强度影响很大 每个发光体系的最佳酸度都应该通过实验确定并严格进行控制 40 2 试液的注入速度在固定其他条件的情况下 一般来说 试液注入的速度越大 体系发光强度的线性变化也越大 所以 对静态注射式液相化学发光仪来说 开启试液活塞的速度应尽量快且每次要均匀一致 这样 可使分析结果既有高的灵敏性又有好的重现性 41 3 干扰物质的存在在痕量分析中 有微量的干扰物质存在便会引起污染而导致试验失败 所以 所用的仪器必须清洁 试剂纯度要高 蒸馏水的本底值应尽量低且应进行空白试验 实验室的环境应严格进行控制 42 对于具体的发光体系 若存在其它离子或物质干扰 应采取措施如加入适当的掩蔽剂消除干扰 以便提高测定的选择性 例如 用鲁米诺体系测定铬 III 时 加入EDTA 邻菲啰琳可消除Ca2 Mg2 Fe3 Cu2 Co3 等许多金属离子的干扰 43 若用掩蔽剂等简单方法不能排除干扰 可考虑采用色谱等分离技术 各种溶液的浓度 仪器的增益及负高压的选择 温度及发光时间等都会对发光强度产生显著影响 44 六 新技术在化学发光分析中的应用 近年来 新技术在化学发光分析中的应用有很大发展 新的测试方法和新仪器不断出现 色谱与化学发光技术的结合 可以实现试样的多组分测定 化学发光用作色谱柱后检测器 经色谱分离后再进行测定 45 酶反应与化学发光技术的结合 可提供选择性和灵敏性都很好的测定方法 微机在化学发光仪器中的应用 涉及到数据采集 条件优化 光谱贮存和自动控制等多方面 采用微机控制的二极管阵列化学发光光谱仪能够得到化学发光反应时的光谱 适应于一秒内或更短时间就结束的快化学发光反应的光谱测定 46 在新技术的应用上 还应提到的是 无机耦合反应与化学发光反应的配合 这种配合可以使一些不能直接用化学发光法测定的元素和无机物能用化学发光法间接测定 这类方法通常称为无机耦合反应化学发光法 它极大地扩展了化学发光法的应用范围 具有不可估量的发展前景 47 钼 VI 是下面耦合反应的催化剂 H2O2 2I 2H I2 2H2O反应产物I2可以氧化鲁米诺产生化学发光 固定耦合反应进行的时间 此时生成一定量的I2 将该溶液注入鲁米诺的溶液中 测量发光强度 发光强