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第十一章基因组学 20世纪人类科技发展史上的三大创举 90年代人类基因组计划 40年代第一颗原子弹爆炸 60年代人类首次登上月球 一 人类基因组计划的启动1986年诺贝尔奖获得者R Dulbecco 杜尔贝科 提出人类基因组计划 第一节人类基因组计划 美国政府决定于1990年正式启动HGP 预计用15年时间 投入30亿美元 完成HGP HGP逐渐扩展为多国协作计划 参与者包括 美 英 日 法 德和中国 1993年 二 人类基因组计划的进展状况 1 截至1998年10月 完成1 8X108bp 占计划的6 2 完成一系列模式生物全基因组测定 3 DNA测序技术飞速提高1998 5 9J C Venter等宣布 组建商业公司 投入3亿美元 3年内完成 2000 6完成并公布人类基因组工作框架图 90 二000年六月二十六日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成 美国国家人类基因组研究所所长弗朗西斯 柯林斯在介绍情况 人类基因组草图基本信息 由31 65亿bp组成含3 3 5万基因与蛋白质合成有关的基因占2 人类基因组 人类蛋白质 61 与果蝇同源43 与线虫同源46 与酵母同源 同时发表论文美国Science Vol 291 No 5507英国Nature Vol 409 p 860 2001年2月16日 人类基因组 精细图 完成 99 年 月 日 人类基因组序列图亦称 完成图 99 99 提前绘制成功 DAN测序胶图 三 人类基因组计划的科学意义 1 确定人类基因组中约3万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置 利于研究基因的产物及其功能 2 了解转录和剪接调控元件的结构与位置 从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节 4 研究空间结构对基因调节的作用 3 从整体上了解染色体结构 包括各种重复序列以及非转录 框架序列 的大小和组织 了解各种不同序列在形成染色体结构 DNA复制 基因转录及表达调控中的影响与作用 5 发现与DNA复制 重组等有关的序列 6 研究DNA突变 重排和染色体断裂等 了解疾病的分子机制 包括遗传性疾病 易感性疾病 放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程 为这些疾病的诊断 预防和治疗提供理论依据 7 确定人类基因组中转座子 逆转座子和病毒残余序列 研究其周围序列的性质 了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响 可能指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗 8 研究染色体和个体之间的多态性 系Gene和Chromosome二词缩并而成 它可被译为 基因组 或 染色体组 以基因组分析为手段 研究基因组的结构组成 时序表达模式和功能 并提供有关生物物种及其细胞功能进化信息的一门学科 Genome Genomics 第二节基因组分析概述 1 结构基因组学主要涉及从DNA序列水平上来确定基因组结构 代表着基因组分析的起始阶段 结构图谱指某一有机体的完整的DNA序列图谱 2 功能基因组学利用结构基因组学研究所得到的各种来源的信息 建立与发展各种技术和实验模型来测定基因及基因组非编码序列生物学功能的学科 代表着基因组学的新阶段 3 比较基因组学主要涉及不同有机体基因组间的比较研究 基因组学包括三个相互联系的领域 1 确定基因在染色体上的位置及包含的遗传信息 基因组分析的任务 2 分析基因之间的联系 3 分析基因与性状之间的关系 4 基因的组成结构 表达调控等 第三节基因组作图 遗传图谱 转录图谱 cM 序列图谱 物理图谱 kbSTSmap 一 基因图谱 genemap 的类型 1 染色体核型与细胞遗传学图谱 利用染色体的形态结构特征如着丝粒 疖 随体 端粒等进行基因的定位而绘制出的图谱 相关技术 染色体原位杂交 染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的DNA杂交 并在染色体上直接进行检测的分子标记技术 目前发展最快的是荧光素参与的原位DNA杂交技术 即荧光原位杂交 fluorescenceinsituhybridization 技术 简称FISH技术 制备探针 染色体制片 染色体处理与变性 染色体与探针杂交 显微检测 原位杂交技术的基本步骤 染色体专一位点探针 2 遗传连锁图谱 表明两个或两个以上的基因位点间的位置关系和遗传距离的图谱 也称连锁图谱 linkagemap 或遗传连锁图谱 geneticlinkagemap 3 物理图谱 把DNA片段按照实际的物理位置进行排序 通常是指高分辨率的基因组长度片段限制性酶切图谱和重叠克隆图谱 4 转录图谱 也叫 基因图谱 或 基因表达图 基本含义是鉴别人类目前认识的全部基因 包括编码蛋白质的基因和决定各类RNA的基因 5 序列图谱 是基因组计划最实质的内容 是最精密的基因图谱 即它将DNA序列按照遗传图和物理图的标记 确定在基因组中而组合成完整的染色体序列图谱 多态性分子标记是DNA水平上绘制现代遗传图谱的主要路标 landmark 染色体上的基因和DNA顺序均可作为路标 路标具有物理属性 他们由特定的DNA顺序组成 路标位于染色体上的位置是固定的 不会更改的 因而提供了作图的依据 标记1 标记2 标记3 基因组路标 二 分子标记 目前应用的路标 多态性分子标记 RFLP restrictionfragmentlengthpolymorphism 限制性片段长度多态性 RAPD randomamplifiedpolymorphismDNA随机扩增多态性 AFLP amplifiedfragmentlenthpolymorphism扩增片段长度多态性 SSLP simplesequencelengthpolymorphism简单序列长度多态性 SNP singlenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性 SSCP single strandcomformationpolymorphism单链构象多态性 RFLP技术是基于Southern杂交的分子标记的方法 它是指用限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA后 酶切片段长度的差异 这一技术用放射性同位素标记DNA片段作为同源序列探针 RFLP标记 与经限制酶消化并转移到支持膜上的基因组总DNA杂交 通过放射性自显影 或非同位素技术 来显示酶切片段的大小 检测不同遗传位点的多态性 1 RFLP RFLP的特点 1 处于染色体上的位置相对固定 2 遵循孟德尔遗传 3 同一凝胶电泳可显示不同多态性片段 表现为共显性 A B A B 限制性内切酶位点 与放射性探针结合部位 限制性内切酶酶切后 电泳分离DNA片段 转移至硝酸纤维素薄膜 与放射性探针杂交 分析阳性条带 RFLP作图 原理 以基因组DNA为模板 采用随机设计的单个寡核甘酸序列 一般为10nt 为引物 通过PCR扩增 产生不连续的DNA产物 用于检测DNA序列的多态性 2 RAPD 1 不需DNA探针 设计引物也无须知道序列信息 2 显性遗传 极少数共显性 不能鉴别杂合子和纯合子 3 技术简便 不涉及分子杂交和放射性自显影等技术 4 DNA样品需要量少 引物价格便宜 成本较低 缺点 实验重复性较差 结果可靠性较低 RAPD标记的主要特点有 RAPD扩增克隆鱼 B 供体红鲤 A 受体金鱼 D 和杂交鱼 C 即A xD 的细胞核DNA指纹图谱 结果显示 对于不同的引物 克隆鱼的扩增谱带均和供体红鲤的一致 迥异于受体金鱼和杂交鱼 3 AFLP 1 这是一种筛选RFLP分子标记的方法 先将DNA样品采用选定的限制性内切酶 如EcoRI Sau3A 消化 然后加上接头 2 PCR引物设计 根据限制酶接头添加数个向外延伸的碱基 然后向3 方向延伸1 3个不同的碱基 3 选择不同的引物扩增样品DNA 经聚丙烯胺凝胶电泳分离PCR产物 AFLP的操作程序 第四节 的鸟枪法序列分析技术 一 的鸟枪法测序原理 2000年3月用 全基因组鸟枪法 获得果蝇全基因组序列 二 DNA的鸟枪法测序的主要步骤 1 建立高度随机 插入片段大小为2kb左右的基因组文库 2 高效 大规模的末端测序 3 序列集合 4 填补缺口 Shotgun法序列拼接 SequenceGap 三 的鸟枪法测序的优缺点 优点 速度快缺点 随着所测基因组总量增大 所需测序的片段大量增加 高等真核生物 如人类 基因组中有大量重复序列 导致判断失误 一 比较基因组学 ComparativeGenomics 概念 是基于基因组图谱和测序基础上 对已知的基因和基因组结构进行比较 来了解基因的功能 表达机理和物种进化的学科 第五节比较基因组学及功能基因组学研究 基本完成DNA序列分析的真核生物基因组比较 二 功能基因组学研究1 概念 利用结构基因组学提供的信息 以高通量 大规模实验方法及统计与计算机分析为特征 全面系统地分析全部基因的功能 包括结构注释和功能注释 其中基因组功能注释是功能基因组学的主要研究目标 基因组序列注释 结构注释 通过基因组组成元素的寻找来识别 搜寻基因 也称基因注释 如确定基因组的全部编码区或ORF 功能注释 用最大相似的同源基因的功能注释咨询序列 用元件 MOTIF 搜索 元件往往是功能相关的保守序列 直系同源簇方法 即用不同种族的基因成对相似聚类法把它们划分成各种直系同源簇 从而可以用同一簇中的已知基因来注释未知基因 以近缘物种EST搜索 注释 2 基因功能的研究方法 1 基因转导技术 导入细胞 观察功能 该方法用的最多 技术最成熟 2 基因打靶 genetargeting 通过DNA定点同源重组 改变基因组中的某一特定基因 在生物活体内研究该基因的功能 基因敲除 geneknockout 定向敲除基因敲入 geneknockin 定向替代 3 RNA干涉 RNAinterference RNA干涉是在演化中保留下来的一个过程 通过该过程 双链RNA诱导目标基因沉默 RNAi过程 1 RNAi的起始是dsRNA被剪切成siRNA 此步骤需要ATP提供能量 2 随后这些siRNA被组装成无活性的蛋白复合体 3 消耗ATP的能量 siRNA解链将无活性的复合体转变成活性形式 4 最后 在无需或少量ATP的帮助下 该复合体以siRNA为指导 识别并切割互补的靶RNA RNA干涉 siRNA组装的蛋白复合体被命名为RISC RNA inducedsilencingcomplex 第一步中siRNA产生的关键酶是Dicer 属于双链RNA特异内切酶RNaseIII家族 siRNA特征 21 25nt 双链 5 磷酸化 这是必要的 3 为羟基末端且有两个不配对核苷酸 此结构形式可能对siRNA进入蛋白复合体是必须的 4 DNA芯片技术应用之一 基因表达谱 geneexpressionpattern BiologicalSample FunctionalInformation 红色上调黄色不变绿色下调 核酸杂交技术是基因芯片应用的基础 其基本原理是将一系列的核酸片段固定在芯片载体上作为固相靶片段 target 待测的核酸片段人工标记上不同的荧光 或同位素等作为探针 probe 一定条件下两者杂交 根据杂交后不同的信号即可获得靶片段的信息 进行计算机分析 Northern杂交 DotBlot杂交