微生物限度检查方法验证方案.doc

页 码：第 12 页 共 12 页文件编码：ZYCWJ-TS-07156-01版 本 号：01题 目：微生物限度检查方法验证方案页 码： 第1页，共12页文件编码： ZYCWJ-TS-07156-01起草部门：质量管理部版本号：01标题微生物限度检查方法验证方案起草人起草时间审核人审核时间批准人批准时间颁发部门质量管理部生效日期分发部门份数 质量管理部 生产部 设备部 物料部 行政人事部 销售部 财务部 变更记载：修订号批准日期执行日期变更原因微生物验证实施小组主要成员：部 门质量管理部质量管理部质量管理部质量管理部质量管理部姓 名职 位验证领导小组审查汇签：姓 名部 门职务或岗位签字日期企业负责人质量管理部经理生产部经理设备部经理质量管理部QC主管质量管理部QA主管物料部经理1 概述药典微生物限度检查法中要求在建立药品的微生物限度检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。所以对感冒灵颗粒微生物限度检查进行方法的验证。2 目的为了保证检验质量，对所用的检验方法必须经过验证，才能确保检验结果的准确可靠。3 适用范围 本方案适用于感冒灵颗粒微生物方法学的确认与验证。4 验证人员职责4.1 验证小组:组长：质量管理部经理 成员：QC主管、微生物操作人员4.2 职责及分工：QC主管组织起草该验证方案，并组织实施该方案；微生物操作人员具体实施该方案；质量管理部经理协助和监控该方案的实施。4.3 验证方案批准后，应进行培训。由验证小组指定人员负责对小组成员及和验证有关的人员进行培训。5 验证依据中国药典2015年版通则“1105”、“1106”6.感冒灵颗粒微生物限度检验方法验证风险分析序号项目潜在的风险分析潜在的失败后果原因分析严重程度发生频次风险等级措施结果采取的措施严重程度发生频次风险等级1验证方案编写人员编写人员未按照ZYCWJ-SOP-10008-01微生物限度检查法标准操作规程编写方案。验证方法错误，导致验证结果不可靠。人员培训考核不到位F2P3ALARP对验证编写人员进行培训和考核，合格后方可编写F2P5ACC（可接受）2试验人员试验人员未按照编写的验证方案进行操作操作不正确，导致试验结果不可靠人员培训考核不到位F2P3ALARP按照验证方案进行培训，培训合格后方可操作F2P5ACC（可接受）3培养箱、净化工作台仪器未经校验或不在校验期内。导致检验环境和培养环境不符合要求，最终导致验证失败。使用人员使用前未对校验期进行检查F2P3ALARP设备人员使用前对设备进行检查。F3P5ACC（可接受）4干热灭菌烘箱、压力蒸气锅仪器未经校验或不在校验期内。导致试验结果出现异常。使用人员使用前未对校验期进行检查F2P3ALARP设备人员使用前对设备进行检查。F3P5ACC（可接受）5对照培养基、检查用培养基、检定菌对照培养基、检查用培养基、检定菌失效导致验证失败使用前未对对照培养基、检查用培养基、检定菌有效期进行核查。F2P3ALARP对管理人员进行培训，严格按照ZYCWJ-SMP-10020-00培养基及检定菌管理规程进行管理，使用前使用人对有效期进行确认。F3P5ACC（可接受）6培养基、缓冲液、消毒剂培养基、缓冲液、消毒剂配制不正确导致验证失败严格按照标准要求制备缓冲液和消毒剂F2P3ALARP对实验人员进行验证培训F3P5ACC（可接受）7灭菌器具、洁净服已灭菌器具和洁净服过效期导致验证失败使用前未对已灭菌器具和洁净服有效期进行确认F2P3ALARP使用前对已灭菌器具和洁净服有效期进行确认F3P5ACC（可接受）8验证方法不正确1、 验证方案编写不正确；2、 未严格按照验证方案开展验证工作导致验证失败验证方案未经批准F3P3ALARP对验证方案进行审核F3P5ACC（可接受）9控制菌检验结果不合格实验组无菌落生长，供试品可能有抑菌性导致验证失败1、供试品可能对试验菌存在抑制作用2、检验员判断失误。F2P3ALARP采用培养基稀释法消除抑菌性F3P5ACC（可接受）10实验组菌种回收率不达标各试验组回收率低于或高于标准范围导致验证失败1、供试品可能对试验菌存在抑制作用2、检验人员计数错误。F2P3ALARP采用培养基稀释法消除抑菌性F3P5ACC（可接受）11样品储存环境样品储存环境、温度异常。导致样品被污染或失败样品存放不当F2P3ALARP严格控制样品存放环境的温湿度F3P5ACC（可接受）12洁净区环境1、洁净区温湿度、压差异常2、洁净区环境被污染导致验证失败1.洁净区温湿度、压差控制不当2.未定期对洁净区进行清洁和消毒；3.未定期监测洁净区的环境F2P3ALARP1. 每天定期监察洁净区的温湿度；2. 按照SOP规定对洁净区进行消毒；3. 严格按照洁净度监测管理规程对洁净区环境进行监测。F3P5ACC（可接受）6.1 结果分析：通过以上采取的措施，风险均控制在可接受范围内。7. 人员培训确认表培训时间培训内容培训对象培训地点培训讲师主办部门被 培 训 人 员 签 名序号姓名部门及岗位QA主管QC主管设备部经理设备管理员生产部经理质量管理部QC检验员质量管理部QC检验员质量管理部QC检验员质量管理部QC检验员8.验证方法6.1 仪器及设备名称仪器及设备名称型号生产厂家是否校验备注生化培养箱是 否恒温培养箱是 否净化工作台是 否超净工作台是 否立式压力消毒器是 否立式压力灭菌器是 否6.1验证用样品： 感冒灵颗粒 规格： 批号：感冒灵颗粒 规格： 批号：感冒灵颗粒 规格： 批号：6.2 验证用培养基： 胰酪大豆胨琼脂培养基 生产厂家： 批号： 配制批号：沙氏葡萄糖琼脂培养基 生产厂家： 批号： 配制批号：营养琼脂培养基 生产厂家： 批号： 配制批号：胰酪大豆胨液体培养基 生产厂家： 批号： 配制批号：沙氏葡萄糖琼脂培养基 生产厂家： 批号 ： 配制批号：麦康凯液体培养基 生产厂家： 批号 ： 配制批号：麦康凯琼脂培养基 生产厂家： 批号 ： 配制批号：6.3验证用菌种:金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26 003）、大肠埃希菌（CMCC(B)44 102）、枯草芽孢菌（CMCC(B)63 501）、白色念珠菌（CMCC(F)98 001）、黑曲霉菌（CMCC(F)98 003）6.4菌液制备：6.4.4取经3035培养1824小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌营养肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至105107为不大于100cfu/ml备用。6.4.2取经2025培养23天的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至105为不大于100cfu/ml备用。6.4.3将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，2025培养57天，使大量的孢子成熟。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液无菌试管内用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至，制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。6.4.4 上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28，可在24内使用。6.5供试液制备:取样品10g，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，为1：10供试液。7.计数方法的验证：7.1 需氧菌、霉菌及酵母菌计数（平皿法）所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性检查。7.2试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液、混匀，使每1ml供试液或每张滤膜过滤的供试液中含菌量不大于100cfu。7.2.1取的供试液9.9ml和小于10000cfu的铜绿假单胞菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。7.2.2取的供试液9.9ml和小于10000cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。7.2.3取的试液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。7.2.4取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。7.2.5取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。7.2.6取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于2025倒置培养5天点计菌落数。平行制备2个平皿。7.2.7取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于2025倒置培养5天点计菌落数。平行制备2个平皿。7.3 菌液组7.3.1取小于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。各平行制备2个平皿。7.3.2取小于100cfu的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基各1520ml，混匀，凝固，于2025倒置培养5天点计菌落数。各平行制备2个平皿。7.4 供试品对照组7.4.1取的供试液1ml，注入平皿中，分别立即倾注1520ml温度不超过45胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，胰酪大豆胨琼脂培养基3035倒置培养3天点计菌落数，沙氏葡萄糖琼脂培养基2025倒置培养5天点计菌落数。各组平行制备2个平皿。7.4计算公式：稀释剂对照组的回收率= 稀释剂对照组菌落数-供试品对照组菌数 100% 菌液组菌落数 试验组菌数回收率= 试验组菌落数-供试品对照组菌数 100% 菌液组菌落数 7.5 判定标准：实验组、稀释剂对照组的菌数回收率应在0.52之间。若各试验菌的回收率均符合规定，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。7.6试验结果表1 平皿法验证结果1# 批号： 实验组别 试验菌种供试液对照组菌液组菌数试验组菌数回收率（%）1号2号1号2号金黄色葡萄球菌大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌黑曲霉白色念珠菌表2 平皿法验证结果2# 批号： 实验组别 试验菌种供试液对照组菌液组菌数试验组菌数回收率（%）1号2号1号2号金黄色葡萄球菌大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌黑曲霉白色念珠菌表3 平皿法验证结果3# 批号： 实验组别 试验菌种供试液对照组菌液组菌数试验组菌数回收率（%）1号2号1号2号金黄色葡萄球菌大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌黑曲霉白色念珠菌结果说明：8.控制菌检查方法验证（1）大肠埃希菌 取1：10供试液10ml两份，分别加入两瓶100ml胰酪大豆胨液体培养基，其中一瓶加入1ml大肠埃希菌液（不大于100cfu/ml）为试验组；一瓶为供试品；另取一瓶100ml胰酪大豆胨液体培养基加入10ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为阴性对照。取上述培养物1ml，接种至含100ml麦康凯液体培养基内培养，4244培养2448小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上3035培养1872小时。表10 大肠埃希菌常规法验证结果1# 批号：步骤实验组阳性对照组阴性对照组胰酪大豆胨液体培养基，3035培养1824小时麦康凯液体培养基，4244培养2448小时取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，3035培养1872小时。若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验,确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判未检出大肠埃希菌。表11 大肠埃希菌常规法验证结果2# 批号：步骤实验组阳性对照组阴性对照组胰酪大豆胨液体培养基，3035培养1824小时麦康凯液体培养基，4244培养2448小时取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，3035培养1872小时。若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化