土壤中分解尿素的细菌分离和计数PPT课件

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 微生物的培养与应用 分离产生脲酶的细菌 尿素 CO NH2 2 重要的农业氮肥 只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用CO NH2 2 H2OCO2 2NH3 课题背景 课题目的 土壤中尿素分解菌的分离与计数 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土样中究竟含有多少这样的细菌 思考 PCR技术要求使用耐高温的DNA聚合酶 这种酶要能忍受93 左右的高温 如果请你来寻找这种耐高温的酶 你会去哪里寻找 A 土壤中B 海水中C 热泉中D 冷库中 C 如何寻找耐高温的酶 寻找高温环境 原理 热泉70 80 的高温条件淘汰了绝大多数的微生物 使得耐热的Taq细菌脱颖而出 选出耐高温细菌后 从耐高温菌种中提取耐高温酶 1 自然界中目的菌株的刷选原理 一 筛选菌株 2 实验室中筛选微生物的原理 纯且活的菌种 在寻找目的菌株时 要根据它对生存环境的要求 到相应的环境中去找 人为提供有利于目的菌株生长的条件 包括营养 温度 pH等 同时抑制或阻止其他微生物生长 KH2PO41 4gNaHPO42 1gMgSO4H2O0 2g葡萄糖10 0g尿素1 0g琼脂15 0g将上述物质溶解后 用蒸馏水定容到1000mL 该培养基的配方中 为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质 此配方能否筛选出分解尿素的细菌 为什么 碳源 葡萄糖 尿素 氮源 尿素 能 只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存 3 方法 利用选择培养基分离 选择培养基 允许特定种类的微生物生长 同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基 1 在培养基中加入某种化学物质 利用选择培养基分离微生物的方法 例如 加入青霉素可以分离出 加入高浓度的食盐可以得到 酵母菌和霉菌 金黄色葡萄球菌 这里的加入是在培养成分的基础上加入 2 改变培养基中的营养成分 例如 缺乏氮源时可以分离 尿素作为唯一氮源时 可以分离出石油作为唯一碳源时 可以分离出 固氮微生物 能消除石油污染的微生物 能分解尿素的细菌 3 改变微生物的培养条件 例如 将培养基放在高温环境中培养可以得到 耐高温的微生物 本课题使用的培养基的配方如下 请分析后回答 1 在该培养基的配方中 为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是 和 2 该培养基为 培养基 按物理状态分 理由是 3 想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用 如果具有 又是如何进行选择的 葡萄糖 尿素 固体 有凝固剂琼脂 有选择作用 此配方中尿素是唯一氮源 因此 只有能够利用尿素的微生物才能够生长 二 统计菌落数目 1 方法 常用稀释涂布平板法统计活菌的数目 原理 当样品的时 培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的 为了保证结果准确 一般选择菌落数在统计 通过统计平板上的菌落数 就能推测出样品中大约含有多少的活菌 要求 30 300个菌落的平板 稀释度足够高 一个活菌 例 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数 从对应稀释倍数为106的培养基中 得到以下两种统计结果 1 甲同学在该浓度下涂布了一个平板 统计的菌落数为230 2 乙同学在该浓度下涂布了A B C三个平板 统计的菌落数分别为21 212 256 该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果 你认为这两位同学的作法正确吗 如果有问题 错在哪 甲 没有重复实验 至少涂布3个平板 乙 A组结果误差过大 不应用于计算平均值 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数 在对应稀释倍数为106的培养基中 得到以下几种统计结果 正确的是 A 涂布了一个平板 统计的菌落数是230B 涂布了两个平板 统计的菌落数是215和260 取平均值238C 涂布了三个平板 统计的菌落数分别是21 212和256 取平均值163D 涂布了三个平板 统计的菌落数分别是210 240和250 取平均值233 因为当两个或多个细胞连在一起时 平板上观察到的只是一个菌落 因此统计结果一般用菌落数表示 平均菌落数 涂布的稀释液体积 稀释倍数 缺点 操作复杂 实验结果有一定的误差 统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 每克样品中的菌株数 C V XMC 某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V 所用稀释液的体积 M 稀释倍数 计算公式 显微镜直接计数 优点 缺点 计数方便 操作简单 死菌 活菌都计算在内 统计结果比实际值偏大 统计菌株数目 1 产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是 A一个细菌 液体培养基B许多细菌 液体培养基C一个细菌 固体培养基D许多细菌 固体培养基2 某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为215 那么每毫升样品中菌落数是 涂布平板时所用稀释液的体积为0 1ml A2 15 108B2 15 109C215D21 53 下列有关检测土壤中细菌总数实验操作的叙述中 不正确的是 A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨 高温 高压灭菌后道平板B取104 105 106倍土壤稀释液和无菌水各0 1ml涂布不同平板C将实验组和对照组平板倒置 37 恒温培养24h 48hD确定对照组无菌后 选择菌落数在300以上的平板进行计数 C B D 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中 从对应稀释倍数为106的培养基中 A B两同学分别得到以下两种统计结果 1 A同学筛选出150个菌落 2 B同学筛选出50个菌落 B认为A的培养基被杂菌污染了 或培养基中混入了其他含氮物质 因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长 A确认自己的操作无误 但也拿不出能令人信服的证据 请你帮助A同学改进实验 提供具有说明了的证据 方案1 其他同学用A同学的土样进行实验 方案2 A同学以不接种的培养基作为空白对照 2 增加实验说服力的措施 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响 提高实验结果的可信度 设置重复 排除偶然因素对实验结果的影响 在培养过程中同一稀释度下应涂布至少3个平板 才能增强说服力和准确性 设置对照 若对照的培养皿中无菌落生长 说明 方法 方法 观察培养物中是否有杂菌污染 如空白对照组 培养基未被杂菌感染 培养基混入其他杂菌 若实验的培养基菌落数偏高或者菌落形态多样 说明 若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目 说明 观察选择培养物是否具有选择作用 如完全培养基对照组 选择培养基具有筛选作用 距地表约3 8cm土壤层 三 实验设计 1 实验流程 2 操作流程 1 土壤取样 取样原因 土壤要求 取样部位 土壤 微生物的天然培养基 含有大量的微生物 数量最大 种类最多 富含有机质 pH接近中性且潮湿 测细菌数 测放线菌 测真菌数 2 样品稀释 稀释原因 稀释标准 稀释倍数 样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目 选用一定稀释范围的样品液进行培养 保证获得菌落数在30 300之间 便于计数 一般用104 105 106稀释液 一般用103 104 105稀释液 一般用102 103 104稀释液 思考 为什么分离不同的微生物要用不同的稀释度 土壤中各类微生物的数量不同如果是第一次做这个实验 稀释倍数的范围可以放宽103 107 1 关于土壤取样的叙述 错误的是 A土壤取样 应选取肥沃 湿润的土壤B先铲去表层土3 8cm左右 再取样C取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D应在火焰旁称取土壤2 下列关于 土壤中分解尿素的细菌的分离 实验步骤排列正确的是 土壤取样 称取10g土壤加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中 吸取0 1ml进行平板涂布 依次稀释至101 102 103 104 105 106 107稀释度A B C D C C 三 微生物的培养与观察1 接种 用适当的稀释液涂布平板2 培养 细菌 30 37 1 2d 放线菌 25 28 5 7d 霉菌 25 28 3 4d 3 观察 a 每24h统计一次菌落数目b 以 稳定菌落 为观察对象 四 鉴定 筛选后必鉴定鉴别培养基 不影响微生物的生存酚红培养基 鉴定分解尿素的细菌 原理 脲酶催化尿素分解成氨 培养基碱性增强 酚红变红 为了调查某河流的水质状况 某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量 并进行了细菌分离等工作 回答下列问题 1 该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量 在涂布接种前 随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间 这样做的目的是 然后 将水样稀释100倍 在3个平板上用涂布法分别接入稀释液 经适当培养后 3个平板上的菌落数分别为39 38和37 据此可得出每升水样中的活菌数为 2 该小组采用平板划线法分离水样中的细菌 操作时 接种环通过灭菌 在第二次及以后的划线时 总是从上一次划线的末端开始划线 这样做的目的是