胰蛋白酶活性测定

实验一胰蛋白酶活性测定实验目的 ：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。实验原理 ：胰蛋白酶相对分子量23.7kd，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的 肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的n- 苯甲酰 -l- 精氨酸乙酯（n-benzuyl-l-argine ethyl ester, baee）水解为h- 苯甲酰 -l- 精氨酸（ ba ）。胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物ba 对 253nm的光吸收远大于baee ，因此可以在实验起始点把253 nm的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。酶活单位定义 ：在底物baee 浓度 1m mol/l ，光程 1 cm ，波长 253nm ，温度 25 0c ，测量体积 3ml,. 条件下吸光值每分钟递增0.001 （a/min=0.001）为 1 个 baee 酶活单位。胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般e 1% 表达。这个值的含义是：浓度为1%酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm的消光值。不同厂家、不同产品的e1%值有很大差别。e1%值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制e1% 的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的 e 1% 的测定值配制溶液。在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用sigma公司生产的产品, 生产公司对展品的描述是对精品资料280nm紫外吸收值15.3 ， 配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。器材以试剂： 器材 ， 电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂：标准胰蛋白酶，n-苯甲酰-l- 精氨酸乙酯， hci, tris 。1胰蛋白酶活性测定：1）配制 e1%的胰蛋白酶溶液每组取 e1% =15.3的 胰蛋白酶样品10mg放到 1ml 去离子水中， 充分溶解后， 放入冰中保存。2) 按照表 1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液.3) 按照表 1 的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。表 1 胰蛋白酶活性测定加样顺序试剂步骤1 ：空白调零步骤 2：样品测定0.1 mol/l tris-hcl缓冲液 ,ph 8.0 ,1.5 ml1.5 ml2.0 m mol/l baee1.5 ml1.5 ml250 c 预热 5min25 0 c 预热 5min胰蛋白酶 : 10mg/ml蒸馏水0l10l10l0l充分摇匀充分摇匀步骤 1 ：a 253 nm /min调 0-步骤 2 ：a 253-nm /min-记录在步骤 2 样品测定中， 加入酶液后立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次， 共读 3 4min 。测得的结果要使a 253nm /min 控制在 0.05 0.100之间为宜， 若偏离此范围则要适当增减酶量（ 5 l - 20l 之间， 空白试验相应增减等体积水）后重新测定，一直到a253nm /min 值落在 0.05 0.100 之间为止。3 分别求算：1) 标准胰蛋白酶溶液（浓度10mg/ml ）的酶活和比活：计算方法：i)胰蛋白酶活性单位数计算：ii) 胰蛋白酶比活计算: ( 用 baee 单位数 /mg 胰蛋白酶表示比活)实验二 胰蛋白酶动力学测定实验目的 ：初步掌握以下几个酶动力学参数测定与求算方法：米氏常数km, 最大反应速度vmax,转换数cat, 特异性常数cat,/km 。实验原理 ：已知胰蛋白酶遵守米氏方程，可以通过测定底物浓度与反应速度间的关系测定与求算这个酶的诸动力学参数。 胰蛋白酶可以水解碱性氨基酸的羧基所生成的肽键、 酰胺建和酯键。在本实验中，利用胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质，以苯甲酰 -l- 精氨酰 -对硝基苯胺（ bapa ） 作底物测定这个酶的动力学参数，反应式如下：反应最适ph8.1, 最适温度 25 0c。反应产物之一：对硝基苯胺(p-nitroaniline， 4 -na) 呈黄色， 对 405nm波长光的摩尔吸光系数为9870 ，但底物bapa和另一个产物ba 对 405nm波长的光基本不吸收，因此本实验测定光波的波长设在405nm上，把起始反应的吸光值调为0，记录消光值的变化。l-bapa 最大浓度低于 5 10 4 mol/l 时这个酶促反应符合米氏方程，可用 hanes 作图法求动力学参数。 hanes 作图法是单倒数作图法，把米氏方程变形为：在实验中设定一系列底物浓度s i ，测定每一个底物浓度条件下的反应速度i,然后用 si/i 对si 作图，可以得到一条线段，线段在y 轴的截距是km/vmax , 线段的延长线在x 轴的截距是-km ，据此可以得到km 和 vmax 值；cat= vmax /e t。et是酶的初始浓度，已在实验设定为已知 ,因此cat 可以得出；特异性常数km/cat 可根据上述已知数计算出来。器材与试剂：器材 ： 756 紫外 -可见分光光度计，恒温水浴锅，分析天平，秒表，容量瓶，移液器。试剂：1 0.1mol/l ph8.1的 tris-hci缓冲液（含0.4%cacl 2 ）：取 0.2mol/l tris （ mr=121.14 ）100ml与 0.2mol/l hci 52.4ml混匀，加入0.8gcacl 2,蒸馏水定容到200ml （ph 值需用计ph 校正）。2 1mmol/l dl-bapa（ mr=434.9 ）水溶液 ：称取 43.49mg bapa，蒸馏水溶解并加热到80 0c 以上，完全溶解后置冰水中冷却，定容到100ml 。 这个浓度为1mmol/l的 dl-bapa溶液命名 为第六组母液，按照逐步稀释原则配制下列溶液浓度系列：0.8m mol/l（第五组母液，25ml ）； 0.6m mol/l（ 25ml ，第四组母液） ；0.4m mol/l（ 25ml ，第三组母液） ；0.2 m mol/l（ 10 ml ， 第二组母液） ；0.1 m mol/l（ 10ml ，第一组母液） 。3. 60% （ v/v）乙酸溶液4. 胰蛋白酶溶液，该酶的比活1.010 4 baee单位 /mg 蛋白实验步骤：1. 计算胰蛋白酶加样体积：在本实验中加入胰蛋白酶的量是60g，实验1 已经测到胰蛋白酶的比活和浓度（g/l），根据这些值计算加入体系的酶液体积的l 数。2. 实验溶液系统：本实验有6 组实验组成。实验顺序按照表2 的加样程序执行。表 2.测定 km和vmax 值加样表组bapa加入bapa 母加入加入加入反应体系底物母液浓度液tris-hci胰蛋白酶60% 乙酸bapa 浓度a 405（ m mol/l ）（ ml ）（ ml ）（ l）（ ml）（ m mol/l ）1.0.1样品 1,2.01.5n0.4s1 0.05对照 1,2.01.600.420.2样品 2,2.01.5n0.4s2 0.1对照 2,2.01.600.430.4样品 3,2.01.5n0.4s 3 0.2对照 3,2.01.600.440. 6样品 4,2.01.5n0.4s4 0.3对照 4,2.01.600.450.8样品 5,2.01.5n0.4s5 0.4对照 5,2.01.600.461 .0样品 6,2.01.5n0.4s6 0.5对照 6,2.01.600.425 0c保温 5 min后，摇匀，秒表计时，准确反应2min 后加入 0.4ml 60%的乙酸溶液，摇匀终止反应。 反应溶液总量应达到4ml, 不足部分可加蒸馏水补足。对照试管不加入胰蛋白酶，只加入 0.4ml 60% 的乙酸溶液。 最后分别记录样品和对照的a405值，每组种两者的差值a405 代入下式即可得到对应于s i 的 i表 2 列出的是6 个实验，鉴于目前实验室尚没有12 个枪头的加样，所以每一个实验都可独立进行。需要特别注意：1） 比活大于1.0104 baee u/mg protein的胰蛋白酶制剂，纯度范围是90%-100% ，一般可达到 95%-97% 。在计算动力学参数时，如无特殊精确要求，可按照胰蛋白酶100% 的近似值计算。在本试验中， 可根据浓度胰蛋白酶浓度10mg/ml ， 纯度 100%,每个试管要求加入质量数60g， 计算出每个试管加入的胰蛋白酶溶液微升数。2） 在进行动力学参数计算时，要进行胰蛋白酶质量-摩尔数转换，如无特殊要求，也可以把胰蛋白酶纯度近似为100%.3） 如果有求精确, 但产品说明没有给出胰蛋白酶在固形物中的百分含量，就需配制一定浓度的固形物溶液，首先测定蛋白质浓度，通过求算蛋白质总量，得到蛋白质在酶制剂中的重量比。然后通过双向电泳，图像扫描，把扫描结果输入计算软件，按照软件步骤，求算胰蛋白酶在全部蛋白样品中的百分比。把实验设定的每一个si 和测定到的对应的vi 换算成 si/vi 后,填入表 3，作图求 km ， vmax表 3.hanes作图的数据 si/i :s 1/1s 2 /2s 3 /3s 4 /4s 5/5s 6/6si :s 1s 2 s 3 s 4s 5s 6 用s/对s 作图可得到一条线段，线段与轴的截距是km/vmax ，线段延长线与