实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点

等电点聚焦测蛋白质等电点一实验目的1. 了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。二实验原理等电点聚焦（ ief）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，ief 实质就是在稳定的 ph 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后， 由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的ph 梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的 ph 梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0 的区带， 这时的 ph 则是这种分子的 pi 。聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。一旦偏离其等电点后，由于ph 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pi 迁移。因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pi 处得以“聚焦。”三实验步骤1. 凝胶制备按表 1 的比例配制 4ml 工作胶液，在真空干燥器中抽气10min 。每组 4 管，每管加胶液 1.8ml 。混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部 1cm 处，在胶面上再覆盖3mm 厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置 20 30min 即可聚合。凝胶母液（丙烯酰胺30% ：甲叉双丙烯1ml表 1 凝胶工作液配比精品资料酰胺 0.8% ）10% 过硫酸铵0.02ml水2.68ml载体两性电解液0.15ml蛋白样品液0.1ml,0.05mltemed0.02ml2. 电泳吸去凝胶柱表面上的水层， 将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。于电泳槽下槽加入 0.2 的 500ml 硫酸作正极；上槽加入 0.5 的 800ml 乙醇胺作负极打开电源， 将电压恒定为 300v ，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中， 电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min后，停止电泳，全程约需3h 。3. 剥胶电泳结束后， 取下凝胶管， 用水洗去胶管两端的电极液， 按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾，”正极端呈酸性，负极端呈碱性。剥离后，量出并记录凝胶的长度。4. 固定取其中的凝胶条3 根置于一个小培养皿内，倒入10% 放在三氯乙酸固定液中固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液 用直尺量出胶条长度l1 和正极端到蛋白质白色沉淀带中心，即聚焦部位的长度l2。5. ph 梯度的测量切段法：将未经固定的1 根胶条，按照从正极端 (酸性端)到负极端 (碱性端)的顺序切成相等的 10 段，按次放人有标号的、装有0.0lm 氯化钾的试管中，浸泡过夜。然后用 ph 计测出每管浸泡液的ph 并记录。四实验结果2.ph 梯度表及其相应标准曲线1.凝胶条的长度及染色蛋白带的位置凝胶条编号固定前的长度17.8cm27.8cm347.7cml07.4cm固定后的长度l17.7cm7.8cm7.4cm蛋白带距酸端距离 l21.3cm1.4cm1.3cm未染色，测 ph梯度蛋白质距正极实际长度 ls1.32cm1.4cm1.3cm标号12345678910长 度/cm0.770.770.770.770.770.770.770.770.770.77ph3.053.725.046.767.247.998.629.5810.110.1值48蛋白质样品等电点的计算：蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度=固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 *固定前凝胶条长度 / 固定后凝胶条长度则将上述数据代入ls=l 2* l 0l1，求出蛋白质距正极实际长度ls 分别为 1.3cm 、1.4cm 、1.3cm 。由凝胶条 1、2 和 3 及其相应蛋白带距离可计算出蛋白带距酸端的平均距离： (1.3+1.4+1.32)/3=1.34计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后， 直接从 ph 梯度曲线上求出该蛋白质等电点。得出其标准公式为： y = 0.8372x + 2.6273则待测蛋白质的等电点为0.8372*1.34+2.6273=3.75五实验分析及讨论（1）实验结果测得的样品蛋白的等电点为 3.75 ，通过查常见蛋白质等电点参考值表格可知， 其为-卵黄脂磷蛋白。 由于记录凝胶长度及蛋白质距正极的距离存在读数误差，所以也可能是伴花生球蛋白（ 3.7-5.0 ）。（2） ）等电点聚焦测蛋白质等电点分辨率高，可将等电点相差 0.01 0.02ph 单位的蛋白质分开。 不像一般电泳易受扩散作用影响， 使区带越走越宽； 聚焦电泳则能抵消扩散作用，使区带越走越窄。同时，很稀的样品也可以聚焦而浓缩，实验操作起来也简单方便。（3） ） 其存在其不足之处是在实验操作过程当中，读数的取值、样品溶液是否含盐、在等电点时蛋白质是否溶解或变性，都会影响实验结果。 因为盐会增大电流量，产生热量；