λ噬菌体载体

噬菌体载体噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。是一种中等大小的温和噬菌体。迄今已经定位的噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为噬菌体的非必要的基因。 一噬菌体的分子生物学概述（1）噬菌体基因组的结构在噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核劳酸组成的彼此完全互补的5单链突出序列，即通常所说的粘性末端。注入到感染寄主细胞内的噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5-P和3-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之意）（如图）。在环化的状态下，噬菌体DNA分子的长度为48 502碱基对。（2）噬菌体DNA的复制在噬菌体感染的早期，环形的 DNA分子按形式从双向进行复制。到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的人基因组oxA组成的长多连体分子。（3）噬菌体DNA的整合与删除噬菌体基因组的整合作用，是通过它的附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现的。整合作用需要int基因的表达，它是一种可逆的过程。的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和bio基因的协同作用才能实现。（4）噬菌体DNA的转录与转译在溶菌周期，噬菌体DN A的转录是在三个时期，即早期、中期和晚期发生的。大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期；中期基因转录的结果导致 DNA进行复制和重组；晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒。二噬菌体载体的构建及其主要类型（1）构建噬菌体载体的基本原理构建噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。按照这一基本原理构建的噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型：一种是插入型载体（insertion vectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点(如图)。另一种是替换型载体（rePlacement vectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的人 DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代。在基因克隆中的二者的用途不尽相同。插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA(如图)。（2）噬菌体载体的主要类型（i）插入型载体外源的DNA克隆到插入型的载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。插入型的载体又可以分为免疫功能失活的（inactivatiort of immunityfunction）和大肠杆菌-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlon of Ecoli -galactosidase）两种亚型。免疫功能失活的插入型载体：在这类插入型载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。因此，凡带有外源DNA插入的重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。-半乳糖苷酶失活的插入型载体：它们的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其中编码着半乳糖着酶基因lacZ。由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了-半乳糖着酶基因lacZ的编码序列，不能合成-半乳糖昔酶，只能形成无色的噬菌斑。（ii）替换型载体替换型载体又叫做取代型载体（substitution vector），是一类在噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。 NM781便是其中的一个代表。在这个替换型载体中，可取代的EcoRI片段，编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基因）,由于这种NM781噬菌体的感染，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变更被抑制了，能在乳糖麦康基氏（MacConkey）琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑，或是在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。如果这个具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述这两种指示培养基上都只能产生出无色的噬菌斑。用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：第一，应用适当的核酸内切限制酶消化载体，除去基因组中可取代的DNA区段。第二，将上述所得的人 DNA臂同外源DNA片段连接。第三，对重组体的DN A分子进行包装和增殖，以得到有感染性的重组噬菌体。三重组体DNA分子的体外包装（1）重组体DNA分子的转染作用用重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做转染（transfection），它有别于以噬菌体颗粒为媒介的转导（kransduction）。DNA的转染作用，是一种低效的过程。即便是使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的 DNA，其典型的转染效率（即每微克DNA转染产生的噬菌斑数目），也仅为 105106之间。体外连接的结果，转染效率便下降到了104103左右。（2）DNA的体外包装DNA的体外包装作用，在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体。根据体外互补作用研究发现，噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。这就是噬菌体体外包装所依据的基本原理。（图5-8）（3）噬菌体DNA的包装限制问题噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限