核酸的理化特性及其制备检测

核酸的理化特性及核酸的制备、检测,核酸的一般理化性质,1. DNA 的酸碱及溶解度性质 DNA 有磷酸和碱基，为两性大分子，但偏于酸性 可与金属离子成盐，不溶于乙醇或异丙醇2. DNA的高分子性质 粘度： DNA RNA；dsDNA ssDNA 沉降行为：溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉3. 在室温条件下，DNA 在碱中变性，但不水解，RNA水解。,嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键，使核苷、核苷酸及核酸可以吸收紫外光，最大吸收峰位于 260 nm 附近。 用紫外分光光度计测定 DNA 和 RNA 在 260 nm 处的光密度值 (optical density, OD 值) 来定量 DNA 和 RNA。 OD260：单核苷酸 ssDNA dsDNA,核酸的紫外吸收,当下列溶液的浓度为 50 g/ml 时：dsDNAA260 = 1.00ss DNAA260 = 1.37单核苷酸 A260 = 1.60增色效应 (hyperchromic effect),收获携带质粒的大肠杆菌将菌体悬浮在溶液 I (50 mM Tris-Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA; 100 g/ml RNase A) 中加溶液 II (200 mM NaOH; 1% SDS)，5 分钟加溶液 III (3 M KAc, pH 5.5)离心后取上清, 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇离心后取水相, 加 2.5倍体积的乙醇离心后得到 DNA 沉淀, 用 70乙醇洗涤 DNA 沉淀空气干燥 DNA 沉淀, 将 DNA 溶解在 TE (10 mM TrisCl, pH 8.0; 1 mM EDTA, pH 8.0 ) 或 ddH2O 中,质粒 DNA 的制备 (常规方法),悬浮细胞,用 SDS 和 NaOH 裂解细菌，基因组 DNA 及质粒 DNA 发生变性，而质粒 DNA 从细胞中释放出来。,用 KAc 中和 NaOH，质粒 DNA 迅速复性并恢复天然的超螺旋结构; 染色体 DNA 难于复性并与细胞碎片一起沉淀下来。,质粒 DNA 制备试剂盒,(1) A260/A280 值A260：测定质粒 DNA 在 260 nm时的光吸收值A280：测定质粒中所污染的蛋白质在 280 nm 时的光吸收值A260/A280 值表示质粒的纯度:当 A260/A280 1.7 时表示质粒较纯。质粒 DNA 浓度 = A260 x 50 g/ml x 稀释倍数,质粒的鉴定,(2) 质粒的电泳, 建立基因组文库； 克隆特定的基因； 用 PCR 反应检测基因的存在及突变等； 用 Southern 印迹检测某一基因的存在和拷贝数； 用 Southern 印迹进行 RFLP 分析； SNP 分析,可从细菌、细胞或组织中制备基因组 DNA，可用于：,基因组 DNA 的制备,(1) 细胞裂解 蛋白酶 K 和 SDS 可破坏细胞膜及细胞中的蛋白质，使基因组 DNA 从破碎的细胞中释放出来。(2) 蛋白质淬取 用酚/氯仿/异戊醇 (25/24/1) 淬取蛋白质。(3) 基因组 DNA 沉淀 用 0.1 倍体积的 3 M NaAC 和 2.5 倍体积的 100% 乙醇沉淀 DNA, 用 70% 乙醇除去 DNA 沉淀中的盐离子。(4) 将基因组 DNA 溶解在 TE 缓冲液中，使其终浓度为 1 mg/ml，置 4C 保存。,基因组 DNA 的制备方法,哺乳动物基因组 DNA1, 6. DNA/HindIII;2, 3. 大鼠基因组 DNA；4, 5. 小鼠基因组 DNA,基因组 DNA 的检测,细菌基因组 DNA1. 1 Kb Plus DNA Ladder;2, 3. M. sm 基因组 DNA,1 2 3,1 2 3 4 5 6, 纯化 mRNA； 建立 cDNA文库； 克隆特定的 cDNA； 用 Northern 印迹方法检测某一特定基因的表达； 用 RT-PCR 方法检测某一特定基因的表达。,从细菌、细胞或组织中提取总 RNA，可用于：,总 RNA 的制备,TRIzol 试剂中的异硫氰酸胍及十二烷基肌氨酸钠能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，使总 RNA 从细胞中释放出来。,用 TRIzol 试剂处理细胞或匀浆组织氯仿萃取蛋白质沉淀 RNA洗涤 RNA 沉淀用 RNase-free ddH2O 溶解 RNA，并置 -20C保存检测 RNA (加l RNA到% 琼脂糖凝胶中),用 TRIzol 试剂制备总 RNA,rRNA 80%哺乳动物细胞的总 RNA tRNA 和 snRNA 10% mRNA 1-3%,RNA 的检测,用琼脂糖凝胶电泳检测： 哺乳动物细胞总 RNA 中18S rRNA 和 28S rRNA 的大小及强度； 细菌总 RNA 中 16S rRNA 和 23S rRNA 的大小及强度。,不同物种的 rRNA 分子,1. RNA Markers (0.28 - 6.58 kb);2. 小鼠脑组织中的总 RNA;3. 大鼠脑组织中的总 RNA,1 2 3,1. RNA Markers (0.5 - 9.0 kb);2. 大肠杆菌总 RNA,18S rRNA,28S rRNA,16S rRNA,23S rRNA,1.5 kb,3.0 kb,6.58 kb4.98 kb,1 2,1.90 kb1.38 kb,3.64 kb 2.60 kb,0.96 kb0.62 kb,0.28 kb, DNA 或 RNA 分子带负电荷，在电场作用下，DNA 或 RNA 分子由负极向正极移动。 DNA 或 RNA 分子量越大，迁移速率越慢，反之， 分子量越小，迁移速率快。 不同构象的 DNA 或 RNA 分子，迁移速率不同。,DNA 及 RNA 电泳, 用琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定和纯化 DNA 分子。 用变性琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定 RNA 分子。 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 DNA 测序反应中 合成的系列单链 DNA 片段 (5-500 bp)。 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同构象的单链 DNA 分子。,核酸电泳类型, 琼脂糖 (agarose) 是 D- 和 L-半乳糖残基通过 -(13) 和 -(14) 糖苷键交替构成的线状聚合物，琼脂糖凝胶 可形成孔径为 50 nm 到 200 nm 的分子筛。 琼脂糖凝胶的分辨率较低，但分离范围较大。,DNA 琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶浓度与线状 DNA 分子的有效分离范围,1.5-2.0% 琼脂糖凝胶,细胞凋亡时 DNA ladder 的检测,DNA 碱基平面,NH2,C2 H5,H2N,N+,Br-,溴化乙锭 (Ethidium bromide, EB),EB/2.5 碱基,用 EB 检测琼脂糖凝胶中的 DNA, 致突变性低于 EB； 敏感性高于 EB； SYBR Green I 用于 dsDNA 的染色； SYBR Green II 用于 RNA，ssDNA 的染色； 检测方便 SYBR Green I 激发光波长：290，380 和 497 nm； SYBR Green II 激发光波长：254 和 497 nm; 可用紫外光透射仪、可见光透射仪或激光扫描仪检测。,用 SYBR Green 检测琼脂糖凝胶中的 DNA,SYBR Safe DNA gel stain (Molecular Probes) 和 EB 致突变性的 Ames 测试结果,为防止单链 RNA 形成空间结构，需用变性的琼脂糖 凝胶即甲醛-琼脂糖凝胶分离 RNA分子。 为防止外源性 RNase 的污染，所用的倒胶槽、梳子、 电泳槽等需要用 DEPC 或 H2O2 处理；所用缓冲液用 0.1% DEPC 的来配制。 注意：DEPC是潜在的致癌剂，须小心操作。,RNA 琼脂糖凝胶电泳,110X MOPS 电泳缓冲液200 mM MOPS 3-(吗啉代)-丙磺酸, pH 7.050 mM NaAc10 mM EDTA, pH 8.0 使用前，将 10X MOPS 稀释至 1X MOPS2甲醛-琼脂糖凝胶的制备 甲醛的终浓度：7.73电泳前 RNA 样品的处理 用甲醛和甲酰胺等处理 RNA 样品以打开的 RNA 发 夹结构。4电泳结束后用 EB 染色液染色。,关键点, 聚丙烯酰胺凝胶的分辨率较高，可用于分离 DNA 测序 反应中的系列 DNA 片段。 在聚丙烯酰胺凝胶中加入尿素作为变性剂，以确保 DNA 片段保持单链状态并以线状 DNA分子的形式泳动。 大型垂直板电泳或毛细管电泳 电泳缓冲液: 1X TBE,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,核酸的变性与复性及核酸分子杂交,核酸的变性与复性,(一) 变性 (denaturation) 在某些理化因素作用下，核酸分子中互补碱基之间氢键的断裂叫核酸的变性。 DNA 发生变性时，DNA 双螺旋解体，变成两条单链； RNA 发生变性时，其分子内部形成的局部双链被破坏，使 RNA 失去原有的空间结构。核酸变性的方法：加热过量的酸、碱化学变性剂，如尿素、甲醛、甲酰胺,DNA 变性的本质是 DNA 双链间氢键的断裂。,DNA 变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的 50% 时的温度为 DNA的解链温度，又称融解温度 (melting temperature, Tm)。Tm = 69.3 + 0.41 (%G + C),DNA 解链曲线,(二) 复性 (renaturation) 在适当条件下，变性 DNA 的两条互补链重新缔合，恢复天然的双螺旋构象，这一过程称为复性。热变性的 DNA 在缓慢冷却时，可以复性，这一过程也称为退火 (annealing)。,影响 DNA 复性的因素：1. DNA 序列的复杂性 序列越复杂，复性速度越慢。2. 温度 足以破坏单链 DNA 内的氢键并且不影响双链 DNA 间的氢键，通常低于 Tm 的 20-25 C 。3. 盐浓度 盐离子降低两条单链 DNA 的磷酸基团的排斥力。高浓度盐溶液加快复性速度。4. DNA 浓度 DNA 浓度越高，互补链碰撞机会越多，复性速度加快。, 两条互补的 DNA 单链或一条 DNA 单链与其互补的 RNA 链形成双链核酸分子的过程称为核酸分子杂交。 核酸分子杂交通常是指探针 (probe) 与受体 DNA 或 RNA 分子的之间的杂交。 用同位素或非同位素标记的序列已知的核苷酸链 (单链 DNA 或 RNA 分子) 称为探针，用于鉴别、分离基因以及检测基因的表达。,核酸分子杂交,核酸分子杂交类型及特点,(一) 探针的标记1. 同位素标记的探针 常用的同位素为 32P、35S2. 非同位素标记的探针 高度灵敏感; 便于检测 利用显色反应、化学发光法、荧光素、若丹明 (rhodamine) 等检测杂交的探针; 探针稳定，并且可被反复使用多次； 不会危害操作者的健康并且不污染环境； 常用的非同位素标记 地高辛 (Digoxigenin, DIG) 生物素 (Biotin),3DIG 标记探针的方法,(二) DNA/RNA 样品的制备及电泳1. DNA 样品制备基因组 DNA;限制性内切酶酶切基因组 DNA; 用琼脂糖凝胶电泳分离酶切的基因组 DNA2. RNA 样品制备总 RNA;用变性琼脂糖凝胶电泳分离 RNA,(三) DNA/RNA 从凝胶向膜的转移 - 印记 (blotting)转移方法毛细管转移 (Capillary transfer) 在缓冲液中，DNA 或 RNA 从凝胶中被动地转移到膜上， 用于 Southern 印迹和 Northern 印迹。 真空转移 (Vacuum blotting) 真空加快转移速度，用于 Southern 印迹、Northern 印 迹、斑点或狭缝杂交。电转移 (Electroblotting) 电流加快转移速度，适用于聚丙烯酰胺凝胶。,膜支持物(1) 尼龙膜 (Nylon membrane)带正电荷尼龙膜结合 DNA 及 RNA 的能力大于不带电荷的尼龙膜；尼龙膜的耐用性高 ，利于探针的去除 (stripping) 和重新杂交 (reprobing)；适用于底物显色反应和化学发光法检测杂交的探针。(2) 硝酸纤维素膜 (Nitrocellulose membrane)NC 膜结合 DNA 及 RNA 的效率低于尼龙膜；NC 膜的强度低、易碎，不利于探针的去除和重新杂交；适用于底物显色法检测杂交的探针。,毛细管转移,真空转移装置,用于 Southern 印迹和 Northern 印迹,用于斑点杂交 (右) 狭缝杂交 (左),转移缓冲液高离子强度缓冲液 20X SSC (3M NaCl; 0.3M Sodium citrate, pH7.0) 为常用的转移缓冲液；在 DNA 转膜之前，用 NaOH/NaCl 或 20X SSC 等将双链 DNA 分子变性为单链 DNA 分子；在 RNA 转膜之前，用 20X SSC 处理变性的琼脂糖凝胶，以去除凝胶中的变性剂甲醛。,(四) 将 DNA/RNA 固定在膜上的方法1. 干烤 置尼龙膜于抽真空的 120C 烤箱中 2 小时； 置硝酸纤维素膜于抽真空的 80C 烤箱中 2 小时。 2. UV 交联作用 用 UV 将 DNA/RNA 固定在尼龙膜上。,UV 交联仪 (UV Crosslinker),(五) DIG 探针与靶分子的杂交1. 探针浓度 探针浓度过高，膜的背景信号会比较强； 探针浓度太低，杂交信号难以被检测。 杂交前用热变性方法将双链 DNA 探针变性为单链 DNA 探针。2. 杂交条件 杂交条件的严紧性 (stringency) 指杂交反应中避免 探针与有部分互补的序列进行杂交的条件。 严紧性太高，杂交信号会很弱或无杂交信号出现；严 紧性太低，非特异杂交将发生。,影响严紧性的因素 杂交温度：高温增加严紧性；低温降低严紧性。 离子强度：高盐浓度降低严紧性；低盐浓度增加严紧性。 甲酰胺：甲酰胺能够降低 DNA 的溶解温度，因此，降低探针与靶序列杂交的温度。3. 洗膜 将探针与非特异杂交的序列分离，在低盐浓度和高温 (65 - 68C) 条件下完成。,探针与靶分子的杂交,(六) DIG 探针的检测1. 在抗 DIG 抗体上偶联荧光素 用于原位杂交2. 在抗 DIG 抗体上偶联碱性磷酸酶，以碱性磷酸酶催 化的底物显色反应或化学发光反应检测 DIG 探针信 号。(1)