2009CB941600-畜禽肌肉和脂肪发育的分子调控机制研究.doc

项目名称：畜禽肌肉和脂肪发育的分子调控机制研究首席科学家：袁立 厦门大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：教育部一、研究内容 （一）项目的总体设想动物骨骼肌和脂肪细胞的分化、生长和组织发育的调控过程实际上是内在的遗传和表观遗传基础和外在的各种信号分子互作的结果。 目前在该研究中存在的主要问题包括：（1）对组织器官的发育学研究还多半停留在单个基因或单个分子调控作用的水平，从系统、多层次和调控分子之间网络联系开展的研究不足，因而不利于对组织器官的发育从整体和完整过程的角度解析其发育的分子机制；（2）一些调控层次，如表观遗传学、RNA、信号分子、内在代谢与微环境等层次上的研究尚属新兴，缺乏深入研究的资料，因而难以客观把握组织器官系统发育多重控制的机制；（3）对骨骼肌和脂肪发育的研究大多集中在人和实验鼠上，由于有限的物种资源，难以从比较生物学角度全面揭示细胞分化调控网络的发生、发展机制。而且已有的研究多是针对骨骼肌和脂肪代谢疾病有关的发病机理，研究存在一定的局限性。（4）近年来，通过干细胞技术和基因敲除等手段，在大小鼠等经典模式动物的骨骼肌和脂肪发育研究方面取得了一系列的进展，揭示了控制干细胞分化及骨骼肌和脂肪发育的多种重要基因和调控通路。但在猪和鸡上，相应的手段和资料相对不足，尤其是猪、 鸡骨骼肌和脂肪的胚胎干细胞技术还不够成熟，因而多能胚胎干细胞分化为猪、鸡骨骼肌和脂肪前体细胞的分子机制认识不足；其他模式动物大许多数据尚未在猪和鸡上印证，因而不够明了猪和鸡骨骼肌与脂肪发育机制的特点；骨骼肌和脂肪发育表观遗传学方面的研究尚属新兴，因而不能能解析猪和鸡品种品系发育差异的机制。（5）虽然转基因猪和鸡都有成功的报道，但技术方法尚未能达到实际生产应用的要求，也未见涉及针对调控发育基因方面的研究。本项目运用干细胞、功能基因组、非编码RNA、RNA和蛋白组学、信号传导等先进研究手段，采用比较生物学研究策略，分别从基因转录与转录后沉默、DNA与蛋白质修饰，外周信号转导通路等层次深入研究猪和鸡的肌肉和脂肪组织发生、细胞生长和分化过程中，DNA、RNA、蛋白质以及外周信号分子之间互作的调控网络关系和系统发生机制，并在miRNA鸡的培育方面进行攻关，填补发育研究领域的一些不足，可望在猪和鸡等畜禽肌肉和脂肪发育的分子调控理论及其应用方面取得重要突破。基于上述设想，本项目重点解决下列关键科学问题：1、阐明骨骼肌和脂肪胚胎与成体干细胞自我更新和分化的表观遗传学和网络调控机制。着重解决猪、鸡多能胚胎干细胞的分离培养及其诱导向骨骼肌和脂肪细胞分化的技术问题，发掘猪和鸡的各种胚胎与成体干细胞向骨骼肌和脂肪分化过程不同阶段的标记性分子和重要功能基因，揭示这些基因在此过程中的功能与调控机制。2、阐明猪和鸡骨骼肌与脂肪组织细胞发生、分化和生长代谢的遗传、表观遗传及非编码RNA调控的分子机制。在发掘控制猪和鸡骨骼肌与脂肪组织生长与分化重要功能基因和调控通经的基础上，着重解析这些基因的代谢与表观遗传学调控机制；系统分离鉴定与猪、鸡与骨骼肌和脂肪发育相关的非编码RNA，揭示其功能机制，3、阐明品系间骨骼肌和脂肪生长发育差异的分子遗传与调节机制。在阐明不同品种品系猪和鸡的发育规律的基础上，系统比较不同部位组织和品种品系间发育的遗传、表观遗传及非编码RNA调控的差异，揭示猪、鸡种系骨骼肌和脂肪发育特点的分子机制。4、探索miRNA鸡培育的新技术手段。 着重解决提高同源重组、抑制随机整合、去除冗余外源序列的理论与技术问题，构建新型高效的转基因鸡载体，研究改进转基因鸡的技术操作方法，提高转基因鸡获得效率，研究利用 miRNA 对特定基因沉默效率控制技术，建立可用于生产实践的 miRNA鸡的培育技术方法。（二）项目的研究内容本项目将在前期工作的基础上对猪、鸡的肌肉和脂肪发育的分子调控机制展开系统深入的研究，突出表观遗传学的研究，解析猪、鸡的肌肉和脂肪发育关键基因的调控网络，着重研究猪、鸡品种品系肌肉和脂肪发育差异形成分子机制，提升品种资源的利用，重点攻关 miRNA鸡的培育技术方法。本项目的主要研究内容包括以下方面：1、研究与完善猪、鸡肌肉和脂肪胚胎干细胞和各种成体干细胞分离培养与诱导分化的技术体系。包括猪、鸡胚胎期肌肉始祖细胞（MPC）、间充质细胞、骨骼肌卫星细胞和脂肪成体干细胞的体外培养及其自我更新和定向分化的技术方法。2、进行猪、鸡肌肉和脂肪干细胞自我更新与分化和猪、鸡肌肉和脂肪组织发生、生长过程中的分子标志、重要基因的分离鉴定，开展对猪、鸡肌肉和脂肪发育过程的重要基因及其调节通路的功能作用与分子机制研究。包括采用基因表达谱芯片、蛋白质组学等方法，分离鉴定在猪、鸡肌肉和脂肪干细胞分化与组织发育相关的新基因和分子；研究这些基因以及我们在前期工作中得到的相关基因在猪、鸡肌肉和脂肪发育过程中的功能作用及其调节通路。3、研究猪、鸡肌肉和脂肪干细胞分化与组织发育的表观遗传学机制。采用蛋白组学分析技术、Gel-shift技术和ChIP、Solexa测序、甲基化间区位点扩增（AIMS）等技术，研究猪、鸡肌肉与脂肪细胞干细胞分化和组织发育过程中重要调控因子和功能基因的表观遗传学；研究内分泌、旁（自）分泌信号分子对骨骼肌和脂肪干细胞分化、融合（聚酯）的调控作用。4、研究非编码RNA在猪、鸡干细胞分化与组织发育的中的作用。包括在现有工作的基础上，分离鉴定与猪、鸡肌肉和脂肪发育相关的新miRNA，在猪和鸡的组织中，靶向克隆现已知在肌肉与脂肪发育中有调控的miRNA；研究这些miRNA的表达规律，验证其在猪、鸡肌肉和脂肪发育过程中的调节作用，鉴定其作用的靶向基因。5、研究不同品种（系）猪、鸡肌肉和脂肪发育差异形成的遗传与表观遗传学机制。采用比较生物学策略，系统研究不同猪种（瘦肉型外来品种与脂肪型优质地方品种）、鸡种或品系（蛋用型和肉用型、高脂系和低脂系）肌肉与脂肪组织之间重要基因的单核苷酸多态性（SNP分布的数据库）、DNA和组蛋白修饰以及基因表达、miRNA等遗传学与表观遗传学差异。结合各品种猪、鸡不同类型和部位的肌肉与脂肪的生长发育规律，研究这些差异与这些重要经济性状的关系。6、研究miRNA鸡培育技术。研究提高同源重组、抑制随机整合、去除冗余外源序列的转基因鸡载体技术，研究提高转基因鸡获得效率的技术方法。利用 miRNA 对特定基因沉默效率控制的理论和技术，建立起可用于生产实践的 miRNA鸡的培育技术方法。二、预期目标 （一）总体目标凝聚发育生物学、分子生物学和遗传学等学科领域的优秀科研团队，运用功能基因组、RNA和蛋白组学、代谢组学和信号传导等先进研究手段，采用比较生物学研究策略，分别从基因转录与转录后水平的各层次深入揭示猪、鸡肌肉和脂肪组织发生、细胞分化和生长发育过程中，DNA与蛋白质修饰、miRNA调控、外周信号等作用的调控网络关系和系统发生机制，从而阐明肌肉和脂肪生长发育的分子机制; 综合同源重组、miRNA与RNA理论与技术的进展，探索miRNA鸡的培育技术。力争在肌肉和脂肪发育生物学理论的基础研究与应用方面取得重大突破，为我国发育生生物学的发展搭建新的理论研究平台，组建创新型研究团队，整体提升我国本学科领域在国际学术界的地位，推动我国自主创新型医学和畜牧科技的快速发展。（二）五年预期目标1、建立国内最完善的猪、鸡肌肉与脂肪的干细胞库，包括胚胎干细胞和不同组织来源的成体干细胞，建立猪、鸡肌肉与脂肪胚胎干细胞和2种以上成体干细胞诱导分化的优化技术。这一目标的实现将为本相目与国内将后的相关研究提供研究资源与技术方法。2、发掘一批猪、鸡胚胎期肌肉祖细胞（MPC），以及骨骼肌和脂肪成体干细胞（骨骼肌卫星细胞和脂肪前体细胞）自我更新和分化过程中的标志性分子与重要功能基因，阐明内分泌、旁（自）分泌信号分子调控其增殖和分化的跨膜信号转导通路，以及表观遗传修饰在此过程中的作用。这一目标的实现，将取得在猪、鸡肌肉和脂肪干细胞分化机制认识方面的突破，提升我国在猪、鸡肌肉和脂肪干细胞方面的研究水平。3、建立猪、鸡骨骼肌和脂肪细胞的miRNA文库，获得猪、鸡骨骼肌和脂肪发育过程中miRNA表达的信息，阐明5种以上miRNA对体节发生和肌肉祖细胞与间充质细胞分化过程中关键基因的调控机制。miRNA文库将达到国内领先和国际先进水平，同时使我国在miRNA对猪、鸡骨骼肌和脂肪发育控制作用及其调控机制方面的研究进入国际先进行列。4、揭示猪、鸡肌肉和脂肪细胞分化与代谢过程中关键转录因子、转录辅助因子等关键基因的功能与作用机制，探讨DNA和组蛋白修饰对关键作用基因表达的影响，进一步阐明骨骼肌和脂肪发育与代谢的分子调控网络机制。这一目标的实现，将进一步提高我们对猪、鸡肌肉和脂肪发育分子调控机制的深入认识，积累组织器官发育的新知识，为发育原理在畜牧生产与医学实践中的应用提供指导作用。5、揭示不同猪种（瘦肉型外来品种与脂肪型优质地方品种）、鸡种或品系（蛋用型和肉用型、高脂系和低脂系）肌肉和脂肪组织之间的遗传和表观遗传学分子差异及其与肉、脂性状形成的关系。这是发育领域的开拓性研究，这将丰富我们对发育分子机理的认识，将为我国猪、鸡品种资源的有效利用提供科学依据，增强我国畜牧生产的自主创新能力。6、建立可用于生产实践的miRNA鸡的培育的技术方法。这一目标的实现将是发育原理用于生产实践的重大突破，虽然本目标的实现存在一定风险，但至少将在转基因技术方面取得一定突破，为旨在提高生产性能、抗病性能和作为生物孵化器的转基因鸡培育提供可借鉴的理论技术资料。 7、发表研究论文SCI论文40篇以上，其中在影响因子5.0以上国际主流杂志发表论文20篇左右。申请发明专利3-5项。8、打造一支高水平的科研队伍，培养一批博士研究生（20-25人），硕士研究生（40-60人），博士后研究人员（5-10人）。三、研究方案 （一）实现预期目标的总体研究思路项目研究的技术路线及可行性分析1、总体思路猪和鸡作为重要的模式生物和经济动物，近些年来对其遗传与发育学研究已取得了一些重大突破。猪和鸡基因组结构被逐步解析，一些与肌肉和脂肪发育调控相关的重要基因也已被发现。 实际上，肌细胞和脂肪细胞的分化、生长与发育调控是一系列相关基因的时序性表达和关闭的结果，对这些基因调控网络的全面解析是后基因组时代的主要研究内容。目前，对猪、鸡肌肉和脂肪发育调控的研究主要集中在基因的结构、转录因子和分子标志的时序性表达，以及关键基因调控肌肉和脂肪分化和生长发育的功能揭示的研究，而对调控基因与调控因子产生“程序化”作用的过程及其分子机制尚不清楚，特别是：（1）对肌肉和脂肪细胞组织发生、生长发育和分化的基本控制通路中许多上下游和平行作用的分子及其关联尚待发掘，对局部微环境中各种内分泌和旁（自）分泌等信号分子如何通过细胞内特定信号转导通路调控细胞的分化、发育和代谢过程也缺乏深入和系统的研究；（2）对肌肉和脂肪细胞分化过程中，DNA与组蛋白修饰等表观遗传学特征如何调控功能基因的转录， miRNA如何在此过程中对其基因表达的控制等方面的研究还刚刚起步；（3）品种（系）间猪和鸡肌肉和脂肪分化和生长发育差异的遗传学和表观遗传学基础的研究基本处于空白。 本项目针对上述问题展开研究，结合我们前期的工作基础，运用现代生物技术的先进方法，从胚胎期组织发生、细胞分化、出生后生长和发育等多阶段，在DNA、RNA、蛋白质等多层次上展开研究，期望在猪、鸡骨骼肌和脂肪发育调控的遗传学、表观遗传学与外周信号调控机制多方面取得重大突破，为推进我国发育生物学、比较医学和畜禽的遗传育种研究与实践奠定坚实理论与技术基础。2、技术路线建立猪、鸡肌肉和脂肪干细胞库和非编码RNA库，发掘猪、鸡肌肉和脂肪干细胞分化与组织发育的新功能基因和miRNA，在猪和鸡中靶向克隆在其他物种分离鉴定的肌肉和脂肪发育的基因和参与其调控的miRNA，结合各种组织学技术、细胞学技术和其他分子生物学技术，系统发掘猪、鸡肌肉和脂肪干细胞分化与组织发育中的重要功能基因，研究其其功能和作用机制，并进行代表性种（系）间的系统比较，从而深入揭示畜禽肌肉和脂肪发育的分子机制。同时，进行miRNA鸡培育新技术方法研究，力争培育成功优化肌肉和脂肪生长的miRNA鸡。本项目从分子水平、细胞水平和动物模型整体水平3个层次开展研究。分子水平研究的技术包括：高效毛细管电泳，免疫荧光技术，共聚焦显微镜技术，Western blot技术，原位杂交，免疫组织荧光，染色质免疫共沉淀，基因克隆，报告基因技术、基因缺失和点突变，甲基化间区位点扩增，Gel-shift技术， 基因表达谱芯片技术，代谢谱分析技术，蛋白质双向电泳，蛋白质飞行时间质谱，时间分辨荧光分析，蛋白质相互作用分析技术等。细胞水平研究的技术包括：基因显性失活，过量表达，基因敲除，RNAi技术，miRNA克隆与功能分析技术，报告基因介导的转录活性模型及其检测技术等。动物模型整体水平研究的技术包括：猪和鸡的基因敲入技术、敲除技术，活体鸡胚基因干扰技术、基因过表达技术，猪和鸡成体组织技术等。3、可行性分析（1）对肌肉与脂肪发育及其调控机理的研究有可靠的理论基础。近年来，对鼠和人的肌肉与脂肪发育及其调控机理的认识愈来愈深入，肌细胞与脂肪细胞的分化都是由一系列转录因子（Pax3-myoD-myoG、C/EBP-PPAR -SREBP）顺序调控的结果，其基本调控线路已初步得到解析。国内外研究和本项目团队前期对猪、鸡肌肉和脂肪发育的调控研究也取得了一定进展，发现了大量与猪、鸡肌肉和脂肪发育调控相关的功能基因。这些工作为本项目研究取得重大突破提供了理论基础。 （2）生命科学新的研究技术为本项目取得重大突破提供了技术可行性。随着后基因组学时代的到来，有关表观遗传学、蛋白组学和代谢组学的研究逐渐深入，新的生物学研究技术手段也日新月异。现有蛋白质飞行时间质谱，染色质免疫共沉淀芯片，核酸、蛋白质和代谢组芯片，时间分辨荧光分析，RNAi技术，miRNA转入和转出，以及病毒载体介导的转基因动物模型建立等成熟的研究方法为本项目的顺利实施提供了重要的技术保障。 （3）申请单位有良好的前期研究基础。本项目的研究团队已开展大量的前期研究，已经成功建立了猪、鸡（包括大鼠、小鼠和人）原代成肌细胞、原代成熟脂肪细胞、原代前脂肪细胞的体外培养技术，并建立了猪、鸡肌细胞和前体脂肪细胞诱导分化的研究方法，初步开展了猪、鸡脂肪组织生长发育过程中基因表达谱分析和猪、鸡脂肪分化重要调控基因的功能基因组学研究，成功地应用siRNA分别干扰了前脂肪细胞PPAR、C/EBP和SREBP-1基因的表达。同时，阐明了脂肪细胞内脂滴包被蛋白Perilipin和ADRP的泛素化修饰调节机制，研究了Perilipin下调及其磷酸化调节脂肪分解的分子机制，对PPAR激动剂及甾体类激素调节脂肪生成和脂肪分解的分子机制的研究也在进行。另外还从mRNA水平和蛋白水平，研究了猪脂肪代谢关键基因（PNPLA2、ABHD5）和关键酶类(ATGL、CGI-58、HSL)在不同发育时期的组织表达特性。对中外猪种肌肉发育差异的分子机制研究以及猪和鸡基因组非编码RNA的研究也取得了进展。这些工作为开展本项目研究提供了良好的前期研究基础。 （4）本项目的研究团队具备很强的研究实力与良好的研究平台。本项目集合我国这一领域的优势队伍。整个项目的主要参与人员都为创造力旺盛的中青年科学家，具有多年在欧美等国一流实验室工作的经验和广泛的文献接触面，对本研究领域的重大问题及技术手段都具有独到的见解。本项目课题负责人和主要学术骨干都由具有多年研究经验和高度组织能力的学术带头人担任，在发育生物学、细胞生物学、分子生物学等领域具有多年的研究经验。开展本项目研究已有较好的技术平台支撑，承担单位拥有2个国家重点实验室，5个部级重点实验室，项目所需的绝大部分实验仪器和实验手段均已具备，各承担单位间有着长期的良好合作关系和基础。本项目具有丰富的前期工作积累与相关研究成果及多学科背景的研究队伍，已经建立起成熟的研究手段和方法，有能力完成所计划的研究任务。（二）项目的创新点 1、尽管已经发现大量与猪、鸡肌肉和脂肪发育调控相关的基因。但是，目前国内外的研究主要集中在相关基因的结构、转录因子和分子标志基因的时序性表达，以及关键基因调控肌肉和脂肪分化和生长发育功能的研究，而对在猪和鸡的肌肉与脂肪发育过程中，各种调控基因与调控因子产生“程序化”作用的过程及其分子机制尚不清楚，对局部微环境中各种信号分子产生作用的信号通路与分子机制亦有待阐明，对基因转录调控的表观遗传学研究十分缺乏。本项目在前期基础上，对在肌肉和脂肪细胞分化过程中，外周信号分子调控信号转导通路、表观遗传和功能基因表达的调控网络展开系统深入的研究，在研究内容及关键问题的选择上有明显创新。2、目前对肌肉与脂肪发育及其调控机理的认识主要来自对鼠和斑马鱼等模式实验动物。根据已有的报道及本项目组的前期研究结果，提示猪、鸡肌肉与脂肪细胞分化的转录调控因子及其调控机制与鼠等模式试验动物有所不同，猪和鸡的肌肉与脂肪发育调控在一些方面可能比鼠更近似于人类。猪和鸡作为主要的家养动物，经过长期驯化，已经形成各种不同遗传背景的经济品系，其肌肉和脂肪的生长发育模式形成了自然的差异。本项目选择猪和鸡作为实验动物模型，不仅可以弥补其它模式动物研究的许多不足，而且可以从比较生物学的角度深入探讨肌肉和脂肪发育调控分子机制与进化。这对发育生物学和临床医学的基础研究具有重要的理论意义，同时也将为我国优良种质资源的保护和开发以及肉产品品质的提高提供更直接的理论依据。因此，本研究在研究对象的选择上具有一定的创新。 3、随着新的分子细胞生物学研究方法的变革和技术创新，功能基因组学、RNA组学、蛋白质组学、代谢组学和生物信息学发展的各种研究手段，为高通量的筛选与检测工作提供了技术保障。本项目在传统发育生物学研究的基础上，运用蛋白质飞行时间质谱，染色质免疫共沉淀芯片，核酸和蛋白质芯片，时间分辨荧光分析，RNAi技术，miRNA研究技术，以及病毒载体介导的转基因动物模型等先进方法手段，解决发育生物学的基本问题，与以往单个基因的局部功能研究相比，在研究方法和研究思路上具有明显创新。（三）课题设置1、课题设置的思路骨骼肌和脂肪的发育是DNA遗传基础上一系列功能基因表达调控的复杂分子事件。生命科学的研究进展表明，基因表达的调控在多个层面上受到多种因素的作用，从单一层面或研究单一因子的作用只能获得有限和片面的信息，在各个水平上展开高通量平行研究是取得突破的关键。本项目根据骨骼肌和脂肪的发育的基本过程和基因表达的调节网络层次拟设置4个课题：（1）骨骼肌和脂肪干细胞的自我更新和分化的分子机制；（2）非编码RNA在骨骼肌和脂肪组织分化过程中的分子调控机制；（3）骨骼肌和脂肪发育过程中功能基因与细胞代谢的分子调控网络；（4）品系间骨骼肌和脂肪发育差异的分子遗传学机制。2. 课题之间的相互关联本项目设置的4个课题从不同研究层次阐明骨骼肌和脂肪干细胞分化、组织生长发育的分子调控机制，虽然各有侧重但彼此紧密关联。其中，课题1所建立的细胞诱导分化模型以及确定的细胞分化阶段的分子标志为课题2、3、4研究的重要基础；课题2有关非编码RNA的研究和课题3中对功能基因与细胞代谢网络的解析，直接解释细胞各分化阶段标志蛋白启动表达的分子机制，为课题1的研究深入提供参考；课题2揭示的非编码RNA的调控作用还是对课题3调节网络认识的补充；课题4主要阐明中不同DNA遗传背景动物课题1、2、3过程发展和机制发生的差异，进一步深化对其研究结果的认识，同时课题4的研究又需要以课题1、2、3研究对细胞分化分子调控通路的认识为基础。3、课题研究内容和目标课题1、骨骼肌和脂肪干细胞的自我更新和分化的分子机制主要研究内容1、研究骨骼肌和脂肪干细胞的诱导分化和分子事件研究猪、鸡胚胎期肌肉和脂肪胚胎干细胞和不同来源成体干细胞的分离与鉴定方法；研究完善猪、鸡肌肉和脂肪胚胎与成体干细胞的体外培养方法；和定向分化诱导方法。运用基因表达谱芯片、荧光定量PCR和蛋白质组学方法等方法分析骨骼肌和脂肪干细胞分化过程中的基因表达的特异性变化，筛选骨骼肌和脂肪干细胞分化过程中的标志分子和功能作用基因，同时研究他们在不同品种（品系）猪、鸡骨骼肌和脂肪干细胞分化过程中的表达差异。2、关键功能基因在骨骼肌和脂肪干细胞的分化过程中的作用及信号转导通路采用RNAi和过表达技术确定候选基因在骨骼肌和脂肪干细胞分化过程中的功能；采用报告基因和信号转导通路调控策略研究这些关键功能基因的作用及其作用的信号通路。研究这些基因功能的转录调控及其遗传学和表观遗传学机制。3、外周信号分子的作用及其调控关键功能基因的细胞信号通路研究内分泌、旁（自）分泌等信号分子对选定基因表达的调控作用及对表观遗传学修饰作用的影响；采用特定细胞内信号转导通路激动剂和阻断剂处理，研究信号分子调控作用的跨膜转导通路，探讨信号分子之间可能存在的相互作用模式。4、miRNA鸡培育（根据评审反馈意见增列） 研究提高同源重组、抑制随机整合、去除冗余外源序列的转基因鸡载体技术，研究提高转基因鸡效率基因（miRNA) 导入技术和 miRNA 对特定基因沉默效率控制技术，建立 miRNA鸡的培育方法。主要研究目标1、建立猪、鸡肌肉与脂肪胚胎干细胞和成体干细胞库。包括不同品种（品系）和不同组织来源的干细胞。2、建立猪、鸡肌肉与脂肪胚胎干细胞和成体干细胞的体外培养和诱导分化模型。发掘干细胞自我更新和分化过程中的分子标志与重要功能基因5种以上。3、阐明猪、鸡骨骼肌和脂肪干细胞分化过程中35种关键基因的功能作用，及其下游信号通路。4、揭示35种关键功能基因在干细胞分化中功能的表观遗传学控制机制，及其细胞外信号分子调控通路。5、建立 miRNA 鸡的培育技术与方法。6、发表SCI论文10篇以上，IF5论文5篇以上；申请发明专利1-2项；培养博士研究生5-7人，硕士研究生12-15人，博士后研究人员1-3人。承担单位：厦门大学 课题负责人：袁立经费比例：31课题2、非编码RNA在骨骼肌和脂肪组织分化过程中的分子调控机制主要研究内容1、肌肉和脂肪相关miRNA的鉴定首先建立具有品系代表性的猪、鸡非编码RNA文库，鉴定肌肉和脂肪相关miRNA及miRNA clusters，分别研究其在肌肉和脂肪干细胞分化过程中的表达模式，确定miRNA分子可能调控的靶基因。 2、miRNA在脂肪和肌肉胚胎发育中的生物学功能研究分析特定miRNA在猪和鸡胚胎发育中表达的时间和部位；研究该miRNA对体节发生和肌肉祖细胞、间充质细胞进一步分化的影响，从而确定一些miRNA与骨骼肌和脂肪发育之间的关系。3、miRNA对骨骼肌和脂肪干细胞增殖、分化的调节在体外培养的原代成肌细胞（myoblast）、肌卫星细胞（satellite cell）、间充质细胞和脂肪前体细胞中超表达或Knockdown特定miRNA，通过形态学观察和细胞增殖分化的标志基因（marker）的表达情况，探讨miRNA对成肌细胞生物学功能的影响。4、miRNA对介导肌肉和脂肪系统发育的信号传导通路的调节探讨在肌肉和脂肪发育中具有调控作用的miRNA对信号传导通路的影响，建立miRNA和蛋白质共同介导的对肌肉发育调控的信号传导通路。主要研究目标1、建立我国特征品系畜禽的骨骼肌和脂肪细胞的miRNA文库；2、确定新发现的miRNA 在肌肉、脂肪发育过程中的时空表达谱，尤其是miRNA在骨骼肌和脂肪发育过程中的表达谱，并阐明其对靶基因转录的调控作用；3、阐明5种以上miRNA对骨骼肌和脂肪干细胞增殖、分化过程中的调控机制。4、发表SCI文章10篇，其中IF5论文5篇；申请相关专利2-3项；培养博士研究生5-7人，硕士研究生10-12人，博士后研究人员1-3人。承担单位：南京大学 课题负责人：朱敏生经费比例：24课题3、骨骼肌和脂肪发育过程中功能基因与细胞代谢的分子调控网络主要研究内容1、骨骼肌和脂肪发育关键转录调控因子的鉴定运用表达谱芯片等技术研究肌肉和脂肪细胞分化过程中基因表达模式的变化，同时结合生物信息学比较、基因克隆、染色体定位及过量表达等技术，对细胞分化及干细胞自我更新等过程中重要的转录调控因子和转录辅助因子（包括部分已知的Pax家族基因、MyoD、myoG、PPARs、C/EBP、E2F家族、SREBP1c、STAT5、CREB和BMAL1等）以及一些在脂肪型和瘦肉型猪群体中表现有显著差异的新基因（如LATS2、SMAD3、CNTF、CNTFR和miR 24等）进行着重研究。初步构建转录因子和功能基因转录之间的调控关系和数学模型。研究肌肉和脂肪前体干细胞分化过程中关键的转录因子和转录辅助因子参与细胞分化和成熟的调控机制，从而解析骨骼肌和脂肪发育关键基因的调控网络。2、骨骼肌和脂肪发育关键基因的调控网络的构建及表观遗传研究应用过表达、显性突变体和RNA干扰等技术方法，确定各种参与骨骼肌和脂肪发育的关键基因在细胞增殖和分化中的作用。通过转录因子/DNA结合实验，结合报告基因技术、采用高效毛细管电泳法、甲基化间区位点扩增（AIMS）、Gel-shift技术和染色质免疫共沉淀（ChIP 或ChIP-on-chip）等技术验证肌肉和脂肪细胞分化过程中转录因子及其与转录辅助因子的相互作用的网络。同时利用Solexa测序和ChIP技术，重点解析表观遗传特别是甲基化水平对转录调控的影响。从而构建骨骼肌和脂肪发育关键基因的调控网络以及其在表观遗传水平上的调控机制。3、脂肪分化和分解的关键基因和蛋白的功能及其分子调控机制以PPAR及其靶基因Perilipin和ADRP为切入点，研究Perilipin启动子区域DNA甲基化等表观遗传修饰导致的基因转录沉默，与Perilipin在脂肪组织的特异和时序性表达和分布的关系，及其参与脂肪细胞分化的调节机制。在预试验的基础上，以Perilipin基因敲除动物为模型，研究Perilipin基因敲除导致脂肪重量减少但肌肉组织重量增加的调节机制，以及Perilipin在PPAR介导的脂肪生成与脂肪细胞分化调控网络中的关键作用，探讨肌肉和生长、脂肪沉积的形成机理。研究肾上腺素、胰岛素、糖皮质激素等、脂肪细胞因子、以及PPAR代谢性核受体配体药物等对脂肪分解的调控作用和机制，并由此揭示脂肪生成、分化、以及分解代谢的调控网络和机制。4、脂肪代谢关键基因和关键酶类对肌肉、脂肪生长发育以及对肉品质影响以HSL、ATGL、CGI-58等基因和相应蛋白质作为切入点，从mRNA和蛋白质表达水平，及其对脂肪分解代谢的调节作用特征，分析它们与脂肪和肌肉组织发育的关系以及对肉品质的影响；分析它们在不同生长发育时期的变化特点，并从细胞水平上应用基因表达和沉默技术研究这些关键酶的功能及相互调节关系。从而阐明脂肪、蛋白质代谢途径的关键基因和关键酶类对肌细胞、脂肪细胞生长发育以及对肉品质的影响，同时，研究各发育时期关键基因和关键酶的调控网络。主要研究目标1、鉴定骨骼肌和脂肪干细胞自我更新和分化过程中调控的转录因子和转录辅助因子。阐明肌肉和脂肪前体干细胞分化过程中关键的转录因子和转录辅助因子，参与细胞分化和成熟的调控机制。研究骨骼肌和脂肪发育关键基因的调控网络。2、阐明DNA甲基化和组蛋白乙酰化表观遗传修饰，调节肌肉和脂肪细胞分化的转录因子、转录辅助因子在肌肉和脂肪组织特异性表达和时序性表达的机制，及其参与细胞分化和成熟的调控机制。3、揭示激素、细胞因子、谢性核受体配体对脂肪生成和分解的调控作用和机制，并由此揭示脂肪生成、分化、以及能量代谢的机制与分子调控网络。4、阐明脂肪、蛋白质代谢关键基因和关键酶类对肌肉、脂肪生长发育以及对肉品质的影响，明确各发育时期脂肪、蛋白质代谢关键基因和关键酶的调控机制。5、发表SCI文章10篇，其中IF5的文章5篇；申请相关专利1-2项；培养博士研究生5-7人，硕士研究生10-12人，博士后研究人员1-3人。承担单位：北京大学课题负责人：徐国恒经费比例：24课题4、品系间骨骼肌和脂肪发育差异的分子遗传学机制主要研究内容1、骨骼肌和脂肪发育的品种（系）特异性采用比较生物学策略，系统研究不同猪品种（系）（瘦肉型外来品种与脂肪型优质地方品种）、鸡品种（系）（速生型与慢生型、蛋用型和肉用型、高脂系和低脂系）肌肉或脂肪组织在胚胎期和出生后的生长和分化的发育规律，研究包括比较品种或品系间的骨骼肌和脂肪细胞的增殖、分化、凋亡规律，研究分析不同品种（系）肌肉与脂肪的表观性状特点。2、品种（系）间骨骼肌和脂肪发育的比较转录组学分析利用比较转录组技术分析其发育差异，确定发育过程中差异的信号通路和关键因子，探讨调控品种（系）间表型形成的遗传学基础。3、品种（系）间骨骼肌和脂肪发育差异关键基因鉴定及其SNP和表观遗传学分析 结合生物信息学手段，采用基因组部分测序和高通量SNP芯片技术，全面比较瘦肉型外来品种与脂肪型优质地方品种及速生型与慢生型猪，蛋用型和肉用型以及高脂系和低脂系鸡的肌肉或脂肪组织之间的、数据库中已公布SNP位点的差异，结合内容1中分析获得的表型数据，利用群体法建立全基因组关联分析（Genome-wide association GWA）模型，通过生物信息学分析初步获取影响品种间表型变异的基因或位点。同时采用高效毛细管电泳法、甲基化间区位点扩增（amplification of inter-methylated sites，AIMS） 以及染色质免疫共沉淀法（ChIP）分析关键功能基因启动子序列的DNA甲基化以及组蛋白乙酰化等修饰状态。4、品种（系）间骨骼肌和脂肪发育关键基因表达和miRNA表达分析采用寡核苷酸芯片和蛋白质双向电泳-质谱技术全面比较瘦肉型外来品种与脂肪型优质地方品种猪、速生型与慢生型、蛋用型和肉用型以及高脂系和低脂系肌肉或脂肪组织关键基因的mRNA和蛋白质表达差异，分析差异表达基因的功能。同时，根据已发现的肌肉和脂肪组织的miRNA，比较其在不同物种和品系间的表达特点和差异，分析差异表达miRNA的调控作用。 5、重要基因的功能研究及其在医学以及动物育种中的意义利用反向遗传学技术，结合构建的各种细胞系，研究骨骼肌和脂肪发育相关关键基因的生物学功能，通过构建小型猪医学模型，研究这些因子的生理学作用，初步确定在人类医学应用的价值。在构建的各类试验群体中分析这些因子与经济性状的关联，获取可以用于遗传改良的分子标记。主要研究目标1、了解不同猪种、鸡种或品系肌肉或脂肪组织的生长发育规律。2、探讨不同品种（系）肌肉或脂肪组织的生长发育差异的遗传学和表观遗传学基础。3、揭示不同品种（系）肌肉或脂肪组织的之间的转录和蛋白组差异。4、发现和鉴定一批与骨骼肌和脂肪发育相关的因子，估计部分因子对经济性状的遗传效应5、发表SCI文章10篇，其中 IF5的文章5篇；申请相关专利1-2项；培养博士研究生4-5人，硕士研究生10-12人。承担单位：东北农业大学课题负责人：王宁经费比例：21四、年度计划研究内容预期目标第一年1、建立猪、鸡胚胎期肌肉始祖细胞（MPC）和间充质细胞的分离、培养及鉴定方法，研究干细胞诱导分化的条件与机制，着手建立猪、鸡胚胎干细胞库。2、分析现有miRNA的表达谱数据，寻找候选miRNA （或cluster）, 并在不同品系猪、鸡中验证它们与肌肉、脂肪发育生长的相关性。3、LATS2基因克隆，研究在肌肉中的表达谱；研究PPAR和糖皮质激素及代谢性核受体调节脂肪代谢的分子机制。4、进行鸡基因组提取及超声波破碎及甲基化DNA免疫共沉淀富集，为表观测序积累样本。5、研究选定品种（系）猪和鸡骨骼肌和脂肪组织在胚胎期和出生后的生长和分化的发育规律。比较品种（系）间猪和鸡骨骼肌和前脂肪细胞的增殖、分化和凋亡等差异。 对不同品种（系）猪和鸡骨骼肌和脂肪组织及细胞的转录组和蛋白进行分析，寻找差异表达基因与蛋白。6、构建转基因鸡载体系统，并在鸡源细胞上验证其效率。1、建立猪、鸡胚胎干细胞及成体干细胞的培养与诱导分化的技术方法，着手建立猪、鸡肌肉与脂肪干细胞库 和诱导分化模型。2、获得50个候选miRNA和2-5个miRNA cluster，确定1-4个miRNA的靶基因。3、完成LATS2基因的克隆及相关分析； 初步揭示PPAR和糖皮质激素及其代谢性核受体调节脂肪代谢的分子机制。4、获得高质量的鸡的DNA甲基化分析样本。5、揭示猪、鸡骨骼肌和脂肪在胚胎期和出生后的生长发育的规律。 筛选出品种（系）间骨骼肌和脂肪发育的差异表达基因。6、完成转基因鸡载体系统构建。7、发表SCI论文10篇，争取IF5.0论文46篇。第二年1、运用基因表达谱芯片、蛋白质组学和生物信息学方法，筛选骨骼肌和脂肪干细胞分化过程中的功能基因和标志性分子。2、继续确定候选miRNA的靶基因，研究miRNA在脂肪和肌肉胚胎发育中的生物学功能及其介导肌肉和脂肪系统发育的信号传导通路的调节。建立猪骨骼肌和鸡前脂肪细胞小RNA文库，并鉴定品种（系）间猪和鸡骨骼肌和脂肪组织差异表达miRNA，分析其在骨骼肌和脂肪生长发育中的功能。3、利用基因组改造技术建立转基因和基因敲除动物。4、体外细胞过表达LATS2对其功能进行研究。研究SMAD3、CNTF及CNTFR和miR24在瘦肉型及脂肪型猪种中的表达谱差异，揭示与瘦肉表型猪发育形成相关基因。5、Mapping Solexa 测序结果，获取鸡全基因组甲基化图谱。进一步对所产生的数据进行生物信息学分析。6、 检测脂肪细胞系及活体（高低脂系）相关基因表达水平，并建立关键基因与脂肪水平的相关性。研究相关因素如环境温度、病原体、营养素等对脂肪代谢的调节机制。1、揭示骨骼肌和脂肪干细胞分化过程中的基因表达谱和蛋白质组的变化；确定骨骼肌和脂肪干细胞分化过程中的候选功能基因与分子标志15个以上。筛选出品种（系）间骨骼肌和脂肪发育的差异表达基因。2、 建立猪骨骼肌和鸡前脂肪细胞的小RNA文库，确定2-8个miRNA的靶基因，阐明1-2个特定miRNA在肌肉、脂肪发育中的功能和对其信号通路的调节方式。 获得不同品种（系）猪、鸡差异表达miRNA的时序表达谱特征。3、建立基因（miRNA）导入技术； 构建2-4个打靶载体和2-4个转基因载体。4、完成LATS2基因在细胞系中的功能分析。完成SMAD3、CNTF及CNTFR和miR 24等在瘦肉型及脂肪型猪种中的表达谱差异。5、完成鸡基因组甲基化检测及数据挖掘，初步阐述鸡的与脂肪发育相关基因的表观遗传特点。6、揭示几种激素和外在因素对脂肪代谢的调节机制。7、发表SCI论文10篇以上，其中影响因子5的46篇。第三年1、 研究选定的重要功能基因和信号通路的功能和调控，分析它们在不同品种（品系）猪、鸡骨骼肌和脂肪干细胞分化过程中的表达差异；采用RNAi和过表达技术确定它们在骨骼肌和脂肪干细胞分化过程中的功能；采用报告基因和信号转导通路调控策略研究关键分子标志调控下游基因表达及其作用的信号通路。2、进行猪群体中LATS2基因与肌肉脂肪发育的相关性分析； 对SMAD3、CNTF及CNTFR和miR24在瘦肉型及脂肪型猪种中的表达谱差异