基因工程原理与技术-ppt课件

第五章聚合酶链式反应 polymerasechainreaction PCR PCR是体外快速扩增目标DNA序列的技术1971年Khorana等提出 在体外经DNA变性 与适当引物杂交 再用DNA聚合酶延伸 克隆DNA 的设想 1983年Mullis发明了PCR技术 1988年Saiki等将耐热TaqDNA聚合酶引入了PCR技术 1989年PCR被美国 Science 杂志列为十余项重大科学发明之首 1993年Mullis荣获诺贝尔化学奖 应用领域 生命科学 医学 法医学及考古学 第一节PCR原理 遵循DNA体内复制原理 半保留式扩增 扩增序列取决于设计一对引物 正向引物 反向引物 有效扩增长度为2kb左右 扩增循环包含变性 退火 延伸3个阶段 30 35个循环后 目标序列呈指数级扩增 2n 2 第二节PCR反应体系一 反应体系 二 反应参数 三 影响PCR的因素1 反应成分 引物 浓度 长度 DNA聚合酶 种类 Klenow酶 Taq酶 Pfu酶 用量 dNTP 浓度 比例 Mg2 影响TaqDNA聚合酶的活性和真实性 引物退火 模板解链温度 产物的特异性 引物二聚体生成等 反应缓冲液 pH8 3 KCl能促使引物退火 但浓度大于50mmol L抑制酶活性 模板DNA 用量 线性DNA扩增效果大于环状DNA 2 反应条件 变性的温度和时间 热启动降低非特异性扩增 退火的温度和时间 取决于引物的长度 浓度和碱基组成 退火温度为Tm 5 退火温度越高 扩增特异性越高 延伸温度和时间 延伸时间长短取决于目标序列的长度 及延伸温度的高低 对2kb长目标序列扩增时间多采用1min 72 时 四 平台效应平台效应是指PCR反应后期扩增产物不再随循环次数而明显上升 反应曲线变得平坦的现象 引起平台效应的因素 dNTP或引物等消耗殆尽 酶活性逐渐降低 最终产物的阻化作用 焦磷酸盐 双链DNA 非特异性产物与模板的竞争作用 在高产物浓度下产物变性不完全 低浓度的非特异产物开始大量扩增 PCR的特点 灵敏度高 简便 快速 对样品纯度要求低 第三节聚合酶链式反应引物设计原则一 引物设计的总原则提高特异性扩增 降低非特异性扩增 二 引物设计的一般原则 引物长度应为15 30个核苷酸 Tm接近72 较佳 Tm G C 4 A T 2 引物中碱基分布应是随机的 避免出现一连串单一碱基以致产生二级结构 G C碱基的含量在45 55 左右 引物3 端必须与模板互补 5 端可以不互补 引物中连续互补碱基应小于4个 引物间连续互补碱基应小于4个 三 引物3 端的末位碱基引物3 端的未位碱基 优选A 其次是G C 不要选T 因为当未位碱基为T时 即使在错配的情况下也能引发链的合成 而未位碱基为A时 错配时的引发效率大大降低 若为G或C 则引发率居于其间 当然 设计简并引物时 3 端末位碱基选T会得到较好的效果 四 引物设计软件Oligo6 57Primer5 0 第四节PCR的类型一 已知DNA序列的PCR扩增1 巢式PCR不受平台效应限制 扩增灵敏度增加1000倍 2 热巢式PCR第二对引物之一标记放射性物质 电泳检测时灵敏度增高 可测出106个细胞中的一个DNA分子 3 半巢式PCR 见下图 4 不对称PCR采用两种不同浓度的引物 50 1 主要用于制备DNA测序的单链模板以及制备杂交探针 5 等位特异性PCR用于检测点突变 在引物的3 端设计了突变碱基 突变引物与正常模板间扩增受阻 电泳分析时 不出现谱带 反之则会出现特定谱带 但有些错配碱基不能完全阻止引物延伸 6 竞争引物PCR用于检测特定位点的点突变 设计两个等位特异性引物 一个是正常的 另一个是突变引物 而且突变碱基在引物中间 其扩增产物相差20倍以上 由于一个引物被标记 能检测出不同样品的的扩增差异 常为A A G G G A C A C C T C T G 7 降落PCR在一次PCR中 设计多循环反应的程序 第一个程序的退火温度高于Tm 以后每个程序的退火温度逐渐降低 确保第一次扩增的特异性 这样后面的低退火温度不会影响扩增的特异性 因为在开始的几个循环中 目标产物已指数级扩增 常用于根据氨基酸序列设计简并引物的扩增 多基因家族成员的扩增 二 逆转录PCR RT PCR 逆转录PCR是指先以mRNA 以oligo dT n为引物在逆转录酶作用下合成cDNA第一链 然后用已知一对引物扩增cDNA片段的技术 主要用于基因表达 cDNA克隆 逆转录病毒鉴定等研究 RT PCR引物设计原则 引物限定区最好为180 500bp 引物5 和3 端不应存在回文序列结构 用oligo dT n作逆转录第一链cDNA的引物时 有义引物应尽量位于RNA的3 端 在引物限定区内 基因组DNA最好有一内含子 这样可检测污染情况 PCR引物限定区内最好有一酶切位点 以便鉴定产物 三 快速扩增cDNA末端 RACE 锚定PCR 杂合引物 17ntoligo dT 锚定引物 带限制酶位点的序列 基因特异引物5 RACE的缺点 不能获得真正的5 末端 因为过早终止第一链cDNA像全长cDNA一样 可被末端转移酶同样有效地加尾 3 RACE 5 RACE 新5 RACE 加帽法 四 已知序列的侧翼未知序列的PCR扩增1 反向PCR 2 锅柄PCR 五 未知序列PCR扩增1 差异显示PCR 锚定引物 N9 随机引物 2 减法PCR 例如 受试者为感病材料 驱动者为正常材料 六 荧光定量PCR 实时定量PCR 荧光染料 EB 结合双链DNA会使荧光增强 但结合无特异性 荧光标记探针 见图 利用Taq酶的外切酶活性 扩增时切断探针释放出荧光基团 使荧光增强 特异性强用途 检测病原菌 基因表达 R 荧光基团 Q 淬灭基团 第五节PCR技术应用一 基因克隆及筛选二 基于PCR分子标记RAPD SSR AFLP等 应用在遗传图谱构建 生物进化 遗传多样性等方面的研究 三 DNA测序四 突变检测五 基因表达检测六 病原菌检测与疾病诊断七 法医鉴定犯罪嫌疑人鉴定 见下图 亲子鉴定八 转基因检测转基因育种 进口