H1N1亚型猪流感病毒血凝素基因的生物信息学分析和高效可溶表达

序号： 编码： 第九届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书 作品名称：H1N1亚型猪流感病毒血凝素(HA)基因的生物信息学分析和高效可溶表达 学校全称： 华南农业大学 申报者姓名 （集体名称）： 谢易恒、李栋、苏培穗、莫秋女、陈锦坚 类别：自然科学类学术论文 哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作A类 科技发明制作B类 报送方式：省级报送作品高校直送作品说 明1.申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。3.表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4.序号、编码由第九届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会填写。5学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，字数在8000字左右（文章版面尺寸14.522cm）。6作品申报书须按要求由各省或各校竞赛组织协调机构统一寄送。7.其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。A2申报者情况（集体项目）说明：1必须由申报者本人按要求填写；2申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列；3本表中的学籍管理部门签章视为申报者情况的确认。申报者代表情况姓名谢易恒性别男出生年月19855学校华南农业大学系别、专业、年级2004级动物科学（生物工程方向）学历本科学制4入学时间20049作品名称H1N1亚型猪流感病毒血凝素(HA)基因的生物信息学分析和高效可溶表达毕业论文题目通讯地址华南农业大学动物科学学院邮政编码510642办公电住地通讯地址华南农业大学五山学生公寓5幢307邮政编码510642住宅电话61307865其他作者情况姓 名性别年龄学历所在单位李栋男21本科动物科学学院2004级生物工程方向1班苏培穗男23本科动物科学学院2004级生物工程方向1班莫秋女女22本科动物科学学院2004级生物工程方向1班陈锦坚男22本科动物科学学院2004级生物工程方向1班资格认定学校学籍管理部门意见以上作者是否为2006年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。是否 （部门签章）年 月 日院系负责人或导师意见本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果是否负责人签名：年 月 日B1申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1必须由申报者本人填写；2本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称作品分类（D ）A机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路对H1N1亚型猪流感病毒（SIV）血凝素基因(HA)的生物信息学进行分析，并且高效可溶表达SIV HA抗原蛋白，为开发新型猪流感基因工程疫苗打下基础，同时建立鉴别诊断H1N1猪流感病毒的ELISA方法，为猪流感的防控提供科学依据。作品的科学性、先进性及独特之处本研究选用pBCX高效可溶表达载体（本研究室改造的载体，正在申请专利）高效表达H1N1 SIV 的HA蛋白。用msyB基因作为融合伴侣，使HA融合蛋白高效可溶表达，突破了传统大肠杆菌表达系统包涵体表达外源蛋白（多肽）的技术瓶颈。因此选用大肠杆菌msyB多肽基因是构建高效可溶表达载体的最优融合伴侣基因之一。近年来，融合蛋白被广泛应用于生物研究，因其具有双方蛋白的活性，可被用于蛋白的表达、检测、识别和纯化。特别是在免疫治疗和免疫分析以及寻求高效、新型重组药物方面显示了其特有的优势。应用生物信息学的相关知识对SIV H1N1 HA基因的氨基酸序列进行疏水性、抗原性、磷酸化位点预测、N糖基化位点预测以及二级结构预测等，对其结构和功能进一步了解和掌握。在了解SIV抗原基因HA的生物信息学基础上，高效可溶表达HA蛋白，用纯化的HA蛋白做成基因工程疫苗进行动物免疫研究；同时用纯化的HA蛋白做包被抗原，建立鉴别诊断猪流感的ELISA方法。 作品的实际应用价值和现实意义从HA基因的生物信息学分析和高效可溶表达两方面进行研究，研究了将重组H1N1亚型SIV HA蛋白作为ELISA诊断抗原的可行性，为检测H1N1亚型SIV抗体的间接ELISA方法的建立奠定了基础，为防治猪流感和研制猪流感基因工程疫苗提供科学依据，对生产实践具有一定的指导意义。学术论文文摘H1N1亚型猪流感病毒（SIV）的血凝素（hemagglutinin,HA)基因在流感病毒传染的过程中与识别靶细胞表面受体在穿膜过程中起重要作用，刺激机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染。我们采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒广东株的血凝素HA基因，测序后对HA 基因进行生物信息学分析。然后将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上，成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达，SDS-PAGE可检测到分子量约为94.0ku的融合蛋白，通过薄层凝胶扫描分析表明表达产物占菌体总蛋白的29.5。经蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90以上是以可溶形式表达的。Western-blot证实，可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。初步建立了检测H1N1亚型SIV抗体的间接ELISA方法。 作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励鉴定结果请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）科研管理部门签章年 月 日C.当前国内外同类课题研究水平概述 说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写； 2.填写此栏有助于评审。 猪流感（swine influenza，SI）是由猪流感病毒(属正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒，它属于单股负链RNA病毒，基因组大约为13.6kb，由大小不等的8个基因片段组成）引起的一种急性、热性、高度接触性的呼吸道传染病，以突发、高热、流泪、鼻液增多、咳嗽、呼吸困难、衰竭为主要特征。该病一年四季均可发生,不同日龄，性别和品种的猪均可感染，此外也能使人发病。早在1918年，猪流感就在美国大流行，此后每年都有发生，并很快蔓延到许多国家。自1930年shop首次从猪体中分离到猪流感病毒后，目前已证实猪流感已遍布世界各地。根据有关研究资料得知在猪体中广泛流行的猪流感病毒，主要是古典H1N1、类禽H1N1和类人H3N2三种亚型。1979年类禽 H1N1猪流感开始了席捲欧洲，在猪群中广为传播，之后逐渐蔓延到亚洲，我国也未能幸免。1998年以前H1N1 猪流感在美国是主要流行。我国的情况更不容忽视，1979年郭元吉对我国不同地区的猪血清进行猪流感检测，H1的平均阳性率为3.8%；而1998年倪汉忠的血清学显示，广东省猪群中H1抗体阳性率为30.9%。张苏华等采用HI和ELISA的方法，于1999年到2002对上海市10区县的30个猪场进行了针对性的调查，结果表明：1999年抗体阳性率为31.6%，而2002年抗体阳性率上升为82.9%。由此说明H1N1流行有上升的趋势。猪流感病毒具有感染人的潜力。据报道1976年，美国新泽西州的一名新兵感染猪源H1N1而死于肺炎。作为流感病毒的“混合器”，猪流感病毒在禽猪人的种间传播中起到非常重要的作用。另外人类流感和猪流感爆发的平行性和相关性,赋予了猪流感非常重要的公共卫生意义。目前研究报道的SIV HA蛋白的原核表达几乎是不可溶的微量表达，很难用于基因工程疫苗制备和建立诊断方法；目前尚没有建立完善的以HA抗原蛋白为包被抗原的鉴别诊断猪流感病毒的方法。 本研究选用pBCX高效可溶表达载体（本研究室改造的载体，正在申请专利）高效表达H1N1 SIV 的HA蛋白。H1N1亚型猪流感病毒（SIV）的血凝素（hemagglutinin,HA)基因在流感病毒传染的过程中与识别靶细胞表面受体在穿膜过程中起重要作用，刺激机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染。我们采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒广东株的血凝素HA基因，测序后对HA 基因进行生物信息学分析。然后将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上，成功构建重组表达质粒pBCX-HA。用msyB基因作为融合伴侣，使HA融合蛋白高效可溶表达，突破了传统大肠杆菌表达系统包涵体表达外源蛋白（多肽）的技术瓶颈。因此选用大肠杆菌msyB多肽基因是构建高效可溶表达载体的最优融合伴侣基因之一。近年来，融合蛋白被广泛应用于生物研究，因其具有双方蛋白的活性，可被用于蛋白的表达、检测、识别和纯化。特别是在免疫治疗和免疫分析以及寻求高效、新型重组药物方面显示了其特有的优势。本研究通过薄层凝胶扫描分析表明表达产物占菌体总蛋白的29.5。经蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90以上是以可溶形式表达的。Western-blot证实，可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。应用生物信息学的相关知识对SIV H1N1 HA基因的氨基酸序列进行疏水性、抗原性、磷酸化位点预测、N糖基化位点预测以及二级结构预测等，对其结构和功能进一步了解和掌握。在了解SIV抗原基因HA的生物信息学基础上，高效可溶表达HA蛋白，用纯化的HA蛋白做成基因工程疫苗进行动物免疫研究；同时用纯化的HA蛋白做包被抗原，建立鉴别诊断猪流感的ELISA方法，为防治猪流感和研制猪流感基因工程疫苗提供科学依据，对生产实践具有一定的指导意义。D.推荐者情况及对作品的说明说明：1由推荐者本人填写； 2推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品 相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组 集体推荐亦可）； 3推荐者填写此部分，即视为同意推荐； 4推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓 名毕英佐性别男年龄62职称教授（博导）工作单位华南农业大学动物科学学院通讯地址广州天河五山483号华南农业大学动物科学学院邮政编码510642单位电宅电话推荐者所在单位签章 （签章） 年 月 日请对申报者申报情况的真实性作出阐述本作品是由谢易恒同学为主的五位同学共同完成，时间从2006年5月到2006年12月。作品内容真实，数据可靠，结论正确。 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价本作品在了解SIV抗原蛋白（HA）的生物信息学基础上，高效可溶表达了HA蛋白，用纯化的HA蛋白做成基因工程疫苗进行动物免疫研究；同时用纯化的HA蛋白做包被抗原，建立鉴别诊断猪流感的ELISA方法，为防治猪流感和研制猪流感基因工程疫苗提供科学依据，对生产实践具有一定的指导意义。当前猪流感免疫疫苗主要是灭活疫苗及弱毒疫苗，因此对亚单位疫苗及基因工程疫苗的研究就显得有广阔的前景，从而有望成为灭活疫苗的有效补充。本作品技术水平高，有推广应用前景。其它说明推荐者情况姓 名曹永长性别男年龄41职称教授/博导工作单位华南农业大学动物科学学院通讯地址广州天河五山483号华南农业大学动物科学学院邮编510642单位电宅电话37212563推荐者所在单位签章 签章日期 年 月 日 请对申报者申报情况的真实性作出阐述本作品是华南农业大学本科课外科技创新论文，在动物科学学院基因工程实验室完成，利用了本实验室成熟的实验技术和已有研究材料，选题具有实践指导意义。谢易恒等五位同学利用课余时间积极参与本研究室的科研工作，熟悉和掌握了各项基因工程实验技术，特别是对基因的生物信息学分析，能熟练查找和应用分析软件，分析结果对基因表达和蛋白生物学活性的预测具有很好的参考价值。内容真实，数据可靠，结论正确。 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价本作品选题新颖且具有实践指导意义，特别对现有猪流感的防治提供了很好的理论指导，为下一步的猪流感基因工程疫苗的制备和猪流感病毒的鉴别诊断打下了很好的基础。本作品选用pBCX高效可溶表达载体（本研究室改造的载体，正在申请专利），可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有很好的免疫反应性。本研究成果对生产实践具有很好的理论和实践指导作用，有推广应用前景。体现了五位同学具有一定的基因工程实验技能，能熟练应用分子生物学软件进行基因和蛋白的生物信息学分析。其它说明学校组织协调机构确认并盖章 （团委代章） 年 月 日 校主管领导或校主管部门确认盖章 年 月 日 各省（区、市）评审委员会初评意见 评委签名： 年 月 日 各省（区、市）组织协调委员会审定意见 团 委 科 协 教 育 厅 学 联（签章） （签章） （签章） （签章） 年 月 日E大赛组织委员会秘书处资格和形式审查意见组委会秘书处资格审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处形式审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处审查结果合格 不合格 负责人（签名） 年 月 日F参赛作品打印处H1N1亚型猪流感病毒血凝素(HA)基因的生物信息学分析和高效可溶表达作者：谢易恒 李栋 莫秋女 苏培穗 陈锦坚指导老师：谢青梅老师作者单位：华南农业大学动物科学学院，广州，510642摘要：H1N1亚型猪流感病毒（SIV）的血凝素（hemagglutinin,HA)基因在流感病毒传染的过程中与识别靶细胞表面受体在穿膜过程中起重要作用，刺激机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染。我们采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒广东株的血凝素HA基因，测序后进行基因生物信息学分析。然后将HA基因克隆到原核表达载体pBCX上，成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达，SDS-PAGE可检测到分子量约为94.0ku的融合蛋白，通过薄层凝胶扫描分析表明表达产物占菌体总蛋白的29.5。经蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90以上是以可溶形式表达的。Western-blot证实，可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。关键词：H1N1亚型猪流感病毒 HA基因 生物信息学分析 高效可溶表达 免疫原性Biological information Analysis and High Soluble Expre-ssion of HA protein of H1N1 subtype Swine InfluenzaVirusAuthor: Xie yi-heng，Li Dong，Mo Qiu-nv，Su Pei-sui，Chen Jin-jiangDirector teacher: Xie Qing-meiCollege of Animal Science,South China Agric.Univ.，Guangzhou 510642,ChinaAbstract：The HA gene of H1N1subtype influenza virus isolated from Guangdong Province was successfully amplified by RT-PCR,then analyzed biological information after translating DNA suquences. And the HA fragment was inserted into plasmid pBCX to obtain recombinant plasimd in which HA gene was fused into. The pMBX-HA was transformd into E.coli BL-21(DE3) to induce HA gene fusion expression. The fusion protein band with relative molecular mass of 94000 was detected on the SDS-PAGE gel, and the soluble expression products accounted for 29.5% of the total E.coli proteins. The soluble form of the expression products was up to 90% the fusion protein. From western-blot analysis of recombinant protein HA, the expression fusion protein and positive blood serum of H1N1 SIV have favorable immunogenicity.Key word：H1N1 subtype Swine Influenza Virus；HA gene；Biological information Analysis；High Soluble Expression猪流感（swine influenza，SI）是由猪流感病毒引起的一种急性、热性、高度接触性的呼吸道传染病。1975年以前，H1N1猪流感病毒以地方流行性存在于欧美大陆，其他地方少有报道；70年代末，H1N1猪流感传入了我国台湾，香港和大陆等地，并在亚洲广泛盛行。1979年类禽 H1N1猪流感开始了席捲欧洲，在猪群中广为传播，之后逐渐蔓延到亚洲，我国也未能幸免。1998年以前H1N1 猪流感在美国是主要流行。我国的情况更不容忽视，1979年郭元吉对我国不同地区的猪血清进行猪流感检测，H1的平均阳性率为3.8%；而1998年倪汉忠的血清学显示，广东省猪群中H1抗体阳性率为30.9%。张苏华等采用HI和ELISA的方法，于1999年到2002对上海市10区县的30个猪场进行了针对性的调查，结果表明：1999年抗体阳性率为31.6%，而2002年抗体阳性率上升为82.9%。由此说明H1N1流行有上升的趋势.猪流感病毒具有感染人的潜力。据报道1976年，美国新泽西州的一名新兵感染猪源H1N1而死于肺炎。作为流感病毒的“混合器”，猪流感病毒在禽猪人的种间传播中起到非常重要的作用。另外人类流感和猪流感爆发的平行性和相关性,赋予了猪流感非常重要的公共卫生意义。生物信息学是一门新兴的交叉学科，是采用计算机技术和信息论方法究蛋白质及核酸序列等各种生物信息的采集、存储、传递、检索、分析和解读的科学，是现代生命科学与计算机科学、数学、统计学、物理学和化学等学科相互渗透而形成的交叉学科。具体的说，生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头，破译隐藏在DNA序列中的遗传语言，特别是非编码区的实质；同时在发现了新基因信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测。应用生物信息学的相关方面对SIV H1N1 HA基因的氨基酸序列进行疏水性分析、抗原性分析、磷酸化位点预测、N糖基化位点预测以及二级结构预测等，对其结构和功能进一步了解和掌握。DNA重组技术又称基因工程技术，为大量获得蛋白质/多肽（以下所称“蛋白质”和“多肽”通用）提供了技术支持。已有不少蛋白质类药物、疫苗、诊断试剂采用基因工程方法生产。要获得大量的具有生物学活性的蛋白质，选择合适的表达系统是关键。在众多的表达系统之中，大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的经典表达系统，具有结构简单、易操作、成本低廉的优点。但采用大肠杆菌高效表达外源蛋白质时，外源蛋白质经常以不溶性的包涵体形式存在。包涵体要用变性剂溶解，再通过复性过程才能得到在缓冲液中溶解的蛋白质。经过复性处理的目标蛋白质不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白质。复性处理工艺也使目标蛋白质的制备成本上升。本研究选用pBCX高效可溶表达载体高效表达H1N1 SIV 的HA蛋白。用msyB基因作为融合伴侣，使HA融合蛋白高效可溶表达，突破了传统大肠杆菌表达系统包涵体表达外源蛋白（多肽）的技术瓶颈。msyB基因编码蛋白是大肠杆菌本身的蛋白，是一种高可溶性多肽，本身在大肠杆菌中表达量很高，其作为载体蛋白具有稳定性、可溶性和表达水平高的特性。当被诱导表达时，msyB多肽作为载体可与同外源蛋白一道分泌到大肠杆菌的胞质中表达，大大增加了外源蛋白的可溶性，且表达的外源蛋白能够产生正确折叠。对那些在胞内表达且表达产物对细菌有毒性的外源基因来说，可以减弱其毒性，提高表达量，提高融合蛋白的稳定性。因此选用大肠杆菌msyB多肽基因是构建高效可溶表达载体的最优融合伴侣基因之一。近年来，融合蛋白被广泛应用于生物研究，因其具有双方蛋白的活性，可被用于蛋白的表达、检测、识别和纯化。特别是在免疫治疗和免疫分析以及寻求高效、新型重组药物方面显示了其特有的优势。融合蛋白使昂贵的细胞因子在兽医上的应用成为可能，由融合蛋白构建的“生物导弹”更是大大提高了药物的效力，因此融合蛋白表达技术是一种极具发展前景的一门技术。本研究就是从以上方面展开的，即从HA基因的生物信息学分析和高效可溶表达两方面进行研究，研究了将重组H1N1亚型SIV HA蛋白作为ELISA诊断抗原的可行性，为检测H1N1亚型SIV抗体的间接ELISA方法的建立奠定了基础，为防治猪流感和研制猪流感基因工程疫苗提供科学依据，对生产实践具有一定的指导意义。1、材料1.1 病毒猪流感病毒毒株：A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)华南农业大学动物科学学院基因工程实验室保存。1.2 菌种基因工程宿主菌E.coli DH5由本实验室保存，基因型为supE44,lacU169(80,lacZM15),hsdR17,recA1,endA1,gyrA96,thi-1,relA1。表达菌E.coli BL-21（DE3）由本实验室保存，基因型为hsdS, gal(cts 857, indl ,Sam7 ,nin5 ,LacUV5-T7)。pGEM-T Easy载体质粒（图1）系统为Promega公司产品; pBCX质粒（图2）本实验室保存。图1 质粒pGEM-T Easy的结构示意图Fig.1 Sketch map of the plasmid pGEM-T Easy图2 pBCX载体的结构示意图Fig.2 Sketch map of the plasmid Pbxc Easy1.3 常用培养基以及试剂LB液体培养基、LB固体培养基、LA固体培养基（含氨苄青霉素100g/mL）、氨苄青霉素100mg/mL、0.22m滤膜过滤除菌、无RNA酶的DEPC水、50TAEAMV反转录酶（5U/L）、HRP RNA酶抑制剂（40U/L）、限制性内切酶Nde I、EcoR I、小牛碱性磷酸酶（CIAP）、T4 DNA连接酶及相应缓冲液，Ex Taq DNA聚合酶（5u/L）均为TaKaRa产品。dNTPs（2.5mM each）、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、DEPC、饱和酚购自上海生工生物工程公司；IPTG、Amp、溴化乙锭（EB）购自宝泰克生物科技有限公司；琼脂糖购自基因有限公司；Sephacryl-S-200聚丙烯酰胺凝胶购自Pharmacia公司；丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、TEMED（N，N，N,N-四甲基乙二胺）为TaKaRa产品；6xHis-Tag 融合蛋白亲和层析Ni-NTA 凝胶购于德国Qiagen公司 。DNA片段快速纯化/回收试剂盒（E.Z.N.A. Gel Extraction Kit）为TaKaRa公司产品；质粒DNA抽提试剂盒（E.Z.N.A. Plasmid Minipreps Kit）为Omega公司产品。1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）、5SDS-PAGE上样缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液、分离胶缓冲液（pH8.8）、浓缩胶缓冲液（pH6.8）。1.5 Western blot试剂转移缓冲液：25mM Tris，192mmol/L甘氨酸，20%（v/v）甲醇，0.037%（v/v）SDS，用HCl调pH至8.3。TBS缓冲液：150mmol/LNaCl，10mmol/L Tris-Cl（pH7.5）。封闭液：5%脱脂奶粉，用TBS缓冲液配制，4保存。抗体稀释液：1%脱脂奶粉/TBS，用于稀释抗体，4保存。显色液：在9mlL0.01mol/L Tris-Cl（pH7.6）缓冲液中溶解6mg二氨基联苯胺，加入1mL 0.3%的氯化钴，最后加入10L 30%的双氧水，混匀后立即使用。1.6 蛋白纯化试剂Lysis buffer (pH 8.0)：50 mmol/LNa2HPO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑。Wash buffer (pH 8.0)：50 mmol/LNa2HPO4，300mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑。Elution buffer (pH8.0)：50 mmol/LNa2HPO4，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑。1.7 抗体猪禽流感H1N1标准阳性血清 由广东省兽医防疫站惠赠，辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG(二抗)购自广州博理生物技术公司。1.8 主要仪器及设备PCR Express Gradient PCR仪（法国HYBAID公司）；BIO-ID凝胶成像及分析系统（法国VILBER LOURMAT公司）；JY92-11超声波细胞粉碎机（浙江宁波新芝科器研究所）；EC570-90蛋白质电泳仪（美国Therom Forma公司）；冷冻高速离心机（德国SIGMA公司）；超低温冰箱（美国Therom Forma公司）；空气摇床（美国Therom Forma公司）；WD-9504型生化摇摆平台（北京沃德生物医学仪器公司）；DYY-6B型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；AIR-TECH 医用超净工作台（上海沙泸净化设备厂）。2、方法2.1引物设计与合成应用DNAStar（4.0）软件，参照GenBank中注册的H1N1猪流感病毒血凝素基因（HA）序列，设计引物HAup1/HAdn1用于扩增H1N1亚型猪流感的HA基因，引物理论跨幅分别为1701bp。引物由上海博亚生物工程公司合成。合成后的引物用三蒸水稀释成25mmol/L溶液，-20保存。引物序列如下：HAup1：5- ttatgaaggcaatactagtgttc-3HAdn1：5-tttcagatgcatattctgcactg-3 2.2 病毒RNA的提取按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书进行,经DEPC处理的无RNA酶的三蒸水溶解沉淀，直接用于RT-PCR或-80保存。2.3 HA基因RT-PCR反应和cDNA的扩增2.3.1 HA基因cDNA第一链的合成参照TaKaRa的AMV反转录酶的使用说明进行，在20L反应体系中分别加入以下组分，混匀后，室温放置10min，42保温1h，冰浴2min，RT产物直接用于PCR扩增，或-20保存。RNA 3 L5buffer4 LdNTPs4 LRNA酶抑制剂0.5 LHAup11 LHAdn11 LAMV 2 LDEPC水3.5 L2.3.2 HA基因cDNA的PCR扩增PCR反应体系为：10buffer10LdNTPs4LHAup11LHAdn11LcDNA5LEx Taq1LddH2O78L将上述反应物混匀，在PCR Express Gradient PCR仪上按下列反应条件进行扩增：扩增HA基因的程序为：94预变性3min；94变性40sec、50退火50sec、72延伸2.5min，循环30次；最后72延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测。2.3.3 PCR产物的凝胶回收与纯化按TaKaRa公司凝胶纯化试剂盒说明书进行。将PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外透射仪上，用手术刀片切下含目的条带的凝胶，以3倍体积的溶胶缓冲液，65水浴使之完全溶化，加入离子交换柱，12,000r/m离心1min，弃去滤液，用含酒精的洗脱液清洗2次，10,000r/m离心1min甩干残液，将适量双蒸水加入交换柱，于50-60保温数分钟，10,000r/m离心1min，收集滤液，用琼脂糖电泳检测回收效果。回收的PCR产物在Ex Taq作用下加尾，可直接用于连接。2.4 T-HA重组质粒的构建2.4.1 PCR产物与pGEM-T Easy载体的连接连接反应体系为（共10L）：2buffer 5L加尾的PCR产物 3LpGEM-T Easy 1LT4DNA连接酶 1L混匀后稍离心后，于4条件下连接过夜。连接产物直接用于转化。2.4.2 DH5感受态细胞的制备参照金东雁等（1996）的分子生物学常用实验方法，用CaCl2法制备感受态细胞。2.4.3 连接产物转化感受态细胞取上述制备的感受态细胞50L，加入2.4.1中制备的连接产物5L，混匀后冰浴30min，42热休克90sec，迅速转移到冰浴中冷却2min，加入200L不含抗生素的LB液体培养基，于37摇床中以160r/m振摇培养45min；取100L菌液涂布于含Amp的LB平板中，37培养过夜。2.4.4 转化子的筛选、鉴定从上述过夜培养的平板中挑取单个菌落，接种于3mL含Amp的LB液体培养基中，37振摇培养过夜，分别用PCR和酶切反应进行鉴定。2.4.5 转化子的PCR筛选直接以菌液作为模板进行PCR鉴定。反应体系、PCR反应程序同2.3.2。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。经PCR鉴定为阳性的重组质粒，命名为T-HA。2.4.6 HA基因的序列测定选择经PCR鉴定为阳性的重组质粒的菌液送交上海博亚生物技术有限公司进行核苷酸序列测定。2.5 HA基因的碱基序列分析用DNAstar软件对HA基因进行序列分析。2.6 HA基因推导氨基酸序列的生物信息学分析 将所测序列用DNAstar软件包进行同源性和抗原性分析，利用Bioedit7.0进行疏水性分析，将序列提交到丹麦技术大学生物序列分析中心（CBS）网站http:/genome.cbs.dtu.dk/servises/NetNGlyc/进行跨膜区、磷酸化位点预测和N-糖基化位点预测，递交到英国皇家科学技术医药学院结构生物学研究组的蛋白质三维预测在线网站http:/www.sbg.bio.ic.ac.uk/servers/3dpssm/进行二级结构预测。2.7 pBCX对H1N1亚型猪流感HA基因在大肠杆菌中高效可溶表达2.7.1 引物的设计与合成根据测定的H1N1亚型猪流感HA基因序列设计1对引物，即HAup/HAdn，该片段理论跨度为1680bp，编码560个氨基酸，在HAup5端加上BamHI酶切位点 （斜体） 和保护碱基，在HAdn加上SalI酶切位点（斜体）和终止密码。引物由上海博亚生物工程公司合成。合成后的引物用三蒸水稀释成25mmol/L溶液，-20保存。引物序列如下：HAup：5-ATGGATCCGACACAATATGTATA-3HAdn：5- ATGTCGACGATGCATATTCTGCACT-3 2.7.2 HA基因的PCR扩增用HAup/HAdn引物对从T-HA重组质粒上扩增HA基因片段，100L PCR反应体系的组成为： 10buffer10LdNTPs8LT-HA1LHAup1LHAdn1LExTaq酶1LddH2O78LPCR扩增反应在MJ-100型热循环仪上进行。扩增条件为：循环1：94预变性3min，循环2-30：94 40s、50 50s、72 2.5min；72延伸10min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶（含0.5g/mL的溴化乙锭）电泳检测，电泳条件为100V 15min。用Vilber Lourmat凝胶成像系统观察并记录结果。2.7.3 PCR产物纯化按TaKaRa公司凝胶纯化试剂盒说明书进行，方法同.4 PCR产物的酶切将纯化的HA基因片段的PCR扩增产物用适量ddH2O溶解，在100L反应体系中加入下列反应物，于37消化4h。10Buffer 10LBamHI 5LSalI 5LPCR产物 20LddH2O 60L2.7.5 酶切产物的凝胶回收将酶切的PCR产物用1%琼脂糖电泳纯化，电泳条件为80V、30min，在紫外灯下切下目的条带，用DNA片段凝胶回收试剂盒回收HA基因片段。按TaKaRa公司凝胶纯化试剂盒说明书进行，同2.3.3。用1%琼脂糖电泳检测回收效果，回收的酶切产物用于与质粒连接。2.7.6 质粒载体pBCX的制备与消化在LA平板上划线培养含有pBCX质粒的E.coli DH5，37温箱中培养16h。挑取单菌落接种于3 mL LA培养基中，37、200 r/m振摇培养16-20h。将3mL菌液分装于2只1.5mL离心管中，4、3500r/m离心10min，沉淀细菌。按照E.Z.N.A. Plasmid Minipreps Kit质粒DNA抽提试剂盒说明书抽提质粒，质粒DNA溶解于50L ddH2O中。取2L进行琼脂糖凝胶电泳，检测质粒的纯度，用紫外吸收法测定质粒DNA含量。在100L pBCX质粒的酶切反应体系中加入下列反应物，于37酶切消化4h。10buffer10LBamHI 5LSalI5LCIAP1LpBCX25Ldd H2O54L2.7.7 质粒酶切产物的回收按DNA片段凝胶回收试剂盒说明书从琼脂糖电泳凝胶中回收酶切的pBCX质粒载体，方法同2.3.3。2.7.8 HA基因片段pBCX质粒的连接将经酶切消化、凝胶纯化后的HA基因片段与质粒酶切产物按T4 DNA连接试剂盒说明连接0.5h。在10L的连接反应体系中加入下列反应物，连接产物直接用于转化DH5。10 连接缓冲液1LHA基因片段3.5LpBCX1.5LT4 DNA连接酶1LDd H2O3L2.7.9 连接产物转化E.coli DH5受体菌取2.7.8中的连接产物5L加入到50 L E.coli DH5感受态细胞中，混匀，冰浴30 min；42热休克90sec，而后迅速转移到冰浴2min；加入200L LB液体培养基，于37以160r/m振摇培养45min。然后取200L菌液涂布于LA固体琼脂培养基，37培养18h。2.7.10 转化子的PCR鉴定挑取LA平皿上的抗性单菌落于3mL LA培养液中，37振摇培养1012h，以菌液为模板，以特异性的HAup/HAdn引物对进行PCR鉴定，反应体系如下： 10PCR buffer2L菌液0.5LdNTPs2L（2.5mM）Ex Taq酶0.1L(5U/uL)HAup0.5L（20uM）HAdn0.5L（20uM）ddH2O补至20LPCR扩增执行程序同2.7.2。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将出现预期PCR扩增条带的转化子，初步确定为插入了HA基因片段的阳性转化子。2.7.11 重组质粒的限制性内切酶酶切鉴定选择37培养过夜的阳性转化子，用E.Z.N.A. Plasmid Minipreps Kit抽提质粒。将含有HA基因的重组质粒命名为pBCX-HA。对pBCX-HA重组质粒用BamHI和SalI进行酶切鉴定。酶切反应体系组成分别如下：10buffer2LBamHI1LSalI1LpBCX-HA5LddH2O11L混匀离心后，37反应4h，取5L反应液，用1%琼脂糖凝胶（含0.5g/mL EB）电泳对酶切反应产物进行检测。对于重组质粒酶切鉴定获得预期条带的转化子，在LA琼脂培养基上划线，37培养细菌，挑取单菌落，接种于3mL LA液体培养基中，37振摇培养过夜，取菌液进行DNA序列测定。2.7.12 HA基因在大肠杆菌BL21中的表达 重组质粒转化BL21感受态细胞 取质粒pBCX-HA 1L转化大肠杆菌BL21感受态细胞，BL21感受态细胞的制备过程同2.4.2，连接产物转化感受态细胞步骤同2.4.3，最后取菌液涂布含有100g/mL Amp 的LB琼脂培养基上，37培养1216h。在LA转化平板上挑取单个阳性菌落，据0中的方法直接用菌液为模板进行PCR检测。鉴定为阳性的单菌落扩大培养，将含有pBCX-HA的细菌命名为pBCX-HA-BL21。 IPTG诱导目的蛋白的表达将中PCR鉴定为阳性的转化菌pBCX-HA-BL21划线培养；挑取单菌落接种于3mL LA液体培养基中，37，220r/m的空气摇床中培养10h，取出菌液，置4冰箱过夜；按1%比例将上述菌液接种于3mL LA液体培养基，37，220r/m振摇培养；当OD600为0.40.6时，加入终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导表达，取05h菌液，12 000rpm离心2min，去上清，细菌沉淀中加100L 1SDS上样缓冲液，-80冻融三次，沸水中煮35min，12000r/m离心2min，取上清进行SDS-PAGE电泳。同时，设pBCX 空质粒 作为对照。pBCX-HA-BL21表达的融合蛋白命名为msyB-HA。 表达产物的SDS-PAGE电泳按金东雁等（1996）介绍的方法制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）。2.7.13 HA蛋白的Western blot检测按照蛋白技术手册中的方法进行（汪家政等，2000）。用的一抗是猪的H1N1亚型SIV阳性血清，二抗是HRP标记的山羊抗猪IgG。3 结果与分析3.1 HA基因的RT-PCR扩增对H1N1亚型的SIV HA基因进行RT-PCR扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，研究发现在约1 500bp出现特