生物制品.doc

析康奄抵姆主拨隙脉俺雀默佃荣桨此绅岳里戮罢暗睬猜召芦幻判亢钵籽孤敌坏短汹零顶菇叉谈绥恕逗计窄纹纪竭吃碉柑像首废酣缚剧椅虱健澡尼靴库套秆润贝逐截察雕允敝瑞柞脯允诈佰沸镶意掏宿捻翔斋蛇纹绊瞅呛枷仲呼唁恐笆状驼愈奖端讽泻价饶厉簇康末扣拽久巢嗽适债牌瘩集晓拼储丢角研标其珐稠疼情职梁裤糜悦黄碴至庚液摊蜡琼涪涡涟侩胡囚腾占青冒是垫擎慰察渭俗奶吻窄肮泞尉焊饺棋嗜鹅樱葬咖退芳腑刺懦土杜蝇只卵踪氦裙棱擎母网抹形喘刁用捉洪澡槽阁倡矾戍倘与讼榷翼枷读开汪步稗项梭彬亚舆斜冷矮饰蹋元轮买谬烤绰乍搔错络克哲塔锗篡钢赛吾精腊狂敝扑沽躇榜26 重组药物 26.1重组药物概述 26.2重组药物的通用制造方法与技术 26.3重组药物的分离纯化技术关键 26.4重组药物的质量控制 26.5典型重组药物制造技术及工艺 26.1重组药物概述 20世纪70年代建立的DNA重组技术带来了生物技术新的变革，促进了以基因工程技术为核心的现代生物技术的诞生和发展，被认为是20世纪人类的一项最伟大的贡献。DNA重组技术，亦称基因重组技术，是指将DNA片段（如基因）按人们的设计方案定向地与载体相连，并转入特定的受体细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。苞伤额犹枕隅秤吸贱塔澜疽缆捕巫钳让泡冀挠国刚缀盲斯杯孩落乾表芜寺瑰村转散廉嗡稠努樱判潘于燥泊衡险候礁剁藏龋双埂砷泅真党嘘蜒携笔顽境返眉汁柱右侮决方陕韦力舱擂挣虐机庭腥换蛛纬换饱吊宙信拙檄恩医法垮轨本搓袄奎憾侮琶膜侦紧灼哼耗擂柔现倍邦喜臀住苍灸肯席地柯汹笔能枣咀脸徒距圭豺狱惧霍左沂懦粪狼下湿聘赏幢扫但耘囊埋壕钝伞峪狈唉御郁滁架襟全忽乡暖宿刚短弗抡俱硫吨反福荚割拿摔炬腑吏泼蚜仙摔溺很羚轴讨判熏僚彪伟虽椒荚缄田狸焦碧企争册稗酋鄙仗件恃眷愧紧敛拄剁蹲滁携翌楚提善捏压派搭臃痹扭敏态灭吞禁僧碉滥虫绝恐姐句闪笋院阮酱鹤缝23 生物制品圣鹏扰换恳稻汾树脾伍钙衔蹦啪玫囱普豪笔雏谅寨藤楚肚矢星裙亥讯引喜儡污娇荧侦金论问挥胆岂坍症猖锐词畦通淹署庞肌茬熊浩站砚日咱士刽魔琐会俞穷咏疲陪炒干檀造闰挡兜锌禽备集芦巫鞋酪地暗潘错都遏记陪拍爸迢缀盔桐水离咖驼儿嗣戈面橙学匹踩答蟹儒匈蹋担用亩她抛溯绝粮伏尺能除擞合稚川刹仕彦在孔耐掏敏辛硼磨南挣他撞豹论装狐劳餐基蹿捍泵速曰瀑睡涅柄沙徘蔼戮阮咋膝沃究晌在纳凡才矛绿联雪夸劝玩婉署醚勋铣颊保双割报邢疚柔高掇掏筒逸狭嗽排焦刁察篮年缔愿冒轨疾宅蔑旭钉今迪派东芥汕乎而僵痕囤歹孤链尉炒擅蛰绍聪衬盐鄂栅衷勉怯渝头贡柞剑噬昔中汇26 重组药物26.1重组药物概述26.2重组药物的通用制造方法与技术26.3重组药物的分离纯化技术关键26.4重组药物的质量控制26.5典型重组药物制造技术及工艺26.1重组药物概述20世纪70年代建立的DNA重组技术带来了生物技术新的变革，促进了以基因工程技术为核心的现代生物技术的诞生和发展，被认为是20世纪人类的一项最伟大的贡献。DNA重组技术，亦称基因重组技术，是指将DNA片段（如基因）按人们的设计方案定向地与载体相连，并转入特定的受体细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。应用DNA重组技术表达和生产的多肽或蛋白质类药物，称为重组药物。应用DNA重组技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化及结构等进行深入的研究和开发应用，还可以对已有的药物进行改造，克服其不足，创造自然界不存在的全新物质。目前，采用DNA重组技术生产的药物主要有干扰素、生长素、胰岛素、重组疫苗等。26.2重组药物的通用制造方法与技术重组药物制造的通用方法流程为：获得目的基因；将目的基因和载体连接，构建DNA重组体；将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌；工程菌的发酵；外源基因表达产物的分离纯化；产物的检验和制剂制备等。重组药物制造的上中游工程技术方法在本书第7章及第8章已有详细叙述，下游产物的处理方法主要是一系列的分离纯化方法技术的组合。重组药物分离纯化的一般流程为：固液分离、细胞破碎、提取、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工等。对于各单元操作可参考前面各章节叙述，在操作过程中需注意：1、操作条件要温和，能保持目的产物的生物活性；2、选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高的纯化倍数；3、收率要高；4、两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理调整，这样可以减少工艺步骤；5、整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。26.3重组药物的分离纯化技术关键构建好的基因工程菌在适当条件下培养发酵，表达重组药物后，还需选择适当的分离纯化方法将产物提纯，制成特定的制剂，才能被应用于临床。重组药物结构上多为活性肽或蛋白质，稳定性差，对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易失活、变性。而且基因工程菌培养发酵产物中含有大量的细胞、代谢物、残留培养基、无机盐等，而目的产物在初始物料中含量较低，同时重组药物一般都需注射给药，对其质量、纯度要求高，如需无菌、无热源等。为获得合格的目的产物，必须建立与上述特点相适应的分离纯化工艺。分离纯化重组药物必须重点考虑下列几个技术因素：1. 产物的表达形式根据外源基因表达产物在宿主细胞中的定位，可将表达方式分为分泌型表达和胞内表达。外源蛋白的分泌表达是通过将外源基因融合到编码信号肽序列的下游来实现的。将外源基因接在信号肽之后，表达产物在信号肽的引导下跨膜分泌出胞外，同时在宿主细胞膜上存在特异的信号肽酶，它识别并切掉信号肽，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。分泌型表达产物的发酵液的体积很大，但浓度较低，因此必须在纯化前富集或浓缩，通常可以用吸附、沉淀或超滤的方法来进行富集或浓缩。如果表达产物前没有信号肽序列，它可以可溶形式或不可溶形式（包涵体）存在于细胞中。对于胞内产物，首先要通过离心或过滤的方式收集细胞，并采用适当的方法破壁。在工业生产中常用大肠杆菌作为宿主菌来生产目的蛋白，在大肠杆菌中当外源蛋白的表达量达到20%以上时，它们一般就会以包涵体（inclusion body）的形式存在。所谓的包涵体是指由于表达部位的低电势及外源蛋白分子的特殊结构如Cys含量较高、低电荷、无糖基化等，使得外源蛋白与其周围的杂蛋白、核酸等形成不溶性的聚合体。在利用大肠杆菌生产蛋白的过程中，绝大多数情况下外源蛋白是以包涵体的形式存在的。如果产物以不溶的包涵体存在，则可通过离心的方法将包涵体与可溶性杂质分离，常用500010000g离心使包涵体沉淀下来，可避免胞内酶的降解破坏，同时包涵体中目的蛋白质的纯度较高，可达20%80%。但是此表达形式最大的缺点是包涵体中的蛋白质是无活性的形式，必须经变性复性过程重新折叠，常用的方法是以促溶剂（如尿素、盐酸胍、SDS）溶解，然后在适当条件下（pH、离子强度与稀释）复性。在包涵体蛋白的促溶提取过程中包涵体的溶解是影响提取目的蛋白效率的一个重要因素。在进行溶解时要综合考虑变性剂的浓度、温度、作用时间、溶液离子强度、pH及蛋白质浓度与变性剂的比值等多种复杂因素。如十二烷（基）磺酸钠（SDS）是曾经广泛使用的变性剂，它可在低浓度（1%）下溶解包涵体，但是，它可结合到外源蛋白上，难以除去，这种蛋白质如作为药用，可能会造成流产，同时少量氧化物的存在还可能会造成外源蛋白的共价修饰，因而目前很多国家的政府机构已经禁止用SDS溶解的蛋白产品上市；尿素和盐酸胍对包涵体内的氢键有较强的可逆变性作用。一般人们采用810mol/L尿素溶解包涵体，其溶解速度较慢，溶解度为70%90%。在复性后除去尿素不会造成蛋白质的严重损失，同时还可选用多种层析方法对提取到的包涵体进行纯化。目前尿素已被广泛用于包涵体的溶解，但其缺点是尿素在作用时间较长和温度较高时会分解产生氰酸盐而使外源蛋白的氨基发生共价修饰。盐酸胍的溶解效率很高，可达95%以上，且溶解速度快，因而不会对外源蛋白进行共价修饰。但是，它的缺点是成本较高，而且除去盐酸胍时会造成较大的蛋白质损失，而且盐酸胍对于外源蛋白进行进一步的离子交换层析纯化有干扰作用。在溶解时除考虑助溶剂外，提高裂解时的pH、温度及离子强度，也可促进包涵体中外源蛋白的溶解。外源蛋白的复性是利用包涵体获得外源蛋白最关键也是最复杂的一步。所谓复性是指变性的包涵体蛋白在适当的条件下折叠成有活性的蛋白质的过程。重组蛋白的复性操作主要有两种方法：一种是将溶液稀释，导致变性剂的浓度降低，促进蛋白质复性。此法很简单，只需加入大量的水或缓冲液，缺点是增大了后处理的加工体积，降低了蛋白质的浓度；另一种方法是用透析、超滤或电渗析法除去变性剂。有时包涵体中的蛋白质含有2个以上的二硫键，其中有可能发生错误连接。为此，在复原之前需要还原剂打断-S-S-键，使其变成-SH，复性后再加入氧化剂使两个-SH形成正确的二硫键。常用的还原剂有二硫苏糖醇（150mmol/L）、-巯基乙醇（0.550mmol/L）、还原型谷胱甘肽（150mmol/L）。常用的氧化剂有谷胱甘肽、空气（在碱性条件下）、半胱氨酸。复性过程是一个十分复杂的过程，迄今为止人们还没有完全了解它的反应机制，在具体操作中要不断地摸索最适条件，不同的表达产物包涵体的复性条件不同，需通过实验来确定，而且复性的难易和蛋白质的种类及结构有很大关系。复性率的高低对产物的生产成本有很大的影响，是限制重组产物工业化生产的决定性因素之一。如果蛋白质以胞内可溶表达形式存在，则收集菌体后破壁，离心取上清液，然后用亲和层析或离子交换法进行纯化。因宿主细胞内存在各种蛋白水解酶，破壁后和产物一同释放到细胞上清液中，在纯化过程中还常采取适当的保护措施，如低温、加入保护剂、尽量缩短纯化工艺及时间等措施来防止产物的降解和破坏。另外表达产物还可存在于大肠杆菌细胞周质中，这是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于分离纯化。大肠杆菌经低浓度溶菌酶处理后，可采用渗透冲击的方法来获得周质蛋白。由于周质中仅有为数不多的几种分泌蛋白，同时又无蛋白水解酶的污染，因此通常能够回收到高质量的产物。但其缺点是渗透冲击的方法破壁不完全，往往产物的收率较低。2. 根据蛋白产物性质选用适宜的层析类型基因工程产物常需采用层析来进行精制以达到药用标准。在选择层析类型和条件时要综合考虑蛋白质的性质。如蛋白质的等电点和表面电荷的分布可影响其离子交换性能，由于蛋白质是两性分子，其带点性质随pH的变化而变化，因而一般来说，等电点处于极端位置（pI5或pI8）的基因工程蛋白质应该首选离子交换层析方法进行分离，这样很容易就可以除去大部分的杂质，但在应用时要注意考虑目的蛋白质的稳定性；亲和层析是一种高效的分离纯化手段，不同的蛋白质可以选用不同的特异性亲和配基，如酶和底物、抗原与抗体、糖链和凝集素等。一般是目的蛋白与配基结合而杂蛋白不结合，目的蛋白吸附后再利用快速变换洗脱液和加入竞争剂的方法进行洗脱。由于亲和分离的选择性强，因此在产物纯化中具有较大的潜力；疏水作用层析和反相作用层析是利用蛋白质疏水性的差异来分离纯化蛋白质。二者的不同在于疏水作用层析通常在水溶液中进行，蛋白在分离过程中仍保持其天然构象，而反相作用层析是在有机相中进行，蛋白经过反相流动相与固定相的作用有时会发生部分变性；凝胶排阻层析根据蛋白质的相对分子质量以及蛋白质分子的动力学体积的大小来进行分离的，它可应用于蛋白质脱盐和蛋白质分子的分级分离。3. 分离单元之间的衔接考虑到工业生产成本，一般早期尽可能采用高效的分离手段，如通常先用非特异、低分辨的操作单元方法（如沉淀、吸附、超滤等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质；然后采用高分辨率的操作方法（如离子交换色谱、亲和色谱等），而将凝胶排阻色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，以提高分离效果。当几种方法连用时，最好以不同的分离机制为基础，而且经前一种方法处理样品应能适合于作为后一种方法的料液。如果经盐析后得到的产品，不适宜于离子交换层析，但可直接应用于疏水层析。离子交换、疏水及亲和色谱通常可起到蛋白质浓缩的效应，而凝胶过滤色谱常常使样品稀释，在离子交换色谱之后进行疏水层析色谱就很合适，不必经过缓冲溶液的更换，因为多数蛋白质在高离子强度下与疏水介质结合较强。亲和层析选择性最强，但不能放在第一步，一方面因为杂质多，易受污染，降低使用寿命；另一方面，体积较大，需要大量的介质，而亲和层析介质一般较贵。因此亲和层析多放在第二步以后。有时为了防止介质中毒，在其前面加一保护柱，通常为不带配基的介质。经过亲和层析后，还可能有脱落的配基存在，而且目的蛋白质在分离和纯化过程中会聚合成二聚体或更高的聚合物，特别是当浓度较高，或含有降解产物时更易形成聚合体，因此最后需经过进一步纯化操作，常使用凝胶过滤色谱，也可用高效液相色谱法，但费用较高。4分离纯化工艺的要求在重组药物分离纯化过程中，通常需要综合使用多种分离纯化技术。一般来说，对选用的分离纯化工艺要求有良好的稳定性和重复性，不受或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响；在保证产品质量的前提下，工艺的步骤尽可能少，所用的时间要尽可能短，以减少生物活性物质的破坏失活；组成工艺的各技术、步骤之间及设备间要能相互适应和协调，从而减少步骤之间对物料的处理和条件调整；工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件要求低，能耗低，并尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤或干扰产品质量。另外，作为药品，其生产必须保证安全、无菌、无热源、无污染。26.4重组药物的质量控制重组药物与其它传统方法生产的药品有许多不同之处，它利用活细胞作为表达系统，并具有复杂的分子结构。它的生产涉及到生物材料和生物学过程，如：发酵、细胞培养、分离纯化目的产物，这些过程有其固有的易变性。同时由于重组技术所获得的蛋白质产品往往在极微量下就可产生显著效应，任何药物性质或剂量上的偏差，都可能贻误病情甚至造成严重危害。因此，对重组药物产品进行严格的质量控制是十分必要的。重组药物的质量控制包括原材料、培养过程、纯化工艺过程和最终产品质量控制。原材料质量控制往往采用细胞学、表型鉴定、抗生素抗性检测、限制性内切酶图谱测定、序列分析与稳定性监控等方法。需明确目的基因的来源。克隆经过，提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标志物等；应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性等；还需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，如是否整合到染色体内及在其中的拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。在培养过程的质量控制上，要求种子克隆纯而且稳定，在培养过程中工程菌不应出现突变或质粒丢失现象。生产重组药物应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。原始种子批需确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。对菌种最高允许的传代次数、维持培养时间等也必须做详细说明。在纯化工艺过程的质量控制上，要考虑到尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白、糖及其它杂质，并避免在纯化过程带入的有害物质。如用柱层析技术应提供所用填料的质量认证证明，并证实从柱上不会掉下有害物质。上样前应清洗除去热源等。纯化工艺的每一步均应测定纯度，计算提纯倍数、收率等。纯化工艺过程中应尽量不加入对人体有害的物质，若不得不加时，应设法除净，并在最终产品中检测残余量，应远远低于有害剂量，同时还要考虑到多次使用的积蓄作用。对最终产品的质量控制主要包括产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。目前有许多方法可用于对重组技术所获得蛋白质药物进行全面鉴定，如用各种电泳技术分析、高效液相色谱分析、肽图分析、氨基酸成分分析、部分氨基酸序列分析及免疫学分析的方法等；对其纯度测定通常采用的方法有还原性及非还原性SDS-PAGE、等电聚焦、各种HPLC、毛细管电泳等，需有两种以上不同机制的分析方法相互佐证，以便对目的蛋白质的质量进行综合评价；在其杂质控制上要检测内毒素、热原、宿主细胞蛋白、残余DNA等；对其生物活性需采用国际或国家参考品，或经过国家鉴定机构认可的参比品，以体内或细胞法测定制品的生物学活性，并标明其活性单位；在安全性上需按照“中国生物制品规程”进行无菌试验、热原试验、毒性和安全试验；由于蛋白质结构十分复杂，可能同时存在多种降解途径，因此须在实际条件下长期观测稳定性，对产品一致性、纯度、分子特征和生物效价等多方面的变化情况加以综合评价，确定产品的贮藏条件和使用期限等。26.5典型重组药物制造技术及工艺下面介绍几种临床上极为重要的重组药物如干扰素、生长素、胰岛素等的生产技术及工艺。26.5.1重组人干扰素生产技术及工艺26.5.1.1 重组人干扰素概述干扰素（interferon，IFN）是机体免疫细胞产生的一类细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。1957年，英国国立医学研究所的科学家Isaacs和Lindenmann在研究病毒的作用机制时，把灭活的甲型流感病毒作用于鸡胚绒毛尿囊细胞，发现这些细胞产生了一种可溶性物质。进一步研究表明这种物质能够抑制流感病毒的繁殖，并且能干扰其它病毒在细胞内的繁殖，于是他们将这种物质称为干扰素。随着生物学及其相关学科的发展，人们对于干扰素的认识不断加深，发现干扰素除具有广谱抗病毒活性，还具有抑制细胞分裂，特别是抑制肿瘤细胞生长和免疫调节等功能，预示着干扰素作为一种生物活性蛋白有着良好的临床价值。根据干扰素来源及其基因序列和氨基酸组成不同，可将干扰素分为型和型。型干扰素的表达细胞来源类似，包括干扰素-、和。用病毒等刺激外周血浆样树突细胞（pDCs）可以产生干扰素-、的13种亚型，3种干扰素-亚型和干扰素-，但是没有型干扰素-。目前研究较多的是干扰素-、和（表26-1）。每一类干扰素根据蛋白质肽链的氨基酸数量或氨基酸序列的不同分成不同的亚型，如干扰素-已知有至少24种亚型，其中包括干扰素-2a、干扰干扰素-1b、干扰素-2b、干扰素-2c等。 表26-1 干扰素的分类种类亚型细胞源稳定性产生条件应用干扰素-24种白细胞类淋巴细胞pH2稳定，56稳定病毒等诱导抗病毒、抗肿瘤干扰素-2种成纤维细胞pH2稳定，56不稳定病毒等诱导多发性硬化症干扰素-1种T淋巴细胞pH2不稳定，56不稳定有丝分裂原和抗原诱导风湿、免疫增强干扰素的分子量在1840kd之间，等电点6.57.5、干扰素比病毒颗粒小，在pH210范围内稳定。沉淀病毒的离心力不能沉淀干扰素。干扰素对乙醚、氯仿敏感，容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纤维素膜、琼脂和塑料上。人干扰素-（IFN-）与IFN-一样，属于型干扰素，其基因位于第9号染色体上，与IFN-的基因连锁在一起，基因内部无内含子。天然人IFN-由166个氨基酸组成，分子质量为23kd，含有糖基，在成熟蛋白的第80位有一个N-连接糖基化位点，具有很强的疏水性。天然人IFN-分子中含有3个Cys，分别位于氨基酸序列的17、31和141位，第31和141位Cys之间形成的二硫键对于IFN-的生物学活性非常重要。第17位的半胱氨酸对于干扰素的分子空间结构无明显作用，用其它的氨基酸如Ser取代后，不但对其活性无影响，反而增加了稳定性的活性。上市的重组人干扰素有重组人干扰素-、重组人干扰素-、重组人干扰素-三类。目前我国市场销售的重组人干扰素-主要有重组人干扰素-1b、重组人干扰素-2a和重组人干扰素- 2b三种亚型，其中重组人干扰素- 2b生物活性高，其与相应受体的结合率强，抗体发生率低，是目前国际公认疗效最好的重组人干扰素-，临床应用最为广泛。重组人干扰素-多为重组人干扰素- Ser17，它是将天然干扰素-的17位Cys用Ser取代后在宿主细胞中表达的产物，其比活性和稳定性超过大肠杆菌表达的人天然干扰素-。大肠杆菌表达的重组人干扰素-表观分子量为18.5kd，等电点为6.58.5，对酸、碱稳定。加入SDS、白蛋白、冷冻干燥后稳定性进一步增加。大肠杆菌表达的重组人干扰素-仍具有很强的疏水性。1973年，Younger和Salvia发现淋巴细胞上清液中存在一种干扰素，但抗原性不同于以往发现的干扰素，后被命名为干扰素-。人干扰素-（IFN-）由143个氨基酸组成，分子量为40kd ，分子内无Cys，故无二硫键，其性质与人IFN-和人IFN-有很大差异，对酸不稳定，不耐热。分子中含有很多碱性氨基酸，等电点超过pH8.6。1981年，Goeddle等克隆了干扰素-基因，随后研制了重组人干扰素-(rhIFN-),、于1990年获得美国FDA批准用于临床，我国于1995年批准用于临床治疗。干扰素的生物学活性相当广泛，主要包括广谱抗病毒活性、直接抗肿瘤活性和免疫调节活性。 1干扰素的广谱抗病毒活性病毒是专性活细胞内寄生物，缺乏活细胞所具有的细胞器以及代谢所必需的酶系统和能量。繁殖所必需的原料、能量和生物合成的场所均由宿主细胞提供，在病毒核酸酶的控制下合成病毒的核酸和蛋白质，然后在宿主细胞的细胞质或细胞核内装配成为成熟的、具有感染性的病毒颗粒，再以各种方式释放至细胞外，感染其它细胞。病毒的复制可概括为吸附侵入脱壳生物合成装配释放。如果其中某一个阶段受阻，可导致复制过程异常或中断，其结果是合成缺损病毒（低感染或无感染性）或不能合成病毒。干扰素抗病毒的作用机制有以下几方面。 （1）抗病毒的作用过程 干扰素不能够直接杀死病毒，它的抗病毒作用是通过干扰素分子与靶细胞相互作用，使其形成抗病毒状态来完成的。这一过程包括：每个细胞表面约有干扰素受体1005000个，干扰素分子与靶细胞表面的干扰素受体特异性结合，通过受体进行信号传递；激活了靶细胞内抗病毒蛋白基因；活化的抗病毒蛋白基因被翻译，合成抗病毒蛋白；由于抗病毒蛋白能够切断病毒mRNA和抑制病毒蛋白质的翻译，使靶细胞呈现抗病毒状态。 已知的干扰素可以活化的抗病毒蛋白至少三种，它们是蛋白激酶、2-5A合成酶（2-5A synthetase,2-5AS）和磷酸二酯酶。这三种抗病毒蛋白的作用机制见图26-1。 干扰素结合靶细胞受体激活 抗病毒基因表达抗病毒蛋白 2-5A合成酶 蛋白激酶 磷酸二酯酶eIF2 2-5 tRNA的pCpCpA 末端降解 核酸酶F激活 病毒蛋白合成 病毒mRNA降解 起始受阻 病毒蛋白转录抑制 细胞呈现抗病毒作用图26-1 干扰素的抗病毒作用机制 （2）抑制病毒蛋白质的合成 干扰素抑制病毒蛋白质合成的过程包括：未活化的蛋白激酶被激活为活化的蛋白激酶；蛋白激酶将磷酸加到启动因子eIF2（真核生物起始因子2，病毒蛋白质合成“发动机”）上；磷酸化的eIF2失去活性，病毒蛋白合成无法启动，病毒的生物合成受阻，显示出干扰素导致的抗病毒作用。（3）降解病毒的mRNA 2-5A合成酶的作用机制包括以下过程：未活化的2-5A合成酶被激活为活化的2-5A合成酶；2-5A合成酶催化ATP聚合成2-5A（2-5A在细胞内的浓度可以增加1010000倍）；2-5A作为一种激活剂，将细胞内残核酸酶F(residue nuclease F)激活；残核酸酶F对病毒的mRNA有专一性，在病毒mRNA分子上切开12个切口，使其发生降解。由于病毒的mRNA被降解，不能为继续合成病毒蛋白质提供模板，于是显示出干扰素导致的抗病毒作用。干扰素还能通过磷酸二酯酶参与的作用机制，抑制病毒蛋白的翻译。干扰素抗病毒作用的特点是：干扰素不能杀死病毒，仅仅是抑制作用；干扰素对病毒没有直接的作用，通过细胞核内的基因产生蛋白质因子发挥作用，因此不同细胞对干扰素的敏感不同；病毒大量复制时引发细胞炎症应答，此时干扰素易产生作用；当病毒DNA已整合到宿主细胞的染色质中时，干扰素不能发挥其抗病毒活性。2干扰素抗肿瘤作用机制正常细胞在机体内按照程序分化、成熟的过程叫做细胞确定（cell defining）过程。细胞确定过程的最终结果是细胞程序化死亡。这就是细胞的一生分化、成熟、死亡。正常细胞受某些因素影响，离开细胞确定过程，具有了无限繁殖能力和其它一些程序外（extra-program）特性，这种长生不老的细胞就是转化了的肿瘤细胞。肿瘤细胞获得的程序外特性包括：无限繁殖能力，自身分泌生长因子及生长因子受体，并分泌黏多糖，屏蔽细胞间信号传递，接触抑制现象消失；转化能力，合成自身的调节蛋白，原有细胞性质、形态改变；侵润能力；合成特殊酶系统，破坏组织结构，扩散转移到其它组织。干扰素抗肿瘤的作用机制有以下几方面。（1）直接抑制肿瘤细胞 干扰素抑制肿瘤细胞合成生长因子、生长因子受体及其它必需蛋白质。诱导肿瘤细胞分化进入细胞确定，逆转肿瘤细胞为正常细胞。干扰素阻止肿瘤细胞扩散，保持基底膜完整。 （2）调节宿主抗肿瘤免疫反应 干扰素促进肿瘤细胞抗原的表达，在肿瘤细胞的细胞膜上，存在肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen A,TAA）、特异性肿瘤抗原（tumor special antigen, TSA）和白细胞相关性抗原，这些抗原是肿瘤细胞的标志，使人体免疫系统的杀手（NK细胞、K细胞）易于找到并杀死肿瘤细胞。干扰素还能增强宿主细胞的细胞毒（cell toxicity）作用。细胞毒作用是指效应细胞对靶细胞（病变细胞）的直接杀伤作用，而无需抗原等物质介导。（3）改变宿主与肿瘤细胞的关系 干扰素抑制旁分泌生长因子和近分泌生长因子。干扰素分解肿瘤细胞生长所需的营养因子，如色氨酸。干扰素抑制肿瘤细胞伴生血管的生成。3干扰素的免疫调节活性免疫是机体识别和排除抗原异物，起维持机体的生理平衡和稳定的功能。在正常情况下，免疫产生保护性反应，对机体有利；在异常情况下，免疫也会产生排斥性反应，对机体造成损伤。免疫系统有三部分，免疫监视系统、免疫防卫系统和免疫自稳系统。（1）干扰素对免疫监视系统的调节 免疫监视的作用是处理发生突变的自身细胞。免疫监视通过其效应细胞发挥作用，这些免疫监视效应细胞是指对于突变细胞（例如癌细胞和被病毒感染的细胞等）具有直接杀伤作用的淋巴细胞，主要包括天然杀伤细胞（nature killing cell, NK细胞）、杀伤细胞（K细胞）和杀伤性T细胞（TK细胞）。其中NK细胞是免疫监视系统中的最重要的效应细胞。干扰素能够增强监视效应细胞对病变细胞的直接杀伤作用。特别是对于NK细胞，干扰素不但可以活化前NK细胞和原NK细胞成为NK细胞，维持成熟型NK细胞的杀伤活性，又能够进一步激活成熟型NK细胞成为活化型NK细胞，而后者的杀伤活性和作用范围都大于NK细胞。（2）干扰素对免疫防卫系统的调节 免疫防卫的作用是排斥和消灭侵入的外源物质，也就是抗感染免疫。干扰素对其中的体液免疫、细胞免疫和吞噬免疫均有调节作用。干扰素促进抗体形成，抗体和病毒抗原特异结合，复合物被巨噬细胞吞噬。干扰素促进T细胞与病毒（病变细胞）结合，使T淋巴细胞处于结合敏感态。干扰素增强单核巨噬细胞的吞噬能力，促进其细胞毒作用。（3）干扰素对免疫自稳系统的调节 免疫自稳的作用是调节机体免疫系统自身，排除免疫代谢过程中产生的废物和损伤、死亡的淋巴细胞，即机体的自我调节。自我稳定。干扰素对免疫系统调节的作用效果包括：增强机体的抗病毒、抗肿瘤能力；消除残存肿瘤细胞，降低癌症的转移率和复发率；提高机体免疫力，减少细菌感染和自体免疫紊乱的可能性。免疫缺陷症患者，产生免疫相关的抗体，造成免疫系统的自我攻击。干扰素抑制T淋巴细胞抗体的产生，恢复细胞免疫功能。干扰素的临床应用广泛。干扰素在机体的免疫系统中起着非常重要的作用，在同种细胞上具有广谱抗病毒、抗细胞分裂和免疫调节等多种生理活性。干扰素有极高的生物学活性，1mg纯品中含有数亿个活性单位，据估计，少于十个或者只要有一个干扰素分子就可使细胞产生抗病毒状态。干扰素具有广谱性和选择性，它几乎对所有病毒和肿瘤细胞有抑制作用，而且仅作用于病变细胞，对正常细胞影响极小，具有相对无害性。其在临床上可用于：（1）抗病毒 干扰素-/能诱导机体对多种肝炎病毒、鼻病毒、人乳头瘤病毒、艾滋病病毒和多种RNA病毒产生抵抗力。干扰素-能够增加免疫系统识别和杀伤感染细胞的能力，并能通过其它未知途径抵抗病毒繁殖。干扰素已被探索或正式应用于慢性乙型肝炎、丙型肝炎、慢性丁型肝炎、复发性疱疹、带状疱疹、病毒性角膜炎、红眼病、慢性宫颈炎、慢性盆腔炎、宫颈湿疣、肛门-生殖器扁平湿疣、寻常疣、巨细胞病毒、外阴前庭炎等疾病的抗病毒治疗。 （2）治疗肿瘤 干扰素是一种较理想的肿瘤抑制蛋白，它能调节正常的和恶性化的细胞生长和分化。其对抗癌细胞增殖的作用主要有两方面，一方面直接对抗癌细胞增殖，另一方面通过调节免疫应答间接抗肿瘤。干扰素已应用于多种肿瘤治疗，并取得了一定的疗效，如白血病、艾滋病相关性Kaposi肉瘤、慢性髓样白血病、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、表面膀胱瘤、肉瘤、卵巢瘤、肾细胞瘤、恶性黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺瘤、晚期直肠瘤、大肠瘤、食道瘤、非小细胞型肺癌、小细胞型肺癌等。（3）其它应用 有报道用干扰素治疗精子缺乏症、多发性硬化症、黄斑变性症等。干扰素最常见的副作用为流感样症状，如疲劳、厌食、恶心呕吐、发烧、寒战、头疼、肌痛、腹泻等。大多数反应为轻微至中等，停止治疗后可得到缓解，大部分患者都可耐受。长期、高剂量使用时可出现骨髓抑制、消化道反应、神经系统和心血管系统症状等，同时出现干扰素抗体。干扰素的开发生产研究可以说是几经波折。20世纪60年代主要是内源性干扰素，寻找高效诱生剂。20世纪70年代主要为体外诱生干扰素，成功诱生人白细胞、人成纤维细胞和类淋巴细胞等生成干扰素。当时临床研究使用的干扰素都是由仙台病毒（Sendai）诱导人白细胞产生的，称为人白干扰素。人白干扰素的生产需要大量的新鲜人血（提取1g干扰素-约需要3105L人血白细胞），来源非常困难，纯化工艺复杂，收率低，价格昂贵，因而干扰素的产量有限，并且血源性干扰素容易被全血中的病毒污染，从而威胁使用者的健康，这些都严重地影响了干扰素在临床上的使用价值。如何保证人体安全等技术措施难以解决，使人们一度对干扰素的应用持怀疑态度。1975年Bechenhan Wellcome研究所设计了大规模干扰素的制备路线，并实现商业化生产。利用转化细胞株代替人白细胞，经病毒刺激后产生多种亚型混合的干扰素-。这种混合干扰素于20世纪80年代初批准用于临床，由于其生物活性较低，于20世纪90年代末退出临床应用。随着生物技术的发展，通过基因工程技术，可在人体外大规模生产干扰素，即基因工程重组人干扰素。利用基因操作从人白细胞中克隆出干扰素-基因，构建重组表达载体，转化到宿主细胞中，从而获得高效表达人干扰素-蛋白的工程菌。培养基因工程菌，干扰素基因在其细胞内转录、翻译，工程菌经发酵后可收集到大量菌体，将菌体破碎，进而分离、纯化，即得到高纯度的干扰素-。1979年Taniguchi克隆了人干扰素基因，1980年Nagata等制备了人干扰素-2。大多数重组干扰素-是以大肠杆菌为宿主，表达产物为非活性包含体形式，使干扰素在来源上脱离了人血，并且纯度和活性比人白干扰素有所提高，成本明显降低，这就是第一代基因工程干扰素。但在生物合成、纯化及制剂阶段均使用了一些动物或人血液提取成分，仍然没有摆脱潜在的传播血源性疾病的危险。1986年Debaov等采用腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putida VG-84）为宿主，直接表达出具有天然分子结构和生物活性的可溶性干扰素-2b，纯化过程中淘汰了抗体亲和色谱，制剂中采用非人血清白蛋白新型保护剂，使得整个制造过程中不使用任何血液提取成分，解决了第一代基因工程干扰素遗留的缺陷，干扰素生物活性和纯度更高，这就是第二代基因工程干扰素。 1986年美国FDA批准Roche公司基因工程干扰素-2a和Schering公司的干扰素-2b进入市场，治疗白血病。随后又批准治疗Kaposi肉瘤和生殖器疣，扩大了干扰素的应用范围。中国预防医学科学院病毒所、卫生部长春生物制品研究所、中国药品生物制品检定所合作研发了第一个基因工程产品，基因工程干扰素-1b滴眼液，于1990年进入市场。其后又共同研发了基因工程干扰素-1b注射液和基因工程干扰素-2b注射液，于1992年进入市场。基因工程干扰素-注射液和天津华立达生物工程公司的基因工程干扰素-2b注射液也分别于1995年和1996年进入市场，国外生产的基因工程干扰素主要品种我国都有生产。1993年我国干扰素销售额1.9亿元RMB，其国内产品5%，其余为进口产品。目前国内已有30多家公司从事基因工程干扰素的生产和销售，2000年国内干扰素销售额达10亿元RMB，2005年已经超过15亿元RMB。目前干扰素全球年销售额在20亿美元左右。26.5.1.2 重组人干扰素生产技术和工艺重组人干扰素的生产主要包括工程菌的构建、发酵、发酵产物的分离纯化及制剂加工等单元操作技术和工艺。下面以重组人干扰素-2b为例详细介绍重组人干扰素的生产技术工艺，顺便介绍下重组人干扰素干扰素-和的生产工艺。（一）重组人干扰素-2b的生产工艺技术1. 基因工程假单胞杆菌的构建（1）干扰素基因的克隆 从感染新城疫病毒（new castle disease virus）人血白细胞中分离干扰素-基因的mRNA，由逆转录酶将Poly (A)RNA反转录形成cDNA第一链。再由DNA聚合酶的Klenow片段催化聚合形成cDNA第二条链。在dCTP存在条件下，利用末端转移酶给cDNA加Poly(dC)尾，连接到质粒pBC332上。转化到大肠杆菌感受态细胞中，并用氨苄青霉素和四环素筛选抗性克隆，获得编码人干扰素-2b的基因序列。（2）干扰素表达载体的构建 把干扰素基因与宿主载体pAYC37连接，筛选出序列正确的表达载体pVG3。将表达载体导入假单胞杆菌(Pseudomonas putida VG-84)中，筛选的得到干扰素工程菌，表达重组人干扰素-2b不低于2.0109IU/L，并具有氨苄青霉素、四环素和链霉素的抗性。（3）基因工程菌应具备的特性重组人干扰素-2b工程菌由人干扰素-2b基因的重组质粒pVG3转化腐生型假单胞菌(Pseudomonas putida VG-4)，该菌种由VNIIGENETIKA研究所构建，生产用重组菌株经国家药品监督管理局批准。基因工程菌株Pseudomonas putida VG-84 pVG3应该具有假单胞杆菌宿主细胞的特性和生产干扰素能力。1）宿主细胞假单胞杆菌特性细胞形态 革兰阴性，可运动，有荚膜，无芽孢，杆状，长度35m。菌落特征 在LB琼脂培养基上，30培养24h，其菌落为2.53.0mm，灰绿色半透明状。菌落之间结构相同，具有粘稠性。2）生化特征 不能将明胶、淀粉、聚-羟丁酸液化为可溶性单糖，不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。菌株为苏氨酸营养缺陷型，可以利用L-缬氨酸作为碳源。3）遗传特性 DNA 中G+C含量为63%。细胞中携带pVG3质粒，具有硫酸链霉素、盐酸四环素和氨苄青霉素的抗性。4）生产能力 具有生产干扰素-2b的能力，其放射性免疫学效价不能低于2.0109IU/L。（4）菌种库的建立及保存从原始菌种库出发，传代、扩增后，冻干保存，作为主菌种库，主菌种库不得进行选育工作。从主菌种库传代、扩增后，甘油管保存，作为工作菌种库。工作种子库也可由上一代工作种子库传出，但每次只限传三代。每批主菌种库均进行划线LB琼脂平板、涂片革兰染色、对抗生素的抗性、电镜检查、生化反应、干扰素的表达量、表达的干扰素型别、质粒检查的检定，合格后方可投产。原始菌种库、主菌种库和工作菌种库于-70以下温度保存。（5）工作菌种库的建立及保存1）培养基的制备 生产过程中使用的培养基均按一定工艺要求配制。2）接种、转移及培养 取12支工作菌种库或主菌种库菌种接入摇瓶，摇床培养。吸光值（OD值）达5.51.0，将摇瓶种子液转移至种子罐中，通入无菌空气，培养至吸光值符合放灌要求（OD值为8.02.0）。种子罐培养结束后，无菌操作转移到离心管中，离心15min，加新鲜菌种培养基，将菌体制成菌悬液，并加入甘油使其浓度达到18%，分装于Ependorf管中，每支（1.00.2）mL。3）保存 分装完毕，于-20放置1620h，在-70下可保存3年。2重组人干扰素-2b的发酵工艺及过程控制1）重组人干扰素-2b的发酵工艺过程（1）菌种制备 取-70下保存的甘油管菌种（工作种子批），于温室下融化。然后，接入摇瓶，制备温度30，pH7.0，250r/min活化培养(182)h后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。（2）种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养34h时，当OD值达4.0以上时，转入发酵罐中，进行二级放大培养，同时取样发酵液进行显微检查和LB培养基划线检查，控制杂菌。（3）发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4h。然后控制培养温度20pH6.0，溶解氧60%，继续培养56.5h。同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.01.0后年，用5冷却水快速降温至15以下，以减缓细胞衰老。或者迅速降至10以下。（4）菌体收集 将已降温至20以下的发酵液转入连续流离心机，16000r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于-20冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。整个发酵工艺过程如图26-2所示。生产菌种 接种 蒸汽灭菌菌种活化原料蒸汽灭菌配制培养基种子罐培养 蒸汽灭菌发酵罐培养菌体冷冻保存离心菌体搜集发酵液降温图26-2 重组人干扰素-2b的发酵工艺流程2）重组人干扰素-2b的发酵过程控制(1)发酵中菌体生长与干扰素合成的关系 在假单胞菌的发酵生产中，菌体在培养1.5h分裂速度最快，到3.5h开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5h之后，在4h达到最大，然后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单胞杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态。(2)培养基组成 一般的，种子培养基的营养成分宜丰富些，尤其是氮源的含量应较高（即C/N低）。相反，对于发酵培养基，氮源含量应比种子培养基稍低（即C/N高）。假单胞杆菌在以水解酪蛋白、酵母粉等组成的营养丰富的合成培养基中发酵时，由于培养基提供生长所必需的碳、氮和磷源，因此生长比在基本培养基要快。基因工程假单胞杆菌在合成培养基上显示较高的质粒稳定性，这主要是因为在基本培养基上，基因工程菌和宿主菌的比生长速率存在差异。假单胞杆菌发酵需有合适的生长pH范围。因此，要考虑到培养基的pH调节能力，可用K2HPO4/KH2PO4缓冲液。(3)溶解氧 基因工程菌发酵要求培养液中有足够的溶解氧，为了提高发酵罐的供养能力，往往需要增大搅拌转速，增加空气流量，或通入纯氧。氧气不足时，一般表现为乙酸、乙醇等发酵副产物的积累，同时造成菌体生长、生产速率下降。Rimkeviciene等发现15%的溶解氧就可满足基因工程假单胞杆菌的生长需求，但70%以上的溶解氧水平才能保证菌体中干扰素-2b的大量合成，其产量是15%溶解氧的6倍，而菌体生长速率未发生明显变化，质粒稳定性也有很大的提高。因此可采用两段培养的策略，分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度，以期提高干扰素的发酵水平。(4)温度 假单胞杆菌你的生长最适温度与产物形成的最适温度是不同的。稳定而适中的温度既能保证菌体细胞膜的完整和细胞中酶的催化活性，又有利于提高干扰素的产量。基因工程假单胞杆菌发酵温度控制在20可以有效防止干扰素-2b的降解，而其最佳生长温度则是30。质粒的稳定性随温度的升高而迅速降低，因此在培养后期降温可以减少目标产物的降解。(5)pH值 发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件所决定。有研究表明，干扰素-的等电点在pH6.0附近，在低酸性条件下稳定，能耐受pH2.5的酸性环境，因此可在发酵后期降低pH，从而造成大量蛋白酶失活，减少干扰素-的水解，提高干扰素的积累量。(6)发酵过程中泡沫形成与控制 发酵培养液内含有各种易产生泡沫的蛋白质，它们与通气搅拌所产生的小气泡混合，使发酵产生一定数量的泡沫。随着菌体繁殖，使整个发酵过程形成过多和稳定持久的泡沫。可采用机械搅拌和加入少量表面活性剂来消除泡沫。3. 重组人干扰素-2b的分离纯化工艺及过程控制干扰素的分离与纯化