第二章-微生物菌种选育.ppt

第二章微生物菌种选育 黄小龙农学院生物技术系 本章主要内容 第一节菌种的来源第二节菌种选育第三节微生物菌种的扩大培养第四节菌种的保藏与复壮 第一节菌种的来源 一 工业发酵常见微生物种类1 细菌发酵工业常用的细菌大多是杆菌 枯草杆菌 醋酸杆菌 棒状杆菌 乳酸杆菌 梭状芽孢杆菌 大肠杆菌等 4 一 工业发酵常见微生物种类2 酵母菌发酵工业常用的酵母 酿酒酵母 异常汉逊氏酵母异常变种 假丝酵母属 毕赤氏酵母属等 5 一 工业发酵常见微生物种类3 霉菌发酵工业常用的霉菌 曲霉属 青霉属 根霉属 毛霉属等 4 其他放线菌 担子菌 藻类等 6 二 工业微生物来源根据资料直接向有科研单位 高等院校 工厂或菌种保藏部门索取或购买 从大自然中分离筛选新的微生物菌种 从一些发酵制品中分离目的菌株 三 微生物菌种的选择性分离 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求 菌种的特性 采用各种筛选方法 快速 准确地把所需要的菌种挑选出来 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌 也必须重新进行分离纯化 有了优良的菌种 还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合 1 分离思路 定方案 首先要查阅资料 了解所需菌种的生长培养特性 采样 有针对性地采集样品 增殖 人为地通过控制养分或培条件 使所需菌种增殖培养后 在数量上占优势 分离筛选 采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目的菌 发酵性能测定 进行生产性能测定 这些特性包括形态 培养特征 营养要求 生理生化特性 发酵周期 产品品种和产量 耐受最高温度 生长和发酵最适温度 最适pH值 提取工艺等 2 新种分离与筛选的步骤 一 采样 1 采样对象以采集土壤为主 一般园田土和耕作过的沼泽土中 以细菌和放线菌为主 富含碳水化合物的土壤和沼泽地中 酵母和霉菌较多 如一些野果生长区和果园内 采样的对象也可以是植物 腐败物品 某些水域等 从自然界筛选 2 采样季节 以温度适中 雨量不多的秋初为好 3 采土方式 在选好适当地点后 用小铲子除去表层5cm浮土 取离地面5 25cm处的土约10 25g 盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中 扎好 标记 记录采样时间 地点 环境条件等 以备查考 为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化 宜将样品逐步分批寄回 以便及时分离 采取土壤样品要考虑的几个问题 土质肥 微生物含量高 特别肥沃的土壤中细菌多 放线菌少 在植物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗性真菌 离地面5 25cm处的土壤通气良好 不受阳光直射 含菌量最高 采土季节以春秋两季最好 采土方法 选择适当地点 铲除表土 取土样数十克 盛入事先准备的无菌防水纸袋中 其上记录采土时间 地点 植被情况等 多点采土 混合分离 可以代表每一地块上的微生物分布平均情况 二 增殖培养 含有目的菌较多的土样不需要富集培养 如果原有样品中目的菌含量低 可以人为地添加相应的基质 培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖 从而提高它们在样品中的比例 便于分离 富集培养的一般方法 采用有利于目的菌种而不利于无关微生物的营养和培养条件 以达到使目的菌种在群体中比例上升的目的 例如碳源利用的控制 可选定糖 淀粉 纤维素 或者石油等 以其中的一种为唯一碳源 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长 而其它微生物就可能死亡或淘汰 某些细菌的富集条件 富集对象接种菌样添加营养物 g 特殊培养条件好氧氨基酸氧化菌土壤 好氧 pH7 0好氧性芽孢杆菌土壤 巴氏消毒 好氧 pH7 0氨基酸发酵性梭菌土壤 巴氏消毒 厌氧 pH7 0耐碱解尿素芽孢菌土壤 巴氏消毒尿素50好氧 pH8 6厌氧八叠球菌土壤葡萄糖20厌氧 pH2 3乳酸菌植物体或牛奶葡萄糖20厌氧 pH6 5肠道细菌土壤或污水葡萄糖20 CaCO320好氧或厌氧 pH7 0丙酸菌干酪乳酸钠20厌氧 pH7 0醋酸菌果实或生啤酒乙醇40好氧 pH6 0注 培养基成分为酵母膏10g KH2PO4或K2HPO41 0g MgSO4 7H2O0 2g 加水1000ml 一般培养在30 下 放线菌的分离 15 放线菌的特性 生长缓慢 难培养 分离要点 1 选择适合放线菌生长的培养基 如 HV培养基 腐殖酸培养基 2 添加抑制其他细菌和真菌生长的抑制剂 如 重铬酸钾 放线菌酮 制霉菌素等 三 培养分离 纯种分离的方法 划线分离法 稀释分离法 稀释分离法 稀释倒平板法 平板涂布法 注意 必须要做多个浓度的稀释分离平板 划线分离法 平板划线法 四 筛选 1 初筛 从分离得到的大量微生物中 将目标微生物筛选出来的过程 常用的初选方法 水解酶产生菌的筛选 将酶的作用底物加在培养基中 接种后适温培养 根据菌苔周围是否产生水解圈筛选出水解酶产生 一般采用平板筛选 拮抗菌的筛选 对峙培养 将病原指示菌与待测菌株相对接种在平板上适温培养 根据病原菌的生长情况筛选出拮抗性菌株 2 摇瓶发酵筛选 将待测菌株进行液体振荡培养 取发酵滤液进行活力测定 2 复筛 在初筛的基础上 进一步鉴定有希望菌株的生产能力强弱的过程 复筛采用摇瓶培养后 发酵液采用精确的分析方法进行测定 复筛过程中 要结合培养条件进行 培养条件包括 培养基pH值发酵温度供氧量等 五 菌种鉴定 经典分类鉴定方法 形态特征 生理生化特征 血清学试验等 现代多相分类鉴定方法 遗传特性 细胞化学组分 计算机数值分析 五 毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的 将其作为生产菌种应当十分当心 尤其与食品工业有关的菌种 更应慎重 据有的国家规定 微生物中除啤酒酵母 脆壁酵母 黑曲霉 米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外 其他微生物作为食用 均需通过两年以上的毒性试验 第二节发酵高产菌种选育 菌种选育是一门应用科学技术 其理论基础是微生物遗传学 生物化学等 而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌种 从而促进生产发展 目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方法 带有一定的盲目性 尚属于经典育种的范畴 随着微生物学 生化遗传学的发展 出现了转化 转导 原生质体融合 代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法 2 1自然选育在生产过程中 不经过人工处理 利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育 所谓自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变 菌种的自然突变往往有两种可能性 1 菌种衰退 生产性能下降 2 代谢更加旺盛 生产性能提高 2 2诱变育种2 2 l诱变育种的基本原理诱变育种的理论基础是基因突变 所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异 突变主要包括染色体畸变和基因突变二大类 1 染色体畸变是指染色体或DNA片断的缺失 易位 逆位 重复等 2 基因突变是指DNA分子结构中的某一部位发生变化 又称点突变 根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变 诱发突变是指用各种物理 化学因素人工诱发的基因突变 诱变因素的种类很多 有物理的 化学的和生物的三大类 见P55 表2 1 经诱变处理后 微生物的遗传物质 DNA和RNA的化学结构发生改变 从而引起微生物的遗传变异 2 2 2诱变育种的一般步骤 1 出发菌株的选择自然界直接分离到的野生型菌株 经历过生产条件考验的菌株 已经历多次育种处理的菌株 2 制备菌悬液待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态 悬液的均一性和环境条件 尽可能选择孢子或单倍体细胞作为诱变对象 避免表型延迟 表型延迟就是指某一突变在DNA复制和细胞分裂后 才在细胞表型上显示出来 造成不纯的菌落 3 诱变处理根据诱变剂用量对菌体致死率的曲线选择合适的处理剂量 一般突变率随诱变剂量的增大而增高 但达到一定剂量后 突变率会下降 4 突变菌株的筛选 1 营养缺陷型突变株的筛选生物合成途径的某一步发生了酶缺陷 合成反应不能完成 末端产物不能积累 因此末端产物的反馈调节作用被解除 32 2 抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选调节基因或操纵基因发生突变 使产生的阻遏蛋白不能再和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因 因此不再起反馈阻遏作用 编码酶的结构基因发生突变 使变构酶不再具有结合终产物的能力但仍具有催化活性 从而解除了反馈抑制 抗反馈突变株一般通过抗结构类似物突变的方法筛选 营养缺陷型的回复突变株中也可获得抗反馈突变株 3 组成型突变株的筛选分批限量加入诱导物法 解除菌株对诱导物的依赖交替培养法 4 抗性突变株的筛选抗生素抗性突变抗噬菌体菌株的选育条件抗性突变敏感突变 2 2 3几种常见的物理 化学诱变剂的使用方法 1 物理诱变剂 紫外线 X 射线 射线 快中子 特点 导致DNA断裂缺失 造成不可回复的缺失突变 诱变效率高 但它可能影响邻近基因的性能 紫外线是常用的诱变剂 2 化学诱变剂 碱基类似物 5 BU 脱氨剂 羟胺 亚硝酸 嵌入剂 吖啶类 等 特点 碱基类似物 取代相应碱基进入DNA链 具有很高的特异性 但回复突变率高 很少使用 脱氨剂 碱基脱氨或脱氮 引起碱基对转换 造成的遗传损伤较多 应用的范围较广 嵌入剂 引起移码突变 可以造成生化代谢途径完全中断 2 3杂交育种发酵工业的优良菌种的选育主要采用诱变育种方法 但是 一个菌种长期使用诱变剂处理之后 其生活能力一般要逐渐下降 例如生长周期延长 孢子量减少 代谢减慢 产量增加缓慢 诱变因素对产量基因影响的有效性降低等 因此 有必要利用杂交育种方法 杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合 或接合 使遗传物质重新组合 从中分离和筛选具有新性状的菌株 1 杂交育种的目的 1 通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合 从而改变原有菌株的遗传物质基础 获得杂种菌株 重组体 2 可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中 克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷 3 通过杂交 可以扩大变异范围 改变产品的质量和产量 甚至出现新的品种 4 分析杂交结果 可以总结遗传物质的转移和传递规律 促进遗传学理论的发展 微生物杂交育种所使用的配对菌株称为直接亲本 由于多数微生物尚未发现其有性世代 因此 直接亲本菌株应带有适当的遗传标记 常用的遗传标记有颜色 营养要求和抗药性等 营养标记菌株 即营养缺陷型菌株 是最常用的遗传标记之一 所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体 由于基因突变 它失去了合成某种物质 氨基酸 维生素或核苷酸碱基 的能力 在基本培养基上不能生长 大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长 2 遗传标记 2 4原生质体融合技术所谓原生质体融合就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解 使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体 称原生质体 两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合 由聚乙二醇 PEG 作为助融剂 使它们互相凝集 发生细胞融合 接着两亲本基因组由接触到交换 从而实现遗传重组 在再生成细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子 2 4 1原生质体融合的优越性原生质体融合技术有以下优点 l 去除了细胞壁的障碍 亲株基因组直接融合 交换 实现重组 不需要有已知的遗传系统 即使是相同接合型的真菌细胞也能发生原生质体的相互融合 并可对原生质体进行转化和转染 2 原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换 产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子 参与融合的亲株数并不限于一个 可以多至三个 四个 这足一般常规杂交所达不到的 3 重组频率特别高 因为有聚乙二醇作助融剂 4 可以和其他育种方法相结合 把由其它方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中 5 可以用温度 药物 紫外线等处理 钝化亲株的一方或双方 然后使之融合 再在再生菌落中筛选重组子 这样往往可以提高筛选效率 由于以上优点 利用原生质体融合来培育工业新菌株已受到国内外普遍重视 2 4 2原生质体融合技术一般步骤 1 选择亲株选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株 亲株带上遗传标记 测定遗传标记的稳定性 2 原生质体制备一般采用酶解法除壁 根据微生物细胞壁组成和结构的不同 采用不同的酶 有时还要采取一些措施 如添加甘氨酸 蔗糖或抗生素等 以提高细胞壁对酶解的敏感性 原生质体对渗透压极其敏感 低渗易引起细胞破裂 一般将原生质体放在高渗的环境中维持它的稳定 3 原生质体融合两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合 由聚乙二醇 PEG 作为助融剂 使它们互相凝集 发生细胞融合 接着两亲本基因组由接触到交换 从而实现遗传重组 在再生细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子 4 原生质体再生原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁 恢复完整的细胞形态结构 菌龄 再生时的温度 溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生 5 筛选优良性状融合重组子原生质体融合后 来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代称为融合重组子 融合重组子的检出方法 直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子高渗再生培养基平板上 直接筛选出原养型重组子 间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上 使亲株和重组子都再生成菌落 然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子 筛选出来的融合重组子还需要对它们进行生理生化及生产性能的测定 44 2 5基因工程育种 一 传统基因工程技术 通过基因工程菌生产的药物 疫苗 酶制剂 抗生素等 二 基因的定点突变 突变基因突变库的建立筛选基因突变库的筛选基因复制与遗传 步骤 在分子水平上 对目标基因直接处理 然后通过高通量的筛选方法 提高目标蛋白的性能 定点突变 第三节微生物菌种的扩大培养 种子扩大培养 是指将保存在砂土管 冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后 在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程 这些纯种培养物称为种子 作为种子的准则 1 菌种细胞的生长活力强 移种至发酵罐后能迅速生长 迟缓期短 2 生理性状稳定 3 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求 4 无杂菌污染 5 保持稳定的生产能力 种子扩培的目的接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间 保证生产水平 3 1种子的制备过程 种子制备的过程大致可分为 实验室种子制备阶段生产车间种子制备阶段 一 实验室种子的制备 一般采用两种方式 1 对于产孢子能力强的及孢子发芽 生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基或斜面 静置培养 培养孢子 孢子可直接作为种子罐的种子 这样操作简便 不易污染杂菌 2 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种 可以用液体培养法 通过摇瓶培养提供比较好的溶氧 一 孢子的制备 1 细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方 培养温度一般为37 C 细菌菌体培养时间一般为1 2天 产芽孢的细菌培养则需要5 10天 2 霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米 小米 玉米 麸皮 麦粒等天然农产品为培养基 培养的温度一般为25 28 C 培养时间一般为4 14天 比如 青霉菌孢子培养 大米培养基 培养基特点 成本低 米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质 营养适当 要求大米的白点小 有利于孢子的生长 3 放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基 培养基中含有一些适合产孢子的营养成分 如麸皮 豌豆浸汁 蛋白胨和一些无机盐等 培养温度一般为28 C 培养时间为5 14天 二 液体种子制备 1 好氧培养 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种 如产链霉素的灰色链霉菌 S griseus 产卡那霉素的卡那链霉菌 S Kanamuceticus 可以用摇瓶液体培养法 将孢子接入含液体培养基的摇瓶中 于摇瓶机上恒温振荡培养 获得菌丝体 短菌丝 作为种子 试管 三角瓶 摇床 种子罐 2 厌氧培养 对于酵母菌 啤酒 葡萄酒 清酒等 试管 三角瓶 卡式罐 种子罐 二 生产车间种子制备 实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养 种子罐的培养基虽因不同菌种而异 但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖 玉米浆 磷酸盐等 如果是需氧菌 同时还需供给足够的无菌空气 并不断搅拌 使菌 丝 体在培养液中均匀分布 获得相同的培养条件 1 种子罐的作用主要是使孢子发芽 生长繁殖成菌 丝 体 接入发酵罐能迅速生长 达到一定的菌体量 以利于产物的合成 2 种子罐级数的确定种子罐级数 是指制备种子需逐级扩大培养的次数 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数 但有时 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数 种子罐级数取决于 菌种生长特性 如菌种传代后的稳定性 孢子发芽及菌体繁殖速度 采用发酵罐的容积 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子液体积 培养液体积 以及种子罐与发酵罐的容积比等有关 细菌 生长快 种子用量比例少 级数也较少 二级发酵 茄子瓶 种子罐 发酵罐霉菌 生长较慢 如青霉菌 三级发酵孢子悬浮液 一级种子罐 27 C 40小时孢子发芽 产生菌丝 二级种子罐 27 C 10 24小时 菌体迅速繁殖 粗壮菌丝体 发酵罐放线菌 生长更慢 采用四级发酵酵母 比细菌慢 比霉菌 放线菌快 通常用一级种子 二级发酵 确定种子罐级数需注意的问题 1 种子级数越少越好 可简化工艺和控制 减少染菌机会 2 种子级数太少 接种量小 发酵时间延长 降低发酵罐的生产率 增加染菌机会 3 与所选用工艺条件有关 如改变种子罐的培养条件 加速了孢子发芽及菌体的繁殖 也可相应地减少种子罐的级数 3 2种子质量的控制 一 影响孢子质量的因素及控制培养基培养条件培养时间和冷藏时间 1 培养基 生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象 其主要原因是原材料质量波动 例如在四环素 土霉素生产中 配制产孢子斜面培养基用的麸皮 因小麦产地 品种 加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同 蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同 原材料质量的波动 起它要作用的是其中无机离子含量不同 如微量元素Mg2 Cu2 Ba2 能刺激孢子的形成 磷含量太多或太少也会影响孢子的质量 水质的影响 地区不同 季节变化和水源污染 均可造成水质波动 影响种子质量 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落 氮源品种越多 出现的菌落类型也越多 不利于生产的稳定 措施 培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用 严格控制灭菌后培养基的质量 斜面培养基使用前 需在适当温度下放置一定时间 供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源 作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源 2 培养条件 1 温度温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响 如土霉素生产菌种在高于37 C培养时 孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢 氨基氮回升提前 菌丝过早自溶 效价降低等现象 一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度 2 湿度制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响 3 培养时间和冷藏时间 1 培养时间一般来说 衰老的孢子不如年轻的孢子 过于衰老的孢子会导致生产能力的下降 措施 孢子培养的时间应该控制在孢子量多 孢子成熟 发酵产量正常的阶段终止培养 2 冷藏时间斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关 如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4 C冰箱保存 发现冷藏7 8天菌体细胞开始自溶 而培养5天以后冷藏 20天未发现自溶 冷藏时间对孢子的生产能力也有影响 例如在链霉素生产中 斜面孢子在6 C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18 冷藏3个月后降低35 4 接种量 接种量 指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例 接种量大小影响到培养基中孢子的数量 进而影响菌体的生理状况 二 影响种子质量的因素及控制 孢子的质量培养基培养条件种龄接种量 1 培养基营养成分适合种子培养的需要选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基 营养上要易于被菌体直接吸收和利用 营养成分要适当丰富和完全 氮源和维生素含量要高 营养成分要尽可能与发酵培养基相近 例 柠檬酸发酵 以蔗糖为原料 成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁蔗糖2 5 5 20 NH4NO30 225 0 11 K2HPO40 03 MgSO4 H2O0 025 0 025 KCl0 015 琼脂2 薯干粉 成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁薯干粉10 22 28 NH4 2SO40 5 琼脂2 2 培养条件 1 温度 2 通气量 3 pH 3 种龄种龄 是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间 通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期 菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适 不同菌种或同一菌种工艺条件不同 种龄是不一样的 一般需经过多种实验来确定 Ru嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶 12小时最好 4 接种量通常接种量 细菌1 5 酵母菌5 10 霉菌7 15 有时20 25 三 种子质量的控制措施 1 菌种稳定性的检查 2 无杂菌检查 四 种子质量标准 1 细胞或菌丝形态单细胞 菌体健壮 菌形一致 均匀整齐 有的还要求有一定的排列或形态 霉菌 放线菌 菌丝粗壮 对某些染料着色力强 生长旺盛 菌丝分枝情况和内含物情况好 2 生化指标种子液的糖 氮 磷的含量和pH变化 3 产物生成量在抗生素发酵中 产物生成量是考察种子质量的重要指标 因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度 4 酶活力种子液中某种酶的活力 与目的产物的产量有一定的关联 第四节菌种的保藏与复壮 一 菌种保藏的意义菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分 其任务首先是使菌种不致死亡 同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化 二 菌种保藏的原理 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低 以减少其变异 一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态 干燥和低温 使菌种处于 体眠 状态 抑制其繁殖能力 一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变 同时还需考虑到方法本身的简便和经济 以便生产上能推广使用 菌种保藏的方法很多 一般有下面几种 A斜面冰箱保藏法 酵母 斜面保藏是一种短期 过渡的保藏方法 用新鲜斜面接种后 置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后 放在4 冰箱保存 一般保存期为三个月到六个月 B石蜡油封存法 酵母 向培养成熟的菌种斜面上 倒入一层灭过菌的石蜡油 用量要高出斜面一厘米 然后保存在冰箱中 此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌 霉菌 酵母等微生物的保存 保存期约一年左右 三 菌种保藏的方法 C沙土管保藏法 细菌 霉菌 放线菌 适合于产孢子或芽孢的微生物 制备方法 首先 将沙与土洗净烘干过筛后 按沙与土的比例为l 2 l混合均匀 分装于小试管中 装料高度约为1厘米左右 121 C间歇灭菌三次 灭菌试验合格后烘干备用 一般沙用80目过筛 土用30 100目过筛 其次 将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合 于干燥器中用真空泵抽干 放在冰箱内保存 一般保存期为1年左右 D真空冷冻干燥保藏法 细菌 放线菌 真空冷冻干燥保藏法是目前常用的较理想的一种方法 其基本原理是在较低的温度下 15 快速地将细胞冻结 并且保持细胞完整 然后在真空中使水分升华 在这样的环境中 微