DB21∕T 2007-2012 副猪嗜血杆菌病防治技术规范.doc

ICS65.020.30B 41DB21辽宁省地方标准DB 21/ T20072012副猪嗜血杆菌病防治技术规范Specifications of Prevention and Control for Haemophilus Parasuis点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（本稿完成日期：2012年7月3 日）2012 07 27发布2012 08 27实施辽宁省质量技术监督局发布DB/ XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则并起草。本标准由辽宁医学院畜牧兽医学院提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准负责起草单位：辽宁医学院畜牧兽医学院。本标准起草人：周铁忠、高慎阳、王宏军、李冰、刘英姿、郑洪玲（辽宁省动物疫病预防控制中心）、刘丽颖（营口市动物疫病预防控制中心）6猪嗜血杆菌病防治技术规范1 范围本标准规定了副猪嗜血杆菌病的预防、诊断和治疗的技术方法与措施。本标准适用于辽宁省境内副猪嗜血杆菌病的诊断与防治。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是标注日期的引用文件，仅所标注日期的版本适用于本文件。凡是不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国动物防疫法中华人民共和国兽药典 GB/T17823-2009 集约化猪场防疫基本要求GB 16548-2006 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程NY 5030-2006 无公害食品 畜禽饲养兽药使用准则NY 5031-2001 无公害食品 生猪饲养兽医防疫准则NY 5032-2006 无公害食品 畜禽饲料和饲料添加剂使用准则NY 5033-2001 无公害食品 生猪饲养管理准则DB31/T432-2009 畜禽养殖场消毒技术规范中华人民共和国农业部公告第1125号 一、二、三类动物疫病病种名录3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准规范。3.1 副猪嗜血杆菌 Haemophilus parasuis副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, HPS)所引起的副猪嗜血杆菌病是一种泛嗜性细菌性传染病，该病以多发性纤维素性浆膜炎，如胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和伴发肺炎、脑膜炎为其特征。又称为格拉塞尔氏病（Glasser,s disease）。3.2 动物疫病 Animal epidemic disease动物的传染病和寄生虫病。3.3 病原体 Pathogen能引起疾病的生物体，包括寄生虫和致病微生物。3.4 动物防疫 Animal epidemic prevention动物疫病的预防、控制、扑灭和动物、动物产品的检疫。3.5 疫苗 Vaccine用病原微生物、寄生虫或其组分或代谢产物经加工制成或者用合成肽或基因工程方法制成，用于人工主动免疫的生物制品。3.6 传染源 Source of infection是指有某种传染病的病原体在其中寄居、生长、繁殖，并能排出体外的动物机体和人。3.7 传播途径 Route of transmission 是指病原体由传染源排出后，经一定的方式再侵入其它易感动物所经过的途径。4 诊断依据本病流行病学特点、临床症状、病理变化可作出初步诊断，确诊需做病原学检测。4.1 流行病学诊断 Epidemiological diagnosis 本病由副猪嗜血杆菌引起，只猪发生；病猪、隐性感染猪和临床康复猪是本病的主要传染源； 本病的传播途径主要是通过空气、猪与猪之间的接触或污染排泄物进行传播，呼吸道、消化道和创伤等途径均可感染； 本病可发生于不同性别、年龄和品种的猪，2周龄到4月龄的猪多发； 一年四季均可发病，但以早春和深秋季节多发。气温剧烈变化、畜舍环境质量差、营养不足、长途运输等应激因素和感染其他疫病引起猪只抵抗力下降时易发病。4.2 临床症状诊断 Clinical diagnosis4.2.1 急性型病例 体温升高达4042，精神沉郁，食欲减退；皮肤发红，耳梢、鼻端和四肢末梢发紫，眼睑皮下水肿； 气喘咳嗽，呼吸困难，鼻孔有浆液性及粘液性分泌物； 关节肿胀，跛行，步态僵硬，共济失调；身体颤抖，尖叫，临死前侧卧或四肢呈划水样； 一般3d 左右死亡，急性感染病例存活后会留下后遗症，即母猪流产，公猪跛行，仔猪和育肥猪遗留呼吸道症状和神经症状；4.2.2 慢性型病例 消瘦虚弱，被毛粗乱无光； 咳嗽，呈腹式呼吸；关节肿大，生长不良； 严重时皮肤发红，耳朵发紫，直至衰竭而死亡。仔猪也可突然死亡。4.3 病理学诊断 Pathology diagnosis4.3.1 病理剖检诊断 表现浆液纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、脑膜炎和关节炎； 胸膜、肺脏表面、心包膜、心外膜和腹膜及肝肠等器官表面附有黄白色纤维素性假膜或绒毛；胸腔、心包腔和腹腔内初期有大量的淡红色液体，随后变为混浊含有纤维素性凝块的渗出液； 病程较长病例，肺脏表面附有的薄层纤维素性假膜或绒毛可与胸壁、心包粘连；肺脏淤血水肿，有暗红或灰红色实变病灶或肉样变；心包膜与心外膜粘连，心外膜附有厚层纤维素性假膜或绒毛，形成“绒毛心”；心外膜粗糙不平，淤血和出血，心肌因变性可见灰白色斑纹；肝肾表面可见灰白色大小不等的炎性病灶。 关节表现浆液纤维素性或纤维素性化脓性炎症，关节囊肿胀，关节面上附有蛋花样纤维素性绒毛或凝块；关节腔内滑液增多，初期为清亮的浆液，逐渐混浊呈黄白色或黄绿色并含有纤维素性凝块的渗出液； 脑表现纤维素性化脓性脑膜脑炎；脑软膜混浊增厚，充血、水肿和出血，脑脊液混浊增多；脑回肿胀扁平； 全身淋巴结肿大，特别是腹股沟淋巴结肿胀明显；淋巴结表面和切面红白相间，切面隆突、湿润多汁。4.3.2病理组织学诊断 多发性纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，纤维素性浆膜炎以胸膜炎、心包炎、腹膜炎为主； 淋巴结和脾脏表现为纤维素性坏死性出血性炎症； 肺、心、肝、脑各器官表现为以纤维素和单核细胞渗出为主要特征的间质性炎症，肾脏呈现间质性出血性炎症变化。4.4 病原学诊断 Etiological diagnosis4.4.1 细菌学诊断 具体方法按细菌学检验常规方法进行，包括直接涂片染色镜检、分离培养和形态观察、生化试验和动物实验。 涂片镜检 无菌操作采取病猪的呼吸道分泌物、胸腹腔或心包腔积液、脑脊液，应用革兰氏染色法染色，显微镜观察；副猪嗜血杆菌为革兰氏阴性多形态细菌，可呈短小杆菌、球形、短链或丝状，大小不等，无鞭毛，多数无荚膜，但新分离的强毒株可带有荚膜，不形成芽孢；美兰染色呈两极浓染的球杆状； 分离培养和形态观察 将疑似副猪嗜血杆菌病猪的心脏血液、心包液、胸腔积液、脑脊液和关节液划线接种于含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dnucleotide nad，NAD) 的胰蛋白大豆琼脂（Tryptose Soya Agar，TSA）培养基上，或淋巴结、肺脏、心脏、肝脏或脑组织接种于含 NAD 的胰蛋白大豆肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB）培养基。在37，体积分数为5 %的 CO2 培养箱中培养24h48h，观察细菌生长情况。挑取单菌落革兰氏染色镜检，挑取疑似菌落在普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基、巧克力培养基和含V因子的LB (Luria-Bertani，LB)培养基进行鉴别培养。在TSA和TSB培养基上可见圆形、灰白色半透明菌落；革兰氏染色大部分可见革兰氏阴性短小杆菌，无芽孢，美兰染色呈两极浓染的球杆状；在巧克力培养基和含V因子LB培养基上有露珠状的白色透明或半透明的菌落，边缘整齐、光滑，圆形隆起。在普通营养琼脂培养基和麦康凯培养基上不生长。卫星试验 挑取纯培养细菌接种于鲜血琼脂培养基上，并将金黄色葡萄球菌平行划线接种在该培养基上，37 培养 24h-48 h，观察有无“卫星现象”及溶血现象。本菌无溶血现象，在金黄色葡萄球菌划线周围呈现出明显的“卫星现象”生长，即离线近的地方有许多较大的针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长，距离划线处越远菌落越小越少；未接种金黄色葡萄球菌的部分则生长不好， 菌落稀少，不见该现象发生。 生化试验 挑取纯培养物单菌落接种于含无菌的NAD（1g/ml）的葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、木糖、山梨醇、甘露醇、H2S、脲酶、硝酸盐及吲哚生化培养基中，置于体积分数为5 %的 CO2二氧化碳培养箱 37 培养24 h-48 h，观察菌株的生化反应结果。同时进行氧化酶试验和接触酶试验。副猪嗜血杆菌血清 4 型标准菌株的生化特性为脲酶、吲哚、硫化氢、氧化酶反应呈阴性，硝酸盐还原、接触酶试验阳性，发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖，不发酵乳糖、甘露糖和木糖。4.4.2 PCR检测 采集被检猪血液，或心包液、胸腹腔渗出液、心血、肝脏、脾脏和淋巴结等病料经TSA培养基培养的菌落作为被检病料；根据 GenBank中HPS标准株序列(CP001321.1)，参照Oliveira S等设计发表的HPS 16S rRNA基因引物（北京中美泰和生物有限公司合成）。上游引物 5 - GTGATGAGGAAGGGTGGTGT- 3， 下游引物 5- GGCTTCGTCACCCTCTGT - 3 。预期扩增片段大小约为 822 bp。 细菌 DNA的提取 吸取被检猪血液50L或挑取培养的单菌落置于1.5 mL离心管内， 然后加50 L双蒸水并混匀；95沸水浴10 min后，-20冰浴10 min，4、12 000 r/mi n离心 2 m in ，取上清液于新EP管 4 保存，备用。细菌 DNA的提取也可以使用细菌基因组DNA提取试剂盒按说明书要求操作。 PCR反应体系 50L反应体系: 10PCR缓冲液5 L，2.5mmol/LdNTP 4 L，25mmol/L MgCl2 2 L，上、下游引物各1 L ，模板4 L， Taq DNA 聚合酶1 L， ddH2O 补至50 L。 反应条件：94预变性4 m i n，94 变性30 s ， 58 退火30 s ，72 延伸45 s，共 30个循环，72 再延伸 10 m i n。PCR扩增后的产物在1琼脂糖凝胶电泳，可观察到大小片段在822bp的DNA片段。PCR电泳产物于 4 保存。1、2、4. HPS阳性病料；3. HPS标准株；5.阴性对照图2 HPS的PCR扩增电泳（图片1来源：余小利，钟苑辉，苏丹萍，等.副猪嗜血杆菌的分离及PCR鉴定J. 黑龙江畜牧兽医(科技版)，2010.12:126-127. 图片2来源：辽宁医学院畜牧兽医研究所兽医研究室，周铁忠，高慎阳，迟阳，等）4.5 结果判定4.5.1疑似副猪嗜血杆菌病符合副猪嗜血杆菌病流行病学特点、临床症状和病理变化。 4.5.2确诊被检猪符合结果判定4.5.1，且符合病原学诊断4.4.1、4.4.2之一的，确诊为副猪嗜血杆菌病。5 防治5.1 预防措施 Prevention measures 5.1.1 严格执行生物安全管理措施生物安全管理措施应按GB/T17823-2009 （集约化猪场防疫基本要求）和GB 16548-2006 （病害动物和病害动物产品生物安全处理规程）的要求进行。5.1.2 科学饲养管理按要求控制好猪场环境条件，包括合理的温度、湿度和猪舍内清新空气的控制，合理分群和密度；提供全价营养和清洁饮水，防止或减少应激因素的发生。饲养管理应参照无公害食品生猪饲养管理准则（NY 5033-2001）、无公害食品畜禽饲料和饲料添加剂使用准则（NY 5032-2006）的规定。5.1.3 免疫接种副猪嗜血杆菌病常发地区可接种血清型相对应的多价油乳剂灭活苗。免疫方法一般采用颈部肌肉注射。按瓶签注明头份，不论猪只大小，每次均肌肉注射1头份，2ml/头份。推荐免疫程序为：种公猪每半年接种一次；后备母猪在产前8-9周首免，3周后二免，以后每胎产前4-5周免疫一次；仔猪在2周龄首免，3周龄后二免。5.2 治疗措施 Treatment measures5.2.1 发生本病时，要隔离病猪，并对猪舍、环境、用具等严格消毒处理，死亡病猪和污染物进行无害化处理；要及早治疗并进行全群连续投药，治愈后，要定期监测，根据需要预防投药，防止复发。消毒方法可参考畜禽养殖场消毒技术规范（DB31/T432-2009），治疗用药应符合无公害食品畜禽饲养兽药使用准则（NY