霉菌的形态观察 山东大学.doc

山东大学实验报告 2011年 11 月 23 日姓名 * 班级 * 学号 * 组别 * 科目 微生物学实验 题目 霉菌的形态观察 同组者：*霉菌的形态观察【实验目的】1. 掌握霉菌的形态观察法小室培养法；2. 了解四类常见的霉菌（青霉，毛霉，根霉，曲霉）的形态。【实验原理】A、霉菌霉菌可产生复杂分枝的菌丝体，其菌丝分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 310m ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。本实验采用毛霉、青霉，曲霉，根霉四种常见的霉菌作为菌种进行观察。图 1毛霉的基本形态毛霉又叫黑霉、长毛霉。接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科真菌中的一个大属。以孢囊孢子和接合孢子繁殖。菌丝无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝。不产生定形菌落。菌丝体上直接生出单生、总状分枝或假轴状分枝的孢囊梗。各分枝顶端着生球形孢子囊，内有形状各异的囊轴，但无囊托。囊内产大量球形、椭圆形、壁薄、光滑的孢囊孢子。孢子成熟后孢子囊即破裂并释放孢子。有性生殖借异宗配合或同宗配合，形成一个接合孢子。（如右图所示）图2青霉的基本形态青霉菌属多细胞，营养菌丝体无色、淡色或具鲜明颜色。菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，光滑或粗糙。基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，称为帚状体。分生孢子球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分生长时呈蓝绿色。有少数种产生闭囊壳，内形成子囊和子囊孢子，亦有少数菌种产生菌核。（如右图所示）图3根霉的基本形态根霉的菌丝无隔膜、有分枝和假根，营养菌丝体上产生匍匐枝，匍匐枝的节间形成特有的假根，从假根处向上丛生直立、不分枝的孢囊梗，顶端膨大形成圆形的孢子囊，囊内产生孢囊孢子。孢子囊内囊轴明显，球形或近球形，囊轴基部与梗相连处有囊托。根霉的孢子可以在固体培养基内保存，能长期保持生活力。此外有性生殖时还可以产生接合孢子囊，无性生殖时产生芽孢子。（如右图所示）图4曲霉的基本形态曲霉菌丝有隔膜，为多细胞霉菌。在幼小而活力旺盛时，菌丝体产生大量的分生孢子梗。分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，一般呈球形。项囊表面长满一层或两层辐射状小梗(初生小梗与次生小梗)。最上层小梗瓶状，顶端着生成串的球形分生孢子。以上几部分结构合称为孢子穗。孢子呈绿、黄、橙、褐、黑等颜色。这些都是菌种鉴定的依据。分生孢子梗生于足细胞上，并通过足细胞与营养菌丝相连。曲霉孢子穗的形态，包括分生孢子梗的长度、顶囊的形状、小梗着生是单轮还是双轮，分生孢子的形状、大小、表面结构及颜色等，都是菌种鉴定的依据。（如右图所示）B、小室培养法图 5边缘少量接种观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本次实验采用载玻片培养观察法（小室培养法）。图 6小室培养法图示用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，沿琼脂边缘接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置于显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物。（如右图所示）【实验器材】1、 菌种：曲霉（Aspergillus sp.），青霉（Penicillium sp.），毛霉（ Mucor sp. ）和根霉（Rhizopus sp.）培养48h的马铃薯琼脂（PDA）斜面培养物。2、 培养基及试剂：马铃薯琼脂（PDA），20%甘油（无菌），乙醇。3、 仪器及其它用品：无菌操作台，解剖刀，镊子，无菌吸管，U型玻璃棒，普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿等【操作步骤】A. 实验流程图B. 详细步骤1. 培养基的配制马铃薯培养基（PDA）配方马铃薯200g蔗糖（或葡萄糖）20g琼脂1520g水1000mLpH自然按如上所示配方称取PDA各组分，先将马铃薯去皮，切成小块称取30g煮沸半小时，然后先用1层纱布滤去未溶解的固体，再用6层纱布过滤，将滤液体积用无菌水调至150mL，然后再加入糖及琼脂，加塞后用牛皮纸包好，准备灭菌。2. 培养基及装置的灭菌a) 灭菌准备制作八个平皿，在每个平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一U形玻棒，其上放一洁净载玻片和四块盖玻片，盖上皿盖、再与两个空平皿一起用牛皮纸包好；在100mL锥形瓶中用甘油配制20%的甘油，加塞包好；最后取10mL移液管两支用牛皮纸包好。b) 灭菌将上述用牛皮纸包好的仪器与试剂连同配好的PDA培养基一并放入灭菌锅中110灭菌30min（由于培养基中有葡萄糖，为防止由于高温而使糖发生糊化而变质，灭菌温度不宜过高）。3. 制作琼脂薄片将制作琼脂薄片与接种所需的培养基，仪器，以及菌种放入无菌操作台，打开紫外线照约5min，然后打开照明与风，使无菌风吹入操作台，开始实验操作。分别取已灭菌并溶化冷却至约50的马铃薯琼脂培养基67mL 注入两个灭菌空平皿中，使之凝固成薄层。在两个凝固后的平板背部用记号笔画下约11.2cm11.2cm的方格，通过无菌操作，用解剖刀沿画下的方格线将其切成方形的琼脂块。（注：解剖刀使用前应先在酒精中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，冷却后再进行切割操作）4. 接种在无菌操作台上，先用镊子将载玻片放于U型玻璃管上，然后用解剖刀取一小块儿琼脂块，置于载玻片上（注意：镊子与解剖刀每次使用前都应先在酒精中浸泡，灼烧冷却后再进行下一步的操作），用接种环分别从斜面培养物上挑取很少量的4种菌的孢子，分别接种于培养小室中琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。最后用移液管在培养小室中的圆滤纸上加3ml 灭菌的20 %的甘油（用于保持平皿内的湿度 ) ，盖上皿盖并贴标签，每一种菌接种两个小室。5. 恒温培养将接种后的平皿正置于28培养箱中恒温培养一周。6. 镜检在显微镜下直接观察小室培养后的载玻片，用低倍镜即可较为清晰的观察到霉菌的菌丝体及孢子，根据所学的四种菌的基本特征对四种菌进行观察比较与区分，必要时可以采用高倍镜对菌进行观察。【实验结果及分析】1. 四种霉菌的形态特征毛霉、根霉、青霉、曲霉的形态特征比较菌种菌丝孢子梗着生位置孢囊繁殖（孢子）根霉菌丝无隔着生于假根着生处孢子梗顶端膨大形成有性接合子无性孢子毛霉菌丝无隔孢子梗直接由菌丝生成（无假根）孢子梗顶端膨大形成（球形孢囊）透明、球状孢子曲霉菌丝有隔气丝分化成孢子梗，着生于足细胞上孢子梗顶端膨大形成孢囊表面可辐射生出一层或两层小梗，小梗上有一串串分生孢子。青霉菌丝有隔无假根孢子梗顶端不膨大（无孢囊）孢子丝，多次分支形成几轮对称或不对称的小梗，小梗顶端有孢子2. 四种霉菌的图示孢子梗假根孢囊匍匐菌丝图1根霉的形态（1010）图2毛霉的形态（1010）分支小梗隔 图4曲霉的形态（1010）图3青霉的形态（1010）图6 曲霉足细胞（1040）图5 曲霉孢囊（1040）足细胞孢子梗孢囊【思考题】黑