精子低温保存与精子功能.doc

精子低温保存与精子功能周俊彦 综述程怀瑾 审阅中国福利会国际和平妇幼保健院男性科(上海200030)自 50 年代美国和日本相继用低温保存的精液复温后作人工受精 , 并获得成功以来1 3 , 目前精 液低温保存在不育症的治疗 、生殖保险 、计划生育和优生等领域得到广泛开展 。精子功能是影响人工受精成功率的关键因素之一 ,而低温冻存及复温过程 中均会对精子的功能造成一定的损伤 ,为了尽可能 地减轻这种损伤 ,许多学者做了大量的研究 。现就 近年的研究和进展作一回顾 。钟后再浸没于液氮 ( - 196 ) 中的方法 ,亦获得了较好的冻存效果7 。 根据不同的方案可按实际情况选择不同的冻存方法及降温速率 。在以往文献回顾报道中 ,精液冷平衡的时间和温度对精子功能有一定影响 ,上述两 种方法的比较 ,在平均精子存活率和妊娠率上的报告亦不尽相同5 。目前缓冻法仍作为主要采用的方法 ,但在设备条件有限的情况下 ,速冻法也不失为 一种简便有效的措施 。2 . 玻璃化低温保存法玻璃化贮存 ,系指溶液 在降温过程中 ,相变后直接转变成非晶态 ( 玻璃态)的固态 。由于玻璃态分子间的关系和液态没有明显一 、精液低温冻存的基本原理及常用方法低温环境能抑制生物体新陈代谢过程中的各种生化活动 。根据 Arr heniu“s 温度对化学反应速度的 关系”的理论推测 ,在 - 196 下生物体可望保存几 个世纪4 。近代大量的研究事实也证明了这一点 。 虽然生物体能在低温下长期保存 ,但却极易在降温 、 复温过程中遭受损伤 。因此只有掌握了低温冻存及 损伤的原理 ,才能获得高质量的冻融复苏精子 。1 . 慢速冷却低温保存法 目前成功的精子低 温保存大多是采用慢速冷却法 。其原理是在精子冷 冻过程中 ,随着温度不断下降 ,细胞外液中的水分结 冰使溶液的浓度升高 ,细胞内的水分通过细胞膜渗 透至细胞外 ,造成自身不断的脱水皱缩 ,从而减少胞 内冰晶的形成 。然而高浓度的溶液长期作用将对细 胞产生致命的损害 ,因此除了选择最佳冷却速率 ,尚 须添加适宜的冷冻保护剂 。根据降温速率的不同 , 目前临床中常用的有缓冻法和速冻法两种 。缓冻法即将精液保护剂混合液缓慢降温至 24 ( 平均 0 . 60 . 8 / min) ,保持这一温度冷平 衡约 2060 分钟 ,再以 12 / min 的速率降至约- 30 , 再 以 8 10 / 分 钟 的 速 率 降 至 - 80 以下 ,然后直接浸泡于液氮 ( - 196 ) 中保存5 ,6 。 速冻法与缓冻法的区别在于降温前期不做冷平衡 ,利用液氮蒸汽直接降温 ,一般以 24 / 分钟的速率降温至 - 30 后 ,再按缓冻法的步骤冻存5 ,6 。 上海仁济医院采用静置于液氮液面上 ( - 65 ) 5 分变化 ,从而可避免冰晶形成过程中对细胞的损伤 。但是实现溶液玻璃化必须具备两个条件 : 一是极大地提高冷却速率 ;二是增加溶液的浓度 。因此 ,目前 研究玻璃化贮存的重点仍是 : 一寻求容易实现玻璃化而又对细胞损害较小的保护剂 ; 二是设法提高冷却速率6 ,8。随着现代物理化学技术的进展 , 玻璃化贮存也许会成为低温保存的首选方案 。3 . 复温方法 与冷却过程相比 ,复温过程的研 究显得薄弱得多 。在理论上严格地讲 ,正确的复温 过程应是冷却过程的函数 ,应针对不同的冷却过程 , 选择不同的复温过程 ,但目前的研究还极少 。由于 融化过程温度的控制要比冻结过程困难得多 ,为减 轻复温过程中冰晶及渗透肿胀对精子的损害 ,根据 实验研究认为 ,在绝对值上 ,复温速率一般要比冷却 速率高得多9 。目前临床上常用的精子复温方法多采用 37 水浴复温和室温复温两种 。一般认为 水浴温度在 2640 范围内 ,对精子的影响没有区别8。刘金刚比较了在 37 、15 水浴和冰水及室温空气中自然复温 4 种方法 ,结果显示复温后精子存活率均相似5 。4 . 低温保护剂 低温保护剂的主要作用是稀 释溶液中的溶质浓度 ,减少冷冻和解冻过程中细胞 的渗透性损伤和减少冰晶的形成 ,根据其特性 ,一般综述又分为渗透性保护剂 (如甘油等) 和非渗透性保护剂(如单糖 ,卵黄等) 。目前常用的精液冷冻保护剂多 采用 T ESTris卵黄甘油复合剂和葡萄糖枸橼酸盐 卵黄甘油复合剂等配方 。虽然甘油作为渗透性保 护剂获得了较好的冻存效果 ,但其对精子的毒性作试验中除了少精症组 ,冷冻和新鲜精子的穿透率无明显区别 ,顶体反应 (A R test ) 试验中两组间虽有区 别 ,但不显著 ,因此认为冷冻精子的受精能力并无下降18,对冷冻精子顶体的研究也提示了冷冻保存对顶体造成损伤但其精子仍能保持活性并能和去透明带仓鼠卵融合19 。由于顶体内能够溶解透明带的 顶体素可能与顶体内膜及中纬段有关20 ,冷冻复温 后肿胀的顶体 ,即使顶体外膜破损 ,只要顶体内膜 和中纬段未丢失 ,顶体素的活性就可能未受影响 ,因 而精子的穿透能力也可能不受影响 。3 . 对精子遗传性状的影响 目前对冷冻保存 与精子染色体自然畸变率的研究报道不多 ,且存在 一些争论 。在使用 T ESTris 卵黄缓冲液作为保护 剂时 , Benet 等 认 为 精 子 染 色 体 的 畸 变 率 不 会 增用也被人们所证实10。至今尚未发现可用于取代甘油的有效物质11 ,甘油的终浓度一般控制在 7 %10 % 。一般认为卵黄除了提高细胞外渗透压的 作用 ,由于其含有卵磷脂 ,尚能稳定精子的细胞膜 , 防止顶体外膜破裂 。近期的研究证实 ,在非冷冻条件下 ,卵黄能促进精子与卵透明带的结合 ,从而使顶 体反应率增高12 ,13 。然而也有人认为卵黄中的卵 磷脂和小分子物质对精子有损伤作用 ,可使复温后 的精子存活 率 下 降14 , 现 常 用 的 卵 黄 终 浓 度 多 为10 % 。葡萄糖与渗透压的调节有关 。枸橼酸盐则被认为对精液的 p H 变化起缓冲作用 。J edrzejczak 等比较了 9 种冷冻保护剂对精子学参数和受精能力 的影响后认为不含甘油的 T ESTris卵黄缓冲液和 单纯甘油明显低于其它复合保护剂 ,但也对 T ES T 卵黄甘油缓冲系统的优势提出了异议15 。因此 ,冷 冻保护剂的机理及有效替代物的选择仍有待进一步 研究 。高21 23,但 Martin 等则认为会增加其自然畸变率 ,且从结构和数目上分别统计时 ,发现结构畸变加大 ,而数目不变24 ,25。从 1973 年对冻存精液人工授精所出生的婴儿统计中 ,其畸产率 1 . 2 %和自然流产率 8 . 7 % ,与正常人群的 3 %和 15 %相比 ,亦未说 明冷冻保存精子对子代的影响 。但由于缺乏大样本及长期的统计学调查 ,其风险率仍值得进一步研究 。三 、精子低温保存影响因素研究的新进展二 、低温保存对精子功能的影响Wat so n 通过以往的文献回顾了哺乳动物精子冷冻保存的新研究 ,总结了在精子冷冻和溶解后功 能评估方面的新进展及观念 。认为 : (1) 冷冻损伤的原因被重新考虑 ; (2) 涉及渗透压影响的新观念被提出 ; (3) 根据不同个体及同一个体不同次精液中精子 可冻性的差异 ,精子总体的异质性被讨论 ; ( 4) 根据 已发表的精子结构和功能试验的结果 ,测定冷冻和溶解精子的功能状态 ,从而测定冷冻保存精子的利 用价值 。并提出了新的研究途径来解决这些问题的1 . 对精子超微结构的影响在冷冻和复温过程中 ,冰晶的形成和冷冻保护剂的毒性作用均可造 成生物膜的结构和功能的改变 。根据观察发现 ,冷 冻复温后的精子外膜变薄 , 波浪状改变或破损 , 胞 浆 、顶体内和线粒体内透光度增加 ,顶体增宽 ,线粒 体外形变圆 ,轴丝增粗 ,提示细胞肿胀是形态改变的 主要征象16 。在 Mahadevan 的研究中 ,复温后细胞%17膜的超微结构完全正常的精子只占 8 . 8。一计划26般认为冷冻复温过程中造成细胞膜上膜蛋白的变性 ,细胞膜的通透性改变 , Na + K + 的泄漏降低了膜 的稳定性 ,细胞表面的电荷改变 。质膜和细胞内的酶活性降低 。线粒体膜破坏 ,氧化磷酸化解偶联 ,能 量代谢紊乱 ,减少了能量供应 。复温后大量的水分 进入细胞内 ,形成缺氧的微环境 ,最后导致生物膜的。CaO 对人类精子的高渗容受性进行了研究 ,证实了冷冻过程中细胞承受的高渗压力及解冻过程中 压力的释放都与冷冻损伤有关 ,解释了作为时间 、温度 、溶液类型和溶液浓度的功能与渗透容受性的关系 ,强调要确定最佳 的冷冻和解冻速率 ,以防止精 子的渗透损伤27 。Holt 通过克隆抗体处理和荧光法测定公羊精子头部 actin 的定位和分布 ,推论 actin 有助于精子 功能的稳定 ,提示 cyto skeletal 蛋白与保持精子浆膜 完整有关28 。破损6损 。2 . 对精子顶体功能及穿透率的影响 日本学 者比较了新鲜和冷冻精子的受精能力 ,发现在宫颈 粘液穿透试验中 , 冷冻精子仍有受精能力 , 在 SPA。从而表现出精子的活动率降低及功能受Wang 等 对 冷 冻 保 存 中 细 胞 所 产 生 的 活 性 氧( RO S) 进行了研究 ,发现精液冷冻时逐步降温可导 致精子细胞产生较多的 RO S ,特别是冷冻过程中被超过 0 . 5 106 的白细胞污染时 , RO S 会增多 。并提 出从精液样本中除去白细胞或冷冻前以抗氧化剂处 理能提高精子活力和功能29 。采用抗脂质过氧化 的改良保护剂发现能保护细胞膜结构稳定 ,精子超 微结构损伤程度明显减轻 ,活动精子及精子运动速度明显提高16 。Davis 等应用计算机辅助分析比较精子冻存前 后的精子学参数及穿透能力 ,根据多变量的逐步回 归的方法 ,成功地预测了精子冻存的效果 ,为冻存前 精 子 的 利 用 价 值 进 行 评 估 , 提 供 了 新 的 研 究 途567刘金刚 . 低温医学 . 北京 :人民卫生出版社 1993 :章崧英 . 实用低温医学. 北京 :科学出版社 1994 :郭忠伟 ,钱宪明等 . 不育精液冷冻及解冻后上游处理对 精子活率的影响 . 男性学杂志 1997 ;11 (4) :210华泽钊 ,任禾盛 . 低温生物医学技术 . 北京 : 科学出版社1994 :Ashwood Smit h M J and Farrant J . Low temperat ure p reservatio n in Medicine and Biology. Baltimoore : U niver2 sit y Par k Press 1980 :Fink R , Zech H. Effect of incubatio n time in deep f reezing human sperm. W ien Kl i n W ochensch r 1991 ;11 (4) :210Bwangw CO. Cryop reservatio n of boar semen : A literat ure review . A ct a V et S can d 1991 ;32 (4) :431J acobs B R , et al . Analysis of T ES T ( T ES and Tris) yol k buffer effect s o n human sperm. Fert il S teril 1995 ; 63 :1064Gamau R ,et al . The effect of egg yol k o n t he binding ca2 pacit y of human spermatozoa to zo na pellucida . Fert il S ter2 il 1994 ;62 :1221Kolossa M ,Seibert H. A chemically defined diluent for cry2 op reservatio n of bovin spermatozoa . A n d rologi a 1990 ; 22 (5) :445J edrzejczak P ,et al . Evaluatio n of sperm cryop rotective me2dia in respect to fertilizing capacit y tested in vit ro . A n2d rologi a 1996 ;28 (3) :175于德新 ,等 . 冷冻保存的人类精子超微结构变化. 男性学 杂志 1995 ;9 (3) :148Mahadevan M . Relatio nship fine st ruct ure of sperm head to fertilit y of f rozen human semen. Fert il S teril 1984 ; 41 (20) :287Yoshida H . Fertilizing capacit y of f resh and f rozen spermatozoa. N i p pon S ank a Fuji nk a Gakk ai z ass hi1991 ;43 (9) :1233Mclaughlin EA , et al . Effect s of cryop reservatio n o n t he human sperm acroso m and it s respo nse to A23187 . J Re2 p rod Fert il 1993 ;99 (1) :71Schill W. Ult rast ruct ure of human sperm acroso me and de2 terminatio n of acrosin activity under co nditio ns of semen p reservatio n. I nt J Fert il 1984 ;9 :217Benet J , et al . Chro moso mes abnormalities in human sper2matozoa af ter albumin or T ES T yol k capacitatio n. Hu mRep rod 1991 ;3 :369Trounso n A , et al . Fertilizatio n of mouse and human eggs by microinjectio n of single spermatozoa under t he zo na pel2 lucida . J Rep rod Fert il 1989 ;38 ( suppl) :145Brandriff B ,et al . Chro moso mes of human sperm : variabilli2t y amo ng normal individuals. Hu m Genet 1985 ;70 :1889101112径30 ,31。四 、复温后精液的处理对精子功能的影响13由于冷冻和复温过程中对精子细胞膜的损伤 ,以及冷冻保护剂的渗透性损伤机制 ,在复温后去除 或置换保护剂的方法不当 ,将引起精子的渗透性肿 胀 ,导致精子的功能下降甚至死亡 。近年国外对复温后精液处理的报告罕见 ,国内的研究报道曾对复 温后不同介质处理对精子功能的影响进行观察 ,结 果发现精子营养液可使复温后的精子在较长时间内保持良好的活动率 ,1640 培养液可明显提高复温精子对宫颈粘液的穿透力 ,而 M199 、Hams F10 和正 常精浆则无明显改善作用 , 增加 A TP 、肌酐对精子的功能未发现改善 ,但添加 12 mM 和 4 mM 的苯甲酸钠咖啡因却获得了良好的激活作用32 ,33 。复温 后通 过 上 游 处 理 收 集 高 活 力 精 子 也 有 成 功 的 报1415161718道7。目前这方面的研究尚有待于进一步观察 。19关键词 精子 精子库 低温冻存中图法分类号 R321 - 33 . 1精子功能20参考文献1Bunge R G ,et al . Clinical use of f rozen semen. Fert il S teril1954 ;5 :500Keetel W G ,et al . Report of p regnancies wit h f rozen semen in infertile couples. J A M A 1959 ;106 :102Sawada Y. St udies o n t he f reezep reservatio n of humanspermatozoa . J apan J of Fert il S teril 1959 ;4 :1华泽钊 . 生物材料的低温保存 . 科学 1987 ; 39 ( 1) : 3541 .21222342324Matin R H ,et al . Human sperm chro moso me co mplement saf ter microiniectio n of hamster eggs. J Rep rod Fert il1988 ;84 (2) :179Munne S ,Estop AM. Chromosome analysis of human spermatozoa stored in vitro. Hum Reprod 1993 ;8 (4) :581Wasto n PF. Recent develop ment s and co ncep t s in t he cryo2 p reservatio n of spermatozoa and t he assessment of t heir postt hawing f unctio n. Rep rod Fert il Dev 1995 ;7 (4) :871Gao D Y ,et al. Hyperosmotic tolerance of human spermatozoa : separate effect